Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава І. ТЕШОФШИЯ И ОСОБЕННОСТИ ТЕРМОФИЛЫЖ.
СП0Р00ЕРАЗУЩИХ БАКТЕРИЙ 9
-
Систематическое положение термофильных спорообразующих бактерий 10
-
Структурная организация и макромолекулы термофильных спорообразующих бактерий 12
-
Физиологические особенности термофильных споро-образующих бактерий 17
-
Биосинтез л-амилазы У термофильных спорообразующих бактерий 19
-
Фаги термофильных спорообразующих бактерий 23
Глава П. СЕЛЕКЦИЯ ШШРООРГАНИШОВ-ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ 27
-
Естественная изменчивость микроорганизмов 27
-
Изменчивость микроорганизмов, индуцированная мутагенами физической и химической природы 31
-
Морфологические и биохимические изменения, возникающие под действием мутагенных факторов 32
-
Механизм повреждающего действия мутагенных факторов и механизмы восстановления первичных повреждений 35
-
Механизм становления мутаций 41
2.3. Ступенчатый отбор продуцентов биологически
активных веществ 43
-
Выбор эффективного мутагена и оптимальной дозы.. 44
-
Экспресс-методы отбора некоторых продуцентов ферментов 46
Стр.
Глава Ш. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА И АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ 49
ЭКСПЕРШЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава ІУ. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДО ИССЛЕДОВАНИЯ 57
-
Продуцент ei-амилазы и условия его культивирования 57
-
Методы исследования 58
Глава У. СЕЛЕКЦИЯ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ BACILLUS
DIASTATICUS, ОБРАЗУЮЩЕЙ ct-АМИЛАЗУ 70
-
Естественная изменчивость Вас. diastaticus по биосинтезу ^-амилазы 70
-
Изменчивость Вас. diastaticus по биосинтезу <з6-амилазы, индуцированная мутагенными факторами 74
5.2.1. Изменчивость Вас. diastaticus по биосинтезу
об-амилазы, индуцированная УФ-лучами 76
5.2.2. Изменчивость Bacillus diastaticus по биосинтезу
*-амилазы, индуцированная новоэмбихином 80
5.2.3. Изменчивость мутанта Bacillus diastaticus НЭ 2
по амилолитической активности, индуцированная
нитроз огуанидином 82
5.3. Отбор мутантов Bacillus diastaticus, полученных под
действием мутагенов, и изучение их стабильности
в пассажах 84
Глава УІ. ФИЗД0Л0Г0-ЕИ0ХИМИЧЕС1ШЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ
ШТАММОВ BACILLUS DIASTATICUS 93
6.1. Культуральные признаки 93
-
Температурные границы роста 93
-
Потребление углеводов и простых спиртов, рост
на некоторых средах 93
6.1.3. Генотипическая характеристика 94
-
Потребности в факторах роста 96
-
Биохимические особенности полученных штаммов... 97
_ 4 -
Стр.
-
Ультраструктура клеток 106
-
Лизогенность термофильной бактерии Bacillus diastaticus 109
Глава УЛ. БИОСИНТЕЗ ^-АМИЛАЗЫ У МУТАНТОВ ТЕРМОФИЛЬНОЙ
БАКТЕРИИ BACILLUS DIASTATICUS И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ.. 117
7.1. Влияние источников углерода на биосинтез
cL-амилазы и накопление биомассы 117
7.2. Влияние источников азота на биосинтезу-амилазы
и накопление биомассы 120
-
Влияние факторов роста на биосинтез об-амилазы активными штаммами Bacillus diastaticus 128
-
Влияние температуры выращивания на биосинтез
^-амилазы мутантами Bacillus diastaticus 131
-
Динамика биосинтеза«^-амилазы активными штаммами Baciirus diastaticus 133
-
Регуляция синтеза вб-амилазы у мутантов термофильной бактерии Bacillus diastaticus 137
-
Катаболитная репрессия синтеза ^-амилазы 137
-
Индукция синтеза амилазы 139
-
Оптимизация сред для штаммов УФ 1-25.21 и
НЭНГ 6-10.8 как один из способов регуляции био-
синтезагС-амилазы 144
7.7. Хранение термофильной бактерии Bacillus di
astaticus и ее мутантов 152
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 156
ВЫВОДЫ 169
ЛИТЕРАТУРА 171
ПРИЛОЖЕНИЕ
Введение к работе
В нашей стране, как и во всем мире, с каждым годом растет производство ферментных препаратов, синтезируемых микроорганизмами (Калунянц, 1982; Складнев, 1982; Aimstrup, 1981; Ducroo, 1982). Применение ферментных препаратов в пищевой, легкой, химической и других отраслях промышленности обеспечивает значительное ускорение технологических процессов, улучшает качество продуктов, увеличивает выход готовой продукции (ІВоджюс и др., 1980; Eveleigh, 1981; Carr, 1982). Все большее практическое применение находят ферменты
В сельском ХОЗЯЙСТве И В Медицине (Селезнева, 1977; Aharonowitz et al., 1981).
С момента создания в стране в 1968 г. по решению ХШ съезда КПСС микробиологической промышленности не снимается задача получения высокоактивных штаммов микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ с помощью современных методов генетики и селекции. Об этом записано в решениях ХКУ и ХШ съездов КПСС.
Как известно, подавляющее большинство микроорганизмов - продуцентов ферментов, применяемых в промышленности, являются мезо-фильными формами. Тогда как термофильные организмы (бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, растущие при 50-60) как продуценты ферментов и особенно экзоферментов: амилаз, протеаз, гемицеллюлаз и литических ферментов представляют несомненный интерес. Такие микроорганизмы обладают высокой скоростью роста клеток и ускоренным биосинтезом ферментов. Высокие температуры выращивания предохраняют эти организмы от заражения посторонней микрофлорой. Ферменты термофилов обладают более высоким температурным оптимумом действия на субстрат и термостабильностью, что является ценным качеством для многих технологических процессов (Имшенецкий, 1943, 1944; Логинова и др., 1971, 19736; Кутузова, Ї982; Daniel, 1981).
В последнее время в СССР и за рубежом уделяется большое внимание изучению термофильных микроорганизмов и их ферментов (Выборных, 1975; Закиров, 1983; Свистова, 1983; Щшлина, 1983; Атеїишсеп, 1976, 1978; Buonocore, 1976; Klaushofer, 1981; Johri, 1982; Uchino, 1982; Suzuki, 1983). Важно, однако, не только выделение термофильных продуцентов из природных источников, но и получение у таких организмов высокоактивных мутантов. Число работ в этом направлении невелико (Гендина и др., 1974а; Овчинникова, 1974; Rowe, 1973; Reizer, 1974; Cheil, 1975; Hartley, 1983). Поэтому актуальным является получение у термофилов штаммов с повышенным биосинтезом ферментов путем селекции с применением мутагенов и изучение физиологии полученных форм.
К моменту начала настоящей работы о термофильной бактерии Bacillus diastaticus было известно, что она выделена и описана А.А.Имшенецким с сотрудниками в 1942 г. Бактерия имеет температурный оптимум роста 60 и образует фермент об-амилазу. Фермент вас diastaticus - термостабильный, относящийся к декстринирующим амилазам, расщепляет крахмал до Cjq-Cjq остатков в интервале температур 50-95 с оптимумом 75-80. Фермент активен при рН 4,6-7,9 и имеет оптимум рН 5,8 (Шшенецкий, 1942, 1944; Кислухина, 1966а, 1968). о(.-Амилаза Вас. diastaticus была рекомендована для применения в текстильной и спиртовой промышленности (Имшенецкий, 1943; Улезло,1961; Максимова, 1973). Однако до последнего времени эта бактериальная культура в промышленных масштабах не применялась.
Настоящая работа посвящена получению под действием мутагенов штаммов термофильной бактерии вас. diastaticus с повышенным уровнем синтеза oL-амилазы и сравнительному изучению физиолого-биохими-ческих особенностей этих штаммов.
Задачи исследования были следующие:
I. Отобрать наиболее активный штамм в результате изучения естественной ИЗМеНЧИВОСТИ Вас. diastaticus ПО бИОСИНТвЗу оС-ЭМИ- лазы.
Методом ступенчатой селекции активного штамма с применение ем мутагенов физической и химической природы получить мутанты Вас. diastaticus с повышенным уровнем синтеза сС-амилазы.
Провести сравнительное изучение физиолого-биохимических особенностей штаммов с разным уровнем синтеза ^с-амилазы.
Изучить условия регуляции биосинтеза фермента факторами внешней среды у активных мутантов.
Научная новизна работы заключается в том, что показана возможность получения у термофильной бактерии вас. diastaticus под действием мутагенных факторов мутантов, которые различаются по способности образовывать фермент еО-амилазу. Впервые детально изучены морфология, ультраструктура и физиолого-биохимические особенности высоко- и низкоактивных мутантов вас. diastaticus. Подробно изучен комплекс гидролитических ферментов у этих штаммов. Изучена регуляция биосинтеза в(*-амилазы у высоко- и низкоактивных мутантов с помощью индуктора метил-^,Б-глюкозида. Впервые обнаружена и экспериментально подтверждена лизогенность всех изучаемых штаммов Вас. diastaticus. Лизогения термофильной бактерии представляет определенный теоретический интерес в плане изучения взаимодействия клетки - хозяина и фага, затрагивающего изменение ряда фенотипических признаков.
Практическая ценность исследований состоит в том, что в результате ступенчатой селекции с применением мутагенов получены мутанты термофильной бактерии вас. diastaticus, превышающие исходную культуру по биосинтезу с^-амилазы на 52-6С$. Оптимизация состава сред позволила увеличить амилолитическую активность наиболее продуктивных мутантов в 2,5-3 раза. Проведенные в полупроизводственных условиях испытания мутанта НЭНГ 6-10.8 подтвердили возможность полу- - 8 -чения активного препарата оі-амилазн. На этот штамм получено авторское свидетельство, ж он может быть рекомендован для промышленного получения фермента.
