Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
Глава 1 Синтез углеводородов бактериями 13
Глава 2 Физиология и биохимия сульфатредуицрувящх
бактерий 26
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 54
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 59
Глава 3 Объекты и методи исследований 59
Объекты исследовании 59
Питательные среды 60
Культивирование бактерий 62
Газовые смеси 63
Определение количества клеток сульфатредуцирующих бактерий 63
Определение содержания белка в культуральной жидкости 64
Определение удельной скорости роста бактерий (ti) 65
Определение длительности лаг-фазы 65
Получение экстрактов клеток бактерий 65
Определение рН и Eh в культуральной жидкости 66
Анализ газообразных соединений 66
Определение углеводородов газохромато-графическим и масс-спектрометрическим
методами 68
Определение кислородсодержащих продуктов (кислот и спиртов) методом газо-жидкостной хроматографии 69
Тонкослойная хроматография 70
Определение включения 14С и 3Н в биомассу бактерий и продукты жизнедеятельности клеток 71
Аналитические методы 72
Определение лактата и пирувата 73
Определение активности формиатде-гидрогеназы 74
Устройство для создания различных значений окислительно-восстановительного потенциала среды при культивировании сульфатредуцирующих бактерий 75
Характеристика биореактора используемого
для моделирования экспериментов 75
3.21 Математическая обработка результатов
исследований 76
Глава 4 Способность сульфатредущіруюшх баюлерий
продуцировать внеклеточные углеводороды 77
4.1 Способность Desulfovibrio desulfuricans
к синтезу внеклеточных углеводородов в
условиях гетеротрофного роста 77
4.2 Сравнительная характеристика спектров
внутри и внеклеточных углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans 95
Способность других представителей сульфатредуцирующйх бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях гетеротрофного роста 99
Способность сульфатредуцирующйх бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях литогетеротрофного роста 113
Способность сульфатредуцирующйх бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов в условиях автотрофного роста 121
Глава 5 Влияние различных факторов на рост и
образование внеклеточных углеводородов
сульфатредуццрующцми бактериями 129
Влияние различных сточников углерода и энергии на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans ВКМ 1799 129
Влияние неорганических акцепторов электронов на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricaus ВКМ 1799 138
Влияние физико-химических факторов на рост и образование углеводородов сульфатреду-цирующими бактериями 147
5.3.1 Влияние рН среды на рост и образование
углеводородов Desulfovibrio desulfuricans
ВКМ 1799 147
5.3.2 Влияние окислительно - восстановительного
потенциала среды на рост и образование
углеводородов Desulfovibrio desulfuricans
BKM 1799 153
5.3.3 Влияние соотношения Нг : СОг в газовой фазе на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 158 5.4 Влияние других факторов на рост и
образование углеводородов Desulfovibrio
desulfuricans BKM 1799 166
Влияние органического азота на рост и образование углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 166
Влияние фосфатов на рост и образование углеводородов сульфатредуцирующими бактериями 169
Синтез углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 при выращивании бактерий в лабораторном биореакторе 174
Моделирование образования углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 при росте культуры в биореакторе 177
Глава 6
6.1
Механизм синтеза внеклеточных углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 182
6.2
6,3
6.4
Участие лактата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 182 Участие ацетата в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 186 Участие СОг в синтезе углеводородов Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 189 Участие формиата в синтезе углеводородов
Desulfovibrio desulfuricans BKM 1799 191
6.5 Распределение меченого углерода в продуктах
метаболизма Desulfovibrio desulfuricans
BKM 1799 при синтезе углеводородов 197
6.6 Участие молекулярного водорода и водорода
воды в синтезе углеводородов Desulfovibrio
desulfuricans BKM 1799 204
Глава 7 Применение зазохроматографического метода для определения интенсивности образования углеводородов сульфатредуццрукщіми бактериями в различных природних объектах 209
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 222
ВЫВОДИ 235
ЛИТЕРАТУРА
Введение к работе
Актуальность проблемы. Синтез углеводородов различными организмами занимает внимание ученых многих стран мира в связи с проблемой сокращения энергетических ресурсов в природе.
В настоящее время способность к синтезу углеводородов доказана для целого ряда живых организмов. Значительное число работ, опубликованных за последнее время, посвящено углеводородам и, в частности, алканам, обнаруженным в пыльце и спорах различных растений, а также входящим в состав восков поверхности листьев (Чернова, Сафарова, 1989; Yochkova, Mlade-nova, Stolanova,1992; Gulz, Muler, Herrman, 1993; Yamaqucehi, Mega, Sanada, 1993); у насекомых (Brill, Bertsch, 1990; Guo, Blomquist, 1991; Brown, Sparadbery, Lacey, 1991). Активно, в этом плане, изучаются микроводоросли (Gudin, Thepenier,1986; ВаіШег et.al., 1988; Fatma, 1989; Wirth et. al.,1992).
Возможность синтеза углеводородов бактериями занимает особое положение в связи с выяснением роли этих организмов в синтезе углеводородов нефти. Исследования в этой области были начаты еще в 30-ые годы. В этот период появляются сообщения об обнаружении "углеводородоподобных веществ" в клетках бактерий и водорослей (Селибер, 1937; Jankowski, ZoBell, 1944; ZoBell.1945; 0akwood,1945).
Основные исследования состава углеводородов различных организмов и, в частности, бактерий, были выполнены в результате разработки метода газожидкостной хроматографии (Oppenhe-ітегД965; Joneau, Baraud, Cassagne, 1969; Han, Chan, Calvin, 1969; Weete, Weler, Laseter, 1970; Albro, Dittmer, 1970; Tor-
nabene, Morrison, Kloos, 1970; Ерошин, Дедюхина, 197; Же-лифонова и др.,1975).
В более поздние годы разрабатывались отдельные этапы синтеза углеводородов (Tornabene, Ого, 1967; Albro, Meehan, Dittmer, 1970; Bird, Lynch, 1974; Tornabene, 1976, 1981). Однако в целом вопрос механизма синтеза углеводородов микроорганизмами остается до сих пор не исследованным.
В последние годы в научных программах многих стран большое внимание уделяется изучению метаболизма анаэробных бактерий. Исследование анаэробов привело к открытию огромной роли процессов, осуществляемых этими микроорганизмами в анаэробных зонах биосферы (Заварзин, 1972; Кузнецов, 1974; Розанова, Кузнецов, 1974; Германов, Борзенков, Юсупова, 1981; Hansen, 1988; Иванов с соавт., 1991). К числу таких процессов относится и синтез углеводородов. Наиболее вероятными про-, дуцентами углеводородов в природе, наряду с метаногенами, являются сульфатредуцирующие бактерии, так как именно этим бактериям принадлежит главная роль в терминальных путях анаэробной деструкции органического вещества и в преобразовании морских осадков (Иванов с соавт., 1980; Беляев, Лейн, Иванов,1979,1981; Hamilton, 1983; Postdate,1984; Иванов и др., 1990; Langendijk, Van Den Kieboom, Van Der Hoeven, 1995). В этой связи несомненно актуальным является исследование процесса синтеза углеводородов сульфатредуцирующими бактериями.
Анализ проблемы показал, что большое число работ посвящено вопросам бактериального синтеза газообразных углеводородов, особенно - метана С Чан Динь Тоай, Хлудова, Панцхава, 1983; Fukuda, 1984 a,b; 1990; Беляев, 1988; Варфоломеев,
Калюжный, Медман, 1988; Панцхава, 1989; Thauer, 1990; Wolfe, 1990 ; Jetten, Stams, Zehnder, 1992), а также изопреноидным углеводородам (Zhou, White, 1991). Способность кчзинтезу внеклеточных жидких и твердых углеводородов одной из наиболее активных групп анаэробных микроорганизмов, какими являются сульфатредупирующие бактерии, остается неизученной. Это и определило актуальность настоящей работы, посвященной изучению метаболизма сульфатредуцирующих бактерий в связи с вовможным их участием в синтезе углеводородов в природе.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является доказательство способности сульфатредуцирующих бактерий к синтезу внеклеточных углеводородов и разработка научных основ, обеспечивающих осуществление этого процесса.
В соответствии с основной целью работы были определены следующие задачи:
изучить способность сульфатредуцирующих бактерий продуцировать внеклеточные углеводороды в условиях гетеротрофного, литогетеротрофного и автотрофного роста;
установить наиболее активных продуцентов углеводородов среди физиологически и биохимически различных видов сульфатредуцирующих бактерий;
определить состав внеклеточных и внутриклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans для их сравнительной характеристики;
установить закономерности влияния химического состава питательной среды и физико-химических условий культивирования на процесс образования внеклеточных углеводородов сульфатредуци-
рующими бактериями;
изучить механизм синтеза внеклеточных углеводородов Desulfovibrio desulfuricans;
исследовать процесс образования углеводородов в природных объектах, содержащих сульфатредуцирующие бактерии.
Научная новизна. Показана способность сульфатреАудирующих бактерий, принадлежащих к разным метаболическим типам, к синтезу внеклеточных углеводородов, включающему широкий спектр алканов от Сц до Сг4- Установлено, что синтез углеводородов происходит в условиях гетеротрофного, литогетеро-трофного и автотрофного роста бактерий. Однако наибольшее их количество образуется в условиях роста клеток на среде с лактатом в атмосфере Н2+СО2 с минимальным количеством сульфатов в питательной среде. Определено, что наиболее активным продуцентом углеводородов среди изученных видов бактерий, является Desulfovibrio desulfuricans. Методами газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа установлено, что углеводороды, синтезируемые Desulfovibrio desulfuricans, представлены, в основном, алканами нормального строения. В отличие от внутриклеточных углеводородов, содержащих 70-80% отн. высокомолекулярных углеводородов (С25-С35)з максимальное количество внеклеточных углеводородов приходится на низкомолекулярную часть (Сц-С24 80% отн.).
Установлены закономерности влияния активирующих и ингибирующих факторов питательной среды и условий культивирования клеток на синтез углеводородов сульфатредуцирующими бактериями: наличие доноров и акцепторов электронов в пи-
тательной среде, соотношение C:N( присутствие фосфатов, влияние таких факторов, как Eh и рН, соотношения НггСОг в газовой фазе. Определена активность формиатдегидрогеназы у Desulfovibrio desulfuricans, изучен механизм синтеза внеклеточных углеводородов. С помощью меченых соединений (Н14С00Н, 14СН3СН0НСООН, СН3СН0Н14С00Н, СНз14С00Н, 14СН3С00Н, NaHa4C03, а также ЭТ20 и 3Тг) показано, что синтез углеводородов суль-фатредуцирующими бактериями осуществляется путем образования жирных кислот (формиата, ацетата) с последующим их восстановлением и конденсацией в углеводороды. В реакциях восстановления участвуют протоны водорода воды и молекулярный водород газовой фазы. Синтез углеводородов возможен только при низком С-290мВ)- С-360-мВ) окислительно-восстановительном потенциале среды.
Исследован процесс образования углеводородов в природных объектах Силы, грунт, пластовая вода, керны), содержащих сульфатредуцирующие бактерии. Установлены закономерности активации процессов синтеза углеводородов в образцах, содержащих большее количество сульфатредуцирующих бактерий и обогащенных органическим веществом, при наличии в газовой фазе Н2+С02.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволяют по-новому оценить многие важные научные и практические проблемы. Это прежде всего возможность современного образования углеводородов в природе и восполнения запасов углеводородного сырья. Расширение и дополнение сведений о физиологии сульфатредуцирующих бактерий, о цикле
углерода в природе. Необходимость разработки рациональных методов борьбы с коррозией металлов без резкого нарушения экосистем, отрицательно влияющих на жизнедеятельность сульфатредуцирующих бактерий.
Способность сульфатредуцирующих бактерий продуцировать внеклеточные углеводороды делает реальным осуществление микробиологического синтеза углеводородов в условиях производства. Метод получения углеводородов с помощью сульфатредуцирующих бактерий зарегистрирован в заявке N 4920514/14 с приоритетом от 01.02.91. На способ получения углеводородов с помощью сульфатредуцирующих бактерий получен патент RU 2027760 С1 от 23.07.93.
