Введение к работе
Актуальность
C.trachomatis - грамотрицательная бактерия с облигатным
внутриклеточным типом паразитирования. Этот патоген один из самых
распространенных возбудителей бактериальных инфекций,
передаваемых половым путем (ИППП). По данным ВОЗ заболеваемость урогенитальным хламидиозом (УГХ) за период с 2000 по 2006 гг. в развитых странах имеет тенденцию к возрастанию. Например, в Швеции показатели заболеваемости выросли с 218 до 376 на 100 тысяч населения.
Эпидемиологическая ситуация в России неблагоприятная: в период с 2000 по 2006 г регистрируется более 90 случаев УГХ на 100 тысяч населения, что составляет около 20% в структуре всех ИППП.
Официальная статистика не отражает истинной ситуации о распространении УГХ, т.к. не полностью учитываются случаи хронического течения болезни, при этом хроническая хламидийная инфекция имеет не только урогенитальную локализацию, но поражает также другие органы [Шинский Г. Э. и др., 1999; Мавров И. И., 2002].
Эпидемиологическая значимость хронических форм хламидиозов была доказана еще в работах А.А.Шаткина (1985г). Хламидии не являются представителями нормальной микрофлоры человека. Их обнаружение указывает на наличие инфекционного процесса, а отсутствие клинических симптомов заболевания определяет лишь временное равновесие, возникшее между паразитом и хозяином в условиях, ограничивающих, но не препятствующих размножению патогенного внутриклеточного микроорганизма. В этой связи, хроническая хламидийная инфекция является не менее опасной, чем ее манифестные формы и требует проведения лечебных и профилактических мероприятий.
Развитие хронических хламидиозов определяется в большей степени
адаптационными свойствами патогена и образованием его
персистирующих форм, обладающих весьма эффективными
механизмами инактивации защитных факторов организма хозяина и использования регуляторных путей клетки - хозяина для развития инфекционного процесса. Патогенетическое значение персистирующих форм хламидии определяется, в первую очередь, тем, что они представляют собой форму длительного выживания патогена в макроорганизме с сохранением патогенного потенциала. В то же время, персистирующие формы хламидии сами ответственны за развитие тяжелых иммунопатологических состояний вследствие постоянной
активации клеток иммунной системы, поддержания воспаления, а также влияния на многие внутриклеточные процессы.
Хроническая урогенитальная хламидийная инфекция, вызывает весьма
широкий спектр осложнений, связанных с диссеминацией C.trachomatis
из первичного очага инфекции в отдаленные органы. Это ведет к
развитию серьезных заболеваний как генитальной, так
экстрагенитальнои локализации, таких как: женское и мужское
бесплодие, патология беременности, синдром Рейтера,
офтальмохламидиоз, перигепатит, тазовый перитонит [Сафина О. Н., 2001; Молочков В. А., 2004; Peter N.,2004; Wollenhaupt J].
На данный момент достаточно хорошо изучены интраканаликулярный (восходящий), лимфогенный и интранатальный (при прохождении через родовые пути) пути распространения патогена. Экстрагенитальную патологию и внутриутробное инфицирование плода, обусловленные C.trachomatis, рассматривают как следствие диссеминации патогена гематогенным путем. Однако на сегодняшний день практически отсутствуют микробиологические исследования, доказывающие ключевую роль данного пути в развитии экстрагенитальных патологий хламидийной этиологии. В связи с этим, актуальным является детальное изучение механизмов распространения C.trachomatis гематогенным путем.
Отсутствие данных о возможности генерализации инфекционного процесса при урогенитальной хламидийной инфекции естественно ограничивает исследования по выявлению связи между C.trachomatis и хронической патологией различных органов. Однако в последние годы появилось много данных о том, что хронические инфекции, вызываемые внутриклеточными патогенами, лежат в основе ряда серьезных соматических патологий.
При хламидиозе отсутствуют специфические клинические симптомы, поэтому методы лабораторной диагностики имеют первостепенное значение. К настоящему времени проблема диагностики хронической формы хламидийной инфекции определяется несколькими факторами. Во-первых, персистирующие формы хламидий, ответственные за развитие хронических инфекций, с трудом выявляются с помощью классических микробиологических и иммунологических методов вследствие нарушения метаболизма и антигенной структуры. Во-вторых, при осложненных формах, связанных с восходящей и экстрагенитальнои инфекцией, возбудитель мало доступен для анализа. При этом постановка диагноза урогенитального хламидиоза возможна только при
обнаружении С.trachomatis прямыми методами. В-третьих, иммунный ответ при хронической хламидийной инфекции подавлен, что ограничивает возможность использования вспомогательных методов серологической диагностики.
В связи с этим, разработка новых методов детекции возбудителя на основе понимания механизмов распространения С.trachomatis в организме при хроническом течении инфекции приобретает особую актуальность.
Цель работы: изучение гематогенного пути распространения Chlamydia trachomatis и механизма инфицирования печени, разработка метода диагностики хронических форм хламидиоза экстрагенитальной локализации.
Для достижения поставленной цели были определены основные
задачи:
Изучить возможность гематогенного пути распространения С.trachomatis как фактора генерализации инфекции при осложненных формах УГХ.
Разработать метод диагностики хронических хламидиозов на основе ПЦР-РВ с использованием сыворотки крови в качестве материала для исследования.
Определить диагностическое значение выявления С. trachomatis в сыворотке крови при сравнении со стандартными методами диагностики урогенитального хламидиоза.
Изучить тропизм C.trachomatis к гепатоцитам, механизмы адгезии и интернализации в условиях in vitro, охарактеризовать клеточный ответ на развитие инфекции.
Оценить последствия циркуляции C.trachomatis в сыворотке крови и возможность инфицирования печени у больных .
Научная новизна - Впервые доказан гематогенный путь распространения C.trachomatis на основании культурального выделения инфекционных форм патогена в сыворотке крови больных с подтвержденным диагнозом УГХ. C.trachomatis, выделяемая из сыворотки крови, может быть определена как внеклеточная инфекционная форма персистирующих in vivo хламидий.
- Впервые обнаружено, что у пациентов с хроническими и осложненными формами заболеваний урогенитального тракта (УГТ) C.trachomatis в сыворотке крови обнаруживаются значительно чаще, чем в соскобном материале из органов УГТ.
- При моделировании инфекционного процесса на первичных
гепатоцитах крыс и на перевиваемой линии клеток гепатокарциномы
человека впервые был показан тропизм C.trachomatis к клеткам печени
(гепатоцитам) и изучен механизм адгезии и интернализации за счет
связывания патогена с белком АроВ липопротеинов с последующим
взаимодействием данного комплекса с рецепторами гепатоцитов для
ЛПНП. Было выявлено, что инфекция C.trachomatis в клетках
гепатокарциномы приводила к зависимому от дозы инфекционного
агента подавлению экспрессии гена, кодирующего рецептор ЛПНП.
- Впервые показана возможность инфицирования клеток печени
возбудителем урогенитального хламидиоза. При исследовании
клинического материала от больных было выявлено, что
циркулирующий в крови больных возбудитель - C.trachomatis в 55 %
случаев может диссеминировать в печень.
Практическая значимость
Выявление C.trachomatis в сыворотке крови больных, особенно в случаях хронических и осложненных форм хламидиоза, имеет важное диагностическое значение, поскольку позволяет использовать принципиально новый подход прямого выявления возбудителя вне зависимости от локализации очага инфекции. Разработан метод прямого выявления хламидий с использованием сыворотки крови. Его основой является оптимизированная методика выделения ДНК патогена из сыворотки крови и детекция C.trachomatis с помощью разработанного метода количественного анализа содержания хламидий в клиническом материале с помощью ПЦР-РВ. Этот метод может быть использован для диагностики хронических и экстрагенитальных форм хламидийной инфекции.
Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Метод детекции ДНК Chlamydia trachomatis в сыворотке крови количественным методом ПЦР-РВ», утвержденных 25 февраля 20 Юг на совете по внедрению научных достижений в практуку НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (выписка из протокола №12).
Основные положения, выносимые на защиту:
Доказан гематогенный путь распространения C.trachomatis на основе выявления инфекционных внеклеточных форм возбудителя в сыворотке крови больных с УГХ.
Разработан метод диагностики хронических хламидиозов с использованием сыворотки крови в качестве материала для анализа и детекцией ДНК C.trachomatis с помощью ПЦР-РВ.
Показана более высокая эффективность выделения ДНК хламидий из сыворотки крови у больных с хроническими заболеваниями урогенитального тракта, а так же с осложненными формами хламидиоза экстрагенитальной локализации в сравнении с результатами выявления ДНК патогена в соскобном материале из органов УГТ.
Показан тропизм хламидий к гепатоцитам и изучены механизмы адгезии и интернализации за счет связывания патогена с АроВ белком липопротеинов с последующим взаимодействием с рецепторами гепатоцитов для ЛПНП.
Показана возможность инфицирования С.trachomatis тканей печени больных при циркуляции возбудителя в сыворотке крови.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней-2007» (Москва, 28-30 ноября, 2007), IV международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008).
Апробация диссертации состоялась на заседании Отдела Медицинской микробиологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 17 февраля 2010г.
Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 листах и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 21 рисунком. Список использованной литературы включает в себя 161 источник, из них 35 отечественных авторов и 126 зарубежных авторов. Собственные исследования
