Введение к работе
Актуальность исследования.
Метициллинрезистентные представители вида Staphylococcus aureus
(methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) были одновременно описаны Barber, M. и Jevons, M. в 1961 г, эти бактерии относятся к важнейшим возбудителям госпитальных, а в некоторых регионах и внебольничных инфекций. Так, в США от инфекций, вызываемых MRSA, ежегодно погибает около 20 000 человек (Boucher, H.W., 2008). В Европе ежегодно регистрируется около 200 тысяч случаев MRSA инфекций, из которых 7% заканчиваются летальным исходом (ECDC report 2007). Этиотропная терапия MRSA инфекций связана со значительными сложностями, поскольку устойчивость к метициллину является маркером устойчивости к подавляющему большинству бета-лактамных антибиотиков. Кроме этого, для MRSA характерна высокая частота ассоциированной устойчивости к антибиотикам других групп. В течение долгого времени средством выбора для лечения MRSA инфекций был ванкомицин, однако, с середины 90-х годов прошлого века наблюдают рост устойчивости к этому антибиотику (Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus – VISA, hetero - VISA и Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus – VRSA). Проблему лечения MRSA инфекций не решают и появившиеся в последние годы новые антибиотики. К таким препаратам, как: линезолид, даптомицин, тигециклин и цефтаролин, уже зафиксировано появление резистентности. Очевидно, что для обоснования эффективной этиотропной терапии и профилактики MRSA инфекций необходимы данные о динамике распространения и механизмах ассоциированной устойчивости этих бактерий к широкому кругу антибиотиков различных групп.
Степень разработанности темы.
Анализ структуры популяции MRSA, циркулирующих на Земном Шаре, выявляет ее выраженную клональность, при этом, в различные периоды времени, в различных географических регионах обнаруживают доминирование различных генетических линий. Детали механизмов формирования таких успешных генетических линий не установлены, однако ясно, что они основаны на эволюции основного (ядерного) генома бактерий и интенсивном обмене подвижными генетическими элементами. Важнейшим среди этих элементов является стафилококковая хромосомная mec – кассета (Staphylococcal Cassette Chromosome mec), в состав которой входит ген mecA, кодирующий измененный пенициллинсвязывающий белок (PBP2a), опосредующий устойчивость к бета-лактамам. В SCCmec также входят гены резистентности к другим антибиотикам.
На основании анализа «ядерного» генома методом мультилокусного сиквенс-типирования (multilocus sequence-typing – MLST) среди MRSA, циркулирующих на Земном Шаре, удается выделить 6 глобальных генетических линий (клональных комплексов Clonal complex, CC), среди которых описано 11 основных вариантов SCCmec и множество других подвижных генетических элементов (Holden, M., 2013; Chambers, H.F., 2010; Gomes, A.R., 2006).
До недавнего времени MRSA рассматривались как возбудители госпитальных инфекций (HA-MRSA, hospital-associated MRSA). Однако, с середины 90-х годов в ряде регионов (Северная Америка и Юго-Восточная Азия, Европа) отмечено появление и быстрое распространение новых генетических линий высоковирулентных MRSA, так называемых «внебольничных MRSA» (community-associated MRSA, CA-MRSA) (David, M.Z., 2010).
По мере возрастания количества известных детерминант вирулентности и антибиотикорезистентности, а также разнообразия их комбинаций, анализ популяционной структуры MRSA резко усложняется, что требует применения новых методических подходов, к которым, в первую очередь, следует отнести полногеномное секвенирование. Применение этого метода позволяет решать как локальные задачи по анализу вспышек госпитальных инфекций, так и выявлять глобальные эволюционные закономерности.
В последние годы предлагается объединять в одну группу, учитывая их общую функциональную направленность, факторы, защищающие бактерии от действия системы врожденного иммунитета хозяина. На сегодняшний день описано 38 таких факторов (McCarthy, A.J., 2013). В эту группу включают и факторы, входящие в состав комплекса IEC (Immune evasion cluster) кластер «ухода от иммунной защиты». В этот комплекс входят: стафилокиназа (sak), ингибитор системы комплемента (scn), ингибитор хемотаксиса лейкоцитов (chp), энтеротоксины А и Р (sea, sep). IEC классифицирован на A-G типы (van Wamel W.J., 2006).
В Российской Федерации проводились многоцентровые исследования, посвященные оценке чувствительности MRSA к ванкомицину и другим антибиотикам С.В. Сидоренко (1998), А.В. Дехнич (2002 и 2008). В работах Vorobieva, V. (2008), Afanasev, M.V. (2010), Yamamoto, T. (2012) показано, что на территории России распространены клоны ST8, ST239 (sequence type) и некоторые другие. Большой вклад в изучение молекулярной эпидемиологии MRSA в России внесли О.А. Дмитренко (2005 – 2006 и 2008), О.Е. Хохлова (2011), Романов А.В. (2012), Гончаров А.Е. (2011-2012). Первое полногеномное секвенирование одного из эпидемических клонов MRSA было проведено исследователями из Владивостока совместно с японскими коллегами (Yamamoto, T., 2012).
В то же время, в России такие вопросы, как распространение среди MRSA резистентности к новым антибиотикам, распространенность отдельных типов кассет SCCmec, детерминант вирулентности, комплекса IEC, а также связь доминирующей в России генетической линии СС8 с глобально циркулирующими линиями остаются неясными.
Цель исследования: Определить фенотипические и генотипические факторы
метициллинрезистентных представителей вида Staphylococcus aureus, влияющие на эффективность антибактериальной терапии
Задачи исследования
-
Провести сравнительную оценку микробиологической активности известных, новых и перспективных препаратов в отношении MRSA;
-
Охарактеризовать механизмы резистентности MRSA к аминогликозидам, тетрациклинам, макролидам/линкозамидам, фениколам;
-
Провести молекулярное типирование ядерного генома MRSA (по схеме MLST), регуляторных элементов (agr), а также подвижных генетических элементов (SCCmec и IEC), выявить доминирующие генетические линии;
-
Провести полногеномное секвенирование типичного представителя доминирующего клона и дать сравнительную оценку генома;
-
Выявить особенности ассоциированной антибиотикорезистентности в зависимости от генотипа MRSA;
-
Провести комплексный анализ фенотипических и генотипических свойств MRSA и определить антибиотики, наиболее перспективные для лечения стафилококковых инфекций.
Научная новизна. Впервые проведено полногеномное секвенирование доминирующего Российского клона ST8. Установлено, что изолят SA0077 имеет высокую гомологию с геномами 8 клонального комплекса, характеризуется наличием кассеты SCCmec IVс, тремя островками патогенности, двумя интактными профагами и тремя плазмидами. Были обнаружены и аннотированы все детерминанты резистентности и вирулентности.
Проведена оценка микробиологической активности ванкомицина у MRSA, циркулирующих в Российской Федерации. Выявлены изоляты со сниженной чувствительностью к гликопептидам. Проведена оценка активности новых препаратов в отношении MRSA: даптомицина, линезолида, тигециклина, цефтаролина.
Установлено, что в структуре популяции доминирующими клонами являются госпитальные HA-MRSA (hospital acquired MRSA), относящиеся к глобально распространенным линиям ST8 и ST239. Также выявлен, не описываемый ранее в России, клон ST228. Кассеты SCCmec представлены у MRSA пятью типами (SCCmec I – SCCmec V) и 16 подтипами, но наиболее часто встречающийся тип - SCCmec IVc. Установлено, что MRSA с разными SCCmec имеют различный уровень антибиотикорезистентности, а также отличаются по спектру ассоциированной устойчивости.
Подавляющее большинство изолятов (70%) имело D – тип строения комплекса «ухода от иммунной защиты» (IEC), включающий энтеротоксин А (sea), стафилокиназу (sak), ингибитор системы комплемента (scn).
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные о микробиологической оценке активности как известных, так и новых препаратов могут быть использованы для оптимизации эмпирической и целенаправленной антибиотикотерапии стафилококковых инфекций. Результаты генотипирования имеют эпидемиологическое значение и могут быть использованы для мониторинга распространения MRSA на территории России, а также для разработки мер по сдерживанию и своевременному выявлению новых эпидемических линий. Использованные в работе алгоритмы ПЦР типирования: определение SCCmec, детерминант резистентности и вирулентности могут быть использованы в ПЦР - лабораториях для быстрой детекции антибиотикорезистентности и для мониторинга локальной эпидемиологии MRSA инфекций.
Методология и методы исследования. Работа выполнена на основе многоцентрового микробиологического исследования клинических изолятов MRSA. В основе фенотипического анализа было определение активности антибиотиков in vitro в отношении MRSA. Из генотипических методов использованы ПЦР-типирование, секвенирование и полногеномное секвенирование. Полученные данные обработаны методами описательной статистики.
Положения, выносимые на защиту
-
У 30% MRSA выявлен критический уровень чувствительности к ванкомицину(2 мкг/мл). Наибольшей активностью в отношении MRSA, циркулирующих на территории РФ обладают антибиотики – линезолид, тигециклин, даптомицин, цефтаролин, фузидиевая кислота, мупироцин и ко-тримоксазол.
-
В популяции MRSA, циркулирующих на территории РФ, выявлены три генетические линии (ST8, ST239 и ST228), что позволяет охарактеризовать указанную популяцию, как высоко клональную. Доминирующая на территории РФ генетическая линия MRSA (ST8) относится к 8-му клональному комплексу и имеет генотипические черты HA-MRSA.
-
Изоляты, относящиеся к ST228, ST239, и несущие кассеты SCCmec I-III типов проявляют наибольший уровень ассоциированной устойчивости к антибиотикам различных групп. Выявлена гетерогенность ассоциированного резистома MRSA.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов определяется репрезентативным объемом выборки изолятов MRSA. Исследования антибиотикочувствительности проведены в соответствии с международными рекомендациями и с использованием контрольных штаммов. Выводы и рекомендации, сформулированные в работе, основаны на полученных результатах исследования.
Диссертационное исследование было поддержано грантом комитета по науке и высшей школы правительства Санкт-Петербурга в рамках выигранного конкурса на предоставление субсидии молодым ученым (Диплом серия ПСП №12453 от 20.09.2012).
Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях и научных форумах: 52 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (52nd ICAAC), Poster C2-1385, (США, 2012); Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «XV Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «XVI Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2013); XVII Всероссийская научно-практическая конференция "Интеграция в лабораторной медицине" (Москва, 2012); Региональная Научно-практическая конференция "Актуальные вопросы клинической микробиологии" (Челябинск, 2012); Городской междисциплинарный семинар клинических фармакологов и микробиологов «Человек-микроб-антибиотик» ФГБУ «НИИДИ ФМБА России» (Санкт-Петербург, 2012); Ежегодный научно-практический семинар «Секвенирование нового поколения 454: от уникальных исследований к повседневной практике» (Москва, 2013); Итоговая XXXV научно-практическая конференция ФГБУ «НИИДИ ФМБА России» (Санкт-Петербург, 2013).
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась на Ученом совете ФГБУ «НИИДИ ФМБА России» (протокол № 7 от «24» сентября 2013 г.), председатель совета – академик РАМН, доктор медицинских наук профессор Лобзин Юрий Владимирович, секретарь – кандидат медицинских наук, доцент Волжанин Валерий Михайлович.
По результатам исследований опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов диссертационного исследования.
Личное участие автора в получении результатов. Все этапы экспериментальной части диссертационной работы, а также литературный обзор выполнены самостоятельно. Отдельные этапы работы были проведены в сотрудничестве с сотрудниками ФГБУ «НИИ ФХМ ФМБА России», Москва и «НИИ МБ им. В.А. Энгельгардта РАН» (ЦКП «Геном»), Москва.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, 4 глав, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы и приложений. Библиографический список литературы включает 242 источников литературы, в том числе 20 - отечественных и 222 иностранных. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 30 рисунками.
