Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Микроорганизмы-деструкторы полициклических ароматических углеводородов 14
1.2. Метаболические пути деструкции нафталина и фенантрена 16
1.2.1. Биохимические пути утилизации нафталина микроорганизмами 17
1.2.2. Метаболические пути разложения фенантрена бактериями 25
1.3. Генетические системы биодеградации ПАУ 31
1.3.1. Структурно-функциональная организация генетических систем деградации нафталинау бактерий 31
1.3.2. Генетические системы биодеградации фенантрена 35
1.4. Галофильные микроорганизмы 38
1.4.1. Микробная деструкция углеводородов в условиях повышенного содержанияNaCl 38
1.4.2. Механизмы галоадаптации у микроорганизмов 41
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1. Бактериальные штаммы 46
2.2. Среды и условия культивирования 46
2.3. Накопительные культуры 48
2.4. Определение ростовых характеристик 49
2.5. Таксономическая характеристика микроорганизмов 49
2.6. Выделение и рестрикция плазмидной ДНК 53
2.7. Коньюгационный перенос плазмидной ДНК 56
2.8. Элиминация бактериальных плазмид 56
2.9. Определение стабильности признаков биодеградации ПАУ 57
2.10. Определение активностей ферментов биодеградации ПАУ 57
2.11. Анализ метаболитов ПАУ методом тонкослойной хроматографии 58
2.12. Скрининг бактериальных культур методом отпечатков 59
2.13. Статистическая обработка 59
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1. Образцы почвы, донных отложений и их характеристика 60
3.2. Выделение и характеристика штаммов-деструкторов нафталина, фенантрена, бифенила 63
3.2.1. Выделение штаммов-деструкторов ПАУ 63
3.2.2. Идентификация штаммов-деструкторов ПАУ 64
3.2.3. Характеристика деградативных способностей штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена 70
3.2.4. Влияние повышенных концентраций хлорида натрия на рост бактерий-деструкторов ПАУ 80
3.2.5. Роль плазмид в деградации ПАУ и устойчивости бактерий к повышенным концентрациям NaCl 91
3.3. Накопительные культуры микроорганизмов 97
3.3.1. Характеристика накопительных культур, инкубированных на полноценных средах с различным содержанием хлорида натрия 97
3.3.2. Характеристика накопительных культур микроорганизмов, инкубированных на минеральной среде Раймонда с нафталином при повышенных концентрациях хлорида натрия 100
3.3.3. Микробное сообщество, осуществляющее деструкцию нафталина при повышенных концентрациях NaCl 104
Заключение 110
Выводы 115
Список литературы 117
- Биохимические пути утилизации нафталина микроорганизмами
- Структурно-функциональная организация генетических систем деградации нафталинау бактерий
- Таксономическая характеристика микроорганизмов
- Роль плазмид в деградации ПАУ и устойчивости бактерий к повышенным концентрациям NaCl
Биохимические пути утилизации нафталина микроорганизмами
Изучено четыре возможных пути катаболизма нафталина аэробными бактериями:
1) неполное окисление нафталина до салициловой кислоты, с высвобождением пирувата и накоплением салициловой кислоты в ростовой среде;
2) полный катаболизм нафталина с использованием мета-пуш расщепления катехола;
3) полный катаболизм нафталина с использованием орто-иути расщепления катехола;
4) полный катаболизм нафталина через гентизиновую кислоту.
В общей схеме катаболизма нафталина можно выделить три ключевых соединения: нафталин, как первое соединение различных метаболических путей, а так же салициловую кислоту и катехол как "точки" дивергенции катаболических реакций. В соответствии с этим начальные ферменты катаболизма данных соединений - нафталин диоксигеназа, салицилат гидроксилаза, катехол-1,2-диоксигеназа и катехол-2,3-диоксигеназа названы ключевыми ферментами катаболизма нафталина [34, 177].
Подготовительный метаболизм нафталина проходит у разных микроорганизмов по общему, "верхнему пути" биодеградации нафталина, в процессе которого нафталин через три этапа расщепляется до салициловой кислоты (рис. 1). Как показано для штамма Pseudomonas putida NP [150], первым метаболитом, образующимся в процессе двойного гидроксилирования одного из колец нафталина, является нафталин-г/г/с-1,2-дигидродиол. Данную реакцию катализирует мультикомпонентная нафталин диоксигеназа, катализирующая несколько типов реакций, включая г/иодигидроксилирование, монооксигеназную и диоксигеназную реакцию, и состоящая из трех белков: флавопротеина, ферредоксина и терминальной оксигеназы (рис. 2). Начальным акцептором электронов является флавопротеин, передающий их от NAD(P)H ферредоксину, который передает электроны на каталитический центр фермента. Присоединение двух атомов кислорода к молекуле нафталина катализирует терминальная диоксигеназа в присутствии НАДФ и двух других компонентов [150, 151]. Исследования показали, что нафталин диоксигеназа является ot3J33 гексамером, каждая а субъединица которого содержит Риске [2Fe-2S] кластер, негеминовое железо (II) и гидрофобные аминокислоты (рис. 2). По аналогии с толуен- и бифенил диоксигеназами, предполагают, что 3 субъединицы влияют на субстратную специфичность фермента [93,128].
Нафталин г/ис-1,2-дигидродиол окисляется (+)-цис нафталиндигидродиол дегидрогеназой с образованием 1,2-дигидроксинафталина в присутствии NAD+, как акцептора электронов. Данный фермент, состоящий из четырех идентичных по размеру субъединиц способен окислять ряд z/wc-дигидродиолов, образующихся при микробной деструкции различных ПАУ, такие как г/иоантрацен дигидродиол, г/мс-фенантрен дигидродиол, г/иотолуен дигидродиол, г/иобензен дигидродиол. Различные формы нафталин дигидродиол дегидрогеназ, выделенные из штаммов Pseudomonas и Nocardia spp., растущих на нафталине, окисляли с одинаково высокой скоростью г/ис-дигидродиолы различных ПАУ [151, 152]. При утилизации нафталина Mycobacterium sp. в качестве первого метаболита наряду с г/ио1,2-дигидродиолом образуется транс-1,2-дигидродиол [119].
Как было показано Eaton и Chapman на примере рекомбинантного штамма Pseudomonas aeruginosa РА01, первым продуктом диоксигеназного расщепления 1,2-дигидроксинафталина является гидроксихромен 2-карбоксилат. Катализирующая данную реакцию дигидроксинафталин диоксигеназа, выделенная из штамма P. putida NCIB 9816, также может использовать 3-й 4-метилкатехол как альтернативные субстраты и требует Fe для максимальной активности [77, 153]. Соответствующая диоксигеназа, выделенная из неидентифицированного бактериального штамма BN6 способна расщеплять катехол, 3- и 4-метилкатехол, 2,3- и 3,4-дигидроксибифенил, 1,2,5-тригидроксинафталин и 1,2,7-тригидроксинафталин [126]. 2-гидрокси-2-карбоксилат трансформируется 2-гидроксихромен-2-карбоксилатизомеразой с образованием траноо-гидроксибензопировиноградной кислоты. Данное соединение расщепляется анс-о-гидроксибензопируватгидратат альдолазой до салицилальдегида с освобождением пирувата [76].
Салицилальдегид дегидроксилаза окисляет салицилальдегид до салицилата и требует NAD+ для активности [68].
Наиболее распространенный путь подготовительного метаболизма салициловой кислоты ("нижний" путь утилизации нафталина) окислительное декарбоксилирование салицилата в катехол (рис. 3).
Салицилат 1-гидроксилаза катализирует декарбоксилирование и гидроксилирование салицилата в присутствии NADH, приводящее к образованию катехола. Этот фермент является флавопротеином, 1 моль которого свободно связан с одним моль FAD, и впервые был очищен Yamamoto и др. в 1965 году из Pseudomonas sp., использующим салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии [198]. Салицилат 1-гидроксилаза характеризуется широкой специфичностью и катализирует окислительное декарбоксилирование ряда ароматических соединений, имеющих гидроксильную группу в ортио-положении: 4-аминосалициловой, 2,4-диоксибензойной, 2,3-диоксибензойной кислот [13].
Конверсию салицилата до катехола у штамма Pseudomonas stutzeri AN10 катализируют две изофункциональных, индуцибельных, контролируемых хромосомой, салицилат гидроксилазы NahG и NahW. Оба фермента обладают широкой субстратной специфичностью и способны метаболизировать салицилат, метилсалицилаты и хлорметилсалицилаты. Обе салицилат гидроксилазы принадлежат, как и салицилат гидроксилаза штамма P. putida G7, к группе флавинсодержащих монооксигеназ, размером 45Ш[48].
В противоположность многим нафталин-деградирующим штаммам, штамм Pseudomonas sp. U2 [84] использует другой путь для метаболизма салицилата. Данный штамм осуществляет реакцию конверсии салицилата в гентизиновую кислоту, катализируемую салицилат-5-гидроксилазой (рис. 3).
Данный фермент имеет в своем составе две субъединицы и действует как монооксигеназа с электронтранспортной цепью из ферредоксина и ферредоксинредуктазы, получающей электроны от NAD(P)H. Гентизат в дальнейшем трансформируется гентизат-1,2-диоксигеназой в малеилпировиноградную кислоту. Малеилпируват изомеризуется глутатион-зависимой малеилпируват изомеразой до фумарилпирувата, а затем фумарилпируватгидролаза катализирует гидролиз последнего до фумарата и пирувата [84, 205]. Grund с соавторами показали, что у выделенного из почвы штамма Rhodococcus sp. В4, конверсия нафталина также идет через салициловую кислоту и гентизат, при этом салицилат не является индуктором ключевых ферментов утилизации нафталина. Активность 1,2-дигидроксинафталин оксигеназы данного штамма зависит от NADH, а салицилат-5-гидроксилаза требует NADH, АТР, и Со А [98].
При индукции салицилатом, 3-метилсалицилатом и антранилом ключевых ферментов деградации нафталина, контролируемых плазмидой NAH7, наблюдается пропорциональность между изменениями удельных активностей нафталин оксигеназы и салицилат гидроксилазы. Эти данные дали возможность предположить, что синтез нафталин оксигеназы и салицилат гидроксилазы регулируется координированно, и данные ферменты входят в одну регуляторную единицу [34].
Окисление катехола может происходить различными путями. Наличие в штамме катехол-2,3-диоксигеназной активности приводит к расщеплению катехола по мета-пуш, с образованием 2-гидроксимуконового полуальдегида [67].
Структурно-функциональная организация генетических систем деградации нафталинау бактерий
К настоящему времени детально изучен генетический контроль биодеградации нафталина. У большинства изученных штаммов окисление нафталина и салициловой кислоты полностью или частично детерминируется плазмидными генами [19, 202]. К настоящему времени обнаружено уже несколько десятков плазмид биодеградации, или D-плазмид, подавляющее большинство из них - у почвенных псевдомонад. У данных бактерий обнаружено более 20 плазмид, контролирующих полное или частичное окисление нафталина [6, 75, 151].
Плазмида NAH7 рассматривается как архетип для группы плазмид деградации нафталина и салицилата. Гены плазмиды NAH7 кодируют ферменты для 11 стадий последовательного полного расщепления нафталина [201]. Организация и направление транскрипции этих генов были изучены на серии полярных мутантов, обусловленных транспозицией Тп5, а также с помощью химического мутагенеза и клонирования генов. Структурные гены плазмиды NAH7, кодирующие ферменты окисления нафталина и салицилата объединены в два оперона внутри 30 т.п.н. региона плазмиды NAH7.
Транспозонный мутагенез, а также клонирование nah- генов показали, что порядок генов nah 1 -оперона ("верхний" путь), кодирующего конверсию нафталина в салицилат с освобождением пирувата, у NAH7 следующий: nahA- nahB- nahC- nahD- nahE- nahF (рис. 5). Гены нафталин диоксигеназы штаммов Pseudomonas putida PpG7 и NOB 9816 расположены выше остальных генов конверсии нафталина в следующем порядке пакАа-nahAb-nahAc-nahAd [38]. Ген флавопротеина, nahAa, расположен выше гена ферредоксина, nahAb, за которым расположены два гена, nahAc и nahAd, кодирующие а и Р субъединицы терминальной диоксигеназы [79].
Методом клонирования показано, что нафталин диоксигеназа штамма Pseudomonas putida U2 кодируется генами nagAa (ген ферредоксин редуктазы), и nagAb (ферредоксина), nagAc и nagAd (большой и малой субъединиц, соответственно). Между nagAa и nagAb генами данного штамма находятся две открытые рамки считывания nagG и nagH, ответственные за синтез субъединиц салицилат 5-гидроксилазы [84]. Ниже генов конверсии нафталина до гентизата (nagAaGHAbAcAdBFCQED) расположен кластер генов (nagJIKLMN), транскрипция которых идет одновременно с генами "верхнего пути", как одного оперона. Гены naglKL кодируют ферменты дальнейшего катаболизма гентизата до фумарата и пирувата, биохимическая функция остальных генов в настоящее время не определена [204].
"Нижний" путь окисления нафталина (паЬ2-ожрон) контролируется генами nahG nahH- nahI- -nahJ- nahK, кодирующим окисление салицилата через мета-расщепление катехола до ацетальдегида и пирувата [155]. В результате инактивации первого оперона теряется способность к утилизации нафталина (Nah-, Sal+ -фенотип), при инактивации второго - к утилизации салицилата (Nah+, Sal- - фенотип) [6].
Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата обнаружены у ряда штаммов рода Pseudomonas, большинство из которых имеют идентичный "верхний путь" деградации нафталина и относятся к группам несовместимости Р7 и Р9 [171]. Гены "верхнего пути" биодеградации нафталина могут располагаться на хромосоме, как показано для штамма Pseudomonas putida NP [170], и иметь противоположную ориентацию по отношению к генам "нижнего пути", как в случае плазмиды pWW60-l [54].
В штамме Pseudomonas putida BS202 плазмида NPL-1 контролирует только первичные этапы окисления нафталина до салицилата (лаЫ-оперон) [17]. Окисление салицилата до катехола с дальнейшим расщеплением последнего по орто-иута контролируется хромосомными генами. Однако плазмида NPL-1 имеет в своем составе нефункционирующий ген nahG, кодирующий салицилат гидроксилазу. Получение мутантов, обусловленных транспозицией Tnl, показало, что в составе данной плазмиды присутствуют молчащие гены мета-пути расщепления катехола и салицилат гидроксилазы, которые могут включаться в результате мутационных событий [33].
Предложена модель позитивной регуляции ш/г-генов, постулирующая наличие регуляторного элемента R, общего для обоих оперонов [202] (рис. 5). В клетках P. putida, содержащих плазмиду NAH7, в отсутствии салицилата наблюдается низкий конститутивный уровень экспрессии nah\-nah2- шМ-областей. Добавление в среду салицилата (или нафталина, который медленно метаболизируется в салицилат за счет низкого базального уровня конститутивной экспрессии генов ш/гі-оперона) приводит к активации транскрипции nah- и /-оперонов, опосредованной предсинтезированным продуктом гена nahR [61]. Предположительно, белок NahR связывается с салицилатом или салициловым альдегидом и согласно представлениям в рамках модели позитивной регуляции оперонов переходит активную форму активатора транскрипции nah- и -оперонов [167]. Транскрипция гена nahR конститутивна и не зависит от присутствия салицилата. Анализ транспозонных мутантов с нарушенной регуляцией nah-генов позволили локализовать nahR локус на карте плазмиды NAH7 в непосредственной близости к nahG гену. Направление транскрипции гена nahR противоположно nahG [168]. В случае плазмиды NPL-1, регуляторный локус R расположен на Х-сегменте, который примыкает к структурному гену nahA. Комплементационный анализ транспозонных мутантов с использованием клонированного nahR локуса показал, что nahR кодирует продукт, являющийся активатором обоих оперонов [36, 203]. Высокий уровень гомологии между nah- и sal- промоторами может свидетельствовать о наличии в прошлом общего предка.
В промоторах nah- и /-оперонов в позициях -35 и -10 обнаружены последовательности, близкие к -35 и -10 сайтам обобщенного конститутивного промотора грамотрицательных бактерий, что более характерно для негативно регулируемых промоторов. Наличие элементов негативного контроля подтверждает и тот факт, что в случае плазмиды NPL-1 с индуцибельным синтезом ферментов иа/г-оперона, переход к конститутивности сопровождается инверсией сигмента X, локализованного перед структурным геном nahA [36]. Если продукт регуляторного локуса является негативно действующим, инверсия, нарушив структуру регуляторного гена, приводит к конститутивному синтезу ферментов nah-оперонов. Область локализации инверсии показывает значительную степень гомологии в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации с областью плазмиды NAH7, содержащей локус nahR [7].
Недавно выделены штаммы Pseudomonas stutzeri, в которых гены биодеградации нафталина полностью локализованы на хромосоме [164]. Штамм почвенных бактерий Pseudomonas putida OUS82 также несет хромосомно-локализованные гены "верхнего пути" деградации нафталина. Хромосомное расположение генов биодеградации салицилата показано на примере штамма Pseudomona putida 12А [31]. Это позволяет предполагать, что гены утилизации ПАУ (ря/г-гены) могут сохраняться не только на плазмидах, но и на хромосомах в микробной популяции [125]. Herrick с соавторами обнаружили идентичный ген железосодержащего белка нафталин диоксигеназы nahAc на плазмидах разного размера и на хромосомах у ряда почвенных бактерий. Предполагают, что горизонтальный перенос генов, ответственных за биодеградацию ПАУ, может играть ключевую роль в эволюции бактериальных популяций и адаптации микробных сообществ к загрязнению окружающей среды [107].
Как показали Dunn и Gunsalus, NAH плазмиды являются конъюгативными и могут быть перенесены в реципиентные штаммы, приобретающие способность к деструкции нафталина [75].
Недавно в составе плазмиды NAH7 штамма P. putida G7 обнаружен ген nahY, транскрипция которого идет параллельно с транскрипцией генов мета-пути расщепления катехола. Белок NahY, кодируемый данным геном является мембранным белком и необходим для хемотаксиса бактерий в область концентрации нафталина [97].
Таксономическая характеристика микроорганизмов
Морфологию и жизненный цикл изучали у 12-72 часовых культур, выращенных на агаризованной среде LB с использованием световой микроскопии (фазовый контраст).
Отношение к окраске по Граму изучали общепринятым методом [24]. Высушенную на воздухе и фиксированную нагреванием на стекле бактериальную пленку погружали на 1 мин в красящий раствор красителя -кристаллического фиолетового. Бактериальную пленку отмывали дистиллированной водой, затем покрывали на 2 мин йодной протравой (йод 1 %, йодистый калий 2 %). Пленку промывали дистиллированной водой и погружали на 30 с в 95 %-ный этанол; еще раз промывали и подсушивали. Грамположительные бактерии окрашивались в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в розовый.
Наряду с общепринятым методом использовался тест с КОН [32].
Небольшое количество суточной культуры бактерий наносили на предметное стекло и размешивали петлей в капле 3 %-го КОН. Через 1-2 мин проверяли наличие лизиса. Грамотрицательные бактерии лизировались и капля становилась желеобразной. Суспензии грамположительных микроорганизмов сохраняли свой прежний вид.
Препарат "раздавленная" капля готовили на предметном стекле, на котором в кашпо воды петлей вносили небольшое количество бактериальной культуры с агаризованной среды LB. Затем на каплю накладывали покровное стекло, после чего производилась микроскопия препарата под иммерсией (объектив х 100).
Способность бактерий к образованию флюоресцирующего пигмента исследовали на среде Кинг В, следующего состава (г/л): пептон - 20, глицерин - 10, К2НРО4 - 1.5, MgS04 - 1.5, агар Difco - 1.6. Интенсивную желто-зеленую флюоресценцию пигмента наблюдали в ультрафиолете.
Разжижение желатина изучали в пробирках с 15 % желатином в среде LB. Культуры засевали методом укола. Для этого среду разливали в пробирки, которые на время застывания устанавливались в штативе вертикально. Вглубь столбика иглой вносили культуру, предварительно взятую стерильной иглой с чашки Петри с твердой питательной средой. Пробирки выдерживали 1 час в рефрижераторе. Разжижение желатина отмечали на 25-30 день инкубации.
Способность к росту при 42С изучали на агаризованной среде LB в течении 48 часов, способность к росту при 5С изучали в пробирках на скошенной агаризованной среде LB в течение двух недель.
Для индикации каталазы на предметное стекло наносили каплю 3 % перекиси водорода. В каплю вносили культуру. О наличии каталазы судили по появлению пузырьков газа через 2-5 мин.
Для выявления лецитиназной активности к расплавленной и охлажденной до 50С агаризованной среде LB добавляли 5 % стерильного "яичного" раствора (стерильный желток, разведенный наполовину 0.85 % раствором NaCl), размешивали и разливали в чашки Петри. Бактерии засевали штрихом и инкубировали 3-5 сут. при температуре 28 С. Бактерии лецитиназоположительных микроорганизмов были окружены радужными зонами.
Способность к росту на глюкозе изучали на чашках Петри, 0.5 % глюкозу добавляли к агаризованной минеральной среде К1. Рост культуры регистрировали в течении 36 часов.
Гидролиз крахмала определяли на агаризованной среде LB, содержащей 0.2 % растворимого крахмала. Бактерии выращивали 2-5 суток, после чего заливали раствором Люголя, который дает с крахмалом синее окрашивание. Колонии продуцентов амилаз были окружены прозрачными неокрашенными зонами.
Способность к денитрификации изучали в пробирках, содержащих 6 мл LB с 0.5 % КгЮз и 1 % глицерина. Среду засевали суточной культурой бактерий и заливали голодным агаром, о положительной денитрификации свидетельствовал рост бактерий в анаэробных условиях и появление пузырьков свободного азота под агаром.
OF-тест (способность к брожению) изучали на среде следующего состава (г/л): NH4H2PO4 - 0,2; КС1 - 0,04; MgS04 - 0,04; дрожжевой экстракт -0,2; агар - 0,4; с добавлением индикатора - бромкрезолового пурпурного (30 мг/л) и глюкозы (1 %). Для создания анаэробных условий пробирки со средой заливали вазелиновым маслом. Положительную реакцию фиксировали по изменению цвета индикатора в желтый цвет.
Для изучения хемотаксономических признаков, грамположительные бактерии выращивали аэробно на пептонно-дрожжевой среде (глюкоза - 5 г, пептон - 5 г, дрожжевой экстракт - 3 г, К2НРО4 - 0.2). Диагностические аминокислоты и сахара клеточных стенок определяли, как описано [44]. Состав аминокислот пептидогликана исследовали экспресс-методом [160]. Для получения препаратов пептидогликана суспензию клеток автоклавировали в растворе 0.3 Н КОН с добавлением Твина-80 (0.1 %) (10 мин., 121 С) и центрифугировали, осадок обрабатывали раствором трипсина в фосфатном буфере (12 час, 37С) и SDS (1 %, 5 мин., 100С), отмывали в дистиллированной воде и высушивали. Аминокислотный состав полученных препаратов пептидогликанов определяли на анализаторе фирмы "Hitachi" (Япония) после кислотного гидролиза (6 Н НС1, 12 час, 105С) и нейтрализации упариванием (до рН 6.0).
Определение менахинонов проводили по методу Минникина и др. [141]. Менахиноны экстрагировали из лиофильно высушенной биомассы раствором хлороформ : метанол (2 : 1), суспензию перемешивали в течение 2 часов. Биомассу после экстракции удаляли фильтрацией. Хлороформно-метанольный экстракт упаривали при пониженном давлении на роторном испарителе, перерастворяли в ацетоне и наносили на тонкослойную пластинку Kieselgel 60 (Merk). После разделения в системе гексан : диэтиловый эфир (85 : 15), менахиноны экстрагировали хлороформом. Длина изопреноидной цепи менахинонов исследуемых штаммов устанавливалась в сравнении с эталонными смесями менахинонов. Масс-спектрометрический анализ менахинонов проводили на масс-спектрофотометре МХ-1310.
Определение миколовых кислот. 10 мг сухой биомассы помещались в гидролизную пробирку с добавлением 0.5 мл толуола, 0.02 мл конц. H2S04, после чего смесь тщательно перемешивалась. Метанолиз проводился в течении 12-16 часов при температуре 75С. После охлаждения смеси к ней добавлялось 0.2 мл гексана и смесь интенсивно встряхивалась. Гексановый экстракт наносился на пластинку Merkc кизильгелем 100x25x0.25 мм и разгонялся в системе гексан : диэтиловый эфир (85 : 15). После высушивания хроматограмму проявляли 5 % раствором фосфорномолебденовой кислоты в спирте при нагревании. Миколовые кислоты визуализируются как синие пятна на желтом фоне [58].
Идентификация грамположительных микроорганизмов была проведена совместно с сотрудниками отдела "Всероссийская коллекция микроорганизмов" Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Роль плазмид в деградации ПАУ и устойчивости бактерий к повышенным концентрациям NaCl
У большинства описанных в литературе штаммов-деструкторов, гены, контролирующие разложение нафталина, расположены в плазмидах [4, 73].
Нами был проведен анализ на наличие плазмидной ДНК 12 штаммов-деструкторов нафталина (фенантрена и бифенила), таксономические и биохимические свойства которых описаны выше. В десяти исследуемых штаммах обнаружены плазмиды большого размера (рис. 13,14).
Анализ электрофореграмм показал, что все штаммы Pseudomonas, а также штамм A. nicotiane SN17 и штамм DN13 содержат плазмиды размером около 85 тпн. В штамме Rhodococcus sp. SN31 зарегистрирована плазмида размером около 100 тпн, в штаммах A. globiformis DF14 и SF27- плазмиды размером около 120 тпн. Штамм Rhodococcus sp. G10 содержит плазмиды размером около 85 тпн и 70 тпн. В штаммах Rhodococcus sp. DBI 1 и Bacillus sp. SN501 плазмиды не были обнаружены.
Для доказательства плазмидной локализации генов, участвующих в разложении нафталина, проведены эксперименты по элиминации плазмиды из штамма P. putida SN11 и эксперименты по конъюгационному переносу.
Эксперименты по элиминации плазмиды штамма P. putida SN11 не дали положительных результатов. Бесплазмидных вариантов штамма P. putida SN11 получить не удалось.
Конъюгационный перенос плазмиды pSNll в реципиентный штамм P. putida В S3 94 (cys nah sal ) приводил к образованию трансконъюгантов с фенотипом Cys" Nah+ Sal+ Phn+. (табл. 9). Три трансконъюганта были проверены на наличие плазмид. При анализе было выявлено, что все эти трансконюгантные штаммы содержали, кроме плазмиды pSNll, ее делеционный вариант размером около 60 тпн. Полученные данные свидетельствуют о том, что плазмида pSNll является конъюгативной и содержит гены, контролирующие разложение нафталина и салицилата. Кроме того деградация фенантрена штаммом P. putida SN11 также контролируется плазмидой. Как показано Sanseverino с соавт., выделенные из штаммов псевдомонад плазмиды pKAl, рКА2, рКАЗ размером около 100 тпн, контролируют деградацию нафталина, а также фенантрена и антрацена [166]. Полученные нами данные подтверждают возможность деструкции ПАУ с высокой молекулярной массой с участием ферментов, контролируемых плазмидными генами верхнего пути биодеградации нафталина.
Аналогичные эксперименты по конъюгационному переносу плазмид были проведены из штаммов P. putida. SN101 и G51 в реципиентный штамм P. putida В S3 94. Установлено, что как и в случае плазмиды pSNl 1, плазмиды из штаммов P. putida SN101 и G51 являются конъюгативными и содержат гены деградации нафталина. Кроме того показано, что при конъюгационном переносе плазмид из этих штаммов происходит делеция сегмента ДНК, аналогичная делеции в плазмиде pSNll. Подобные делеции для рецепиентного штамма BS394 были описаны ранее другими авторами [18].
Рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции EcoBl показал, что плазмиды из исходных штаммов P. putida SN11 и P.putida G51 имеют одинаковый набор рестрикционных фрагментов, что позволяет предположить идентичность данных плазмид. Анализ ЕсоШ-фрагментов делеционных вариантов плазмид, выделенных из трансконъюгантов P. putida SN11-81 и P. putida G51-71, также показал их идентичность.
Плазмидная локализация генов биодеградации может являться причиной того, что в неселективных условиях многие штаммы-деструкторы способны терять деградативные свойства. Как показано для штамма Pseudomonas putida BSA, плазмида NPL-41, контролирующая конститутивный синтез нафталин диоксигеназы, нестабильна в условиях непрерывного культивирования на глюкозе и сохраняется лишь у 0.05 % клеток после 78 генераций [6]. Способность к росту на нафталине и салицилате у двух исследуемых нами штаммов-деструкторов нафталина P. putida SNll и Rhodococcus sp. DB11 была проверена после последовательных пересевов бактерий в жидкой среде LB. Результаты этих опытов показали 100 % сохранение способности к росту на нафталине и салицилате после 80 генераций в неселективных условиях. Как показано ранее, экспрессия генов "верхнего пути" деградации нафталина штамма P.putida SNll имеет индуцибельный характер, следовательно не требует энергетичесих затрат клетки и способствует стабильному существованию плазмиды биодеградации pSNl 1 в неселективных условиях.
Известно, что способность к деструкции различных ксенобиотиков штаммами рода Arthrobacter также часто определяется плазмидными генами [50, 85, 193, 204]. В наших исследованиях при обработке штамма-деструктора фенантрена A. globiformis SF27 митомицином С в концентрации 0.6 мкг/мл были получены элиминантные штаммы. Установлено, что элиминанты не способны к росту на фенантрене и 1-тидрокси-2-нафтоате; в то же время они сохраняют способность к росту на салицилате. Полученные данные позволяют предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1-тидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у штамма A. globiformis SF27 кодируются плазмидными генами.
Из литературы известно, что способность ряда галотолерантных бактерий к росту при повышенном засолении среды связана с присутствием определенных плазмид [82, 187, 188]. Для проверки влияния плазмид на устойчивость бактерий к повышенным концентрациям NaCl трансконъюганты P. putida BS394-(SN11-81) и P. putida BS394-(SNll-82) выращивались при разных концентрациях соли на среде Раймонда с: 1) триптоном и дрожжевым экстрактом (полноценная среда), 2) нафталином в качестве субстрата (табл. 10).
Показано, что реципиентный штамм P. putida BS394 способен к слабому росту в среде, содержащей 0.7 М NaCl, но не растет при 1 М NaCl, тогда как у трансконъюгантных штаммов был отмечен хороший рост при содержании 1 М NaCl в полноценной среде, и при 0.7 MNaCl - в среде с нафталином. При повышении концентрации соли в полноценной среде и среде с нафталином до 1.5 Ми 1.0 М, соответственно, наблюдался слабый бактериальный рост, который сопровождался лизисом клеток.
Сравнение способности штамма P. putida SN11 и трансконьюгантов к росту при высоких концентрациях соли показало, что штамм P. putida SN11 более устойчив к повышению концентрации соли в ростовых средах, чем трансконъюгантные штаммы (штамм P. putida SN11 хорошо растет при 1.5 М NaCl, лизиса культуры не наблюдается). Из этого следует, что у исследуемого штамма P. putida SN11 устойчивость к повышенной концентрации соли в ростовых средах детерминируется как плазмидными, так и, вероятно, хромосомными генетическими элементами клетки.
