Содержание к диссертации
Введение
1 Глава 1 62
Выявление C.trachomatis в сыворотке крови больных . 62
1.1. Микробиологическое выделение C.trachomatis 63
1.2. Детекция ДНК C.trachomatis в культуре клеток, инфицированных образцами сывороток больных 64
1.3. Электронно-микроскопическая характеристика циркулирующих в крови хламидий... 69
1.4. Имму но цитохимическая детекция ретикулярных и элементарных тел в препаратах сыворотки крови больных. 71
1.5. Опсонизация внеклеточных форм хламидий в сыворотке 72
1.6. Культивирование изолятов Ctrachomatis из сыворотки крови . 73
2 Глава 2 75
Разработка нового подхода к диагностике хронических хламидиозов с использованием сыворотки крови 75
2.1 Подбор наиболее эффективного метода выделения ДНК из сыворотки крови 75
2.2 Отработка метода выделения и детекции Ctrachomatis в сыворотке крови на клиническом материале. 83
2.3 Параллельное выявление Ctrachomatis в соскобах и сыворотке крови методом ПЦРу больных с различными формами урогенитальной и экстрагенитальной патологии 84
3 Глава 3 90
Изучение тропизма Ctrachomatis к гепатоцитам в условиях in vitro 90
3.1 Изучение связывания Ctrachomatis сЛПНП 91
3.2 Изучение тропизма Ctrachomatis к клеткам печени 92
3.3 Доказательство липопротеин- опосредованного транспорта Ctrachomatis в гепатоциты в условиях in vitro 95
3.4 Влияние инфекции на экспрессию генов эукариотических клеток. 97
4 Глава 4 99
Выявление Ctrachomatis в тканях печени 99
VI. Обсуждение 103
VI. Выводы
VII. Список литературы 115
- Детекция ДНК C.trachomatis в культуре клеток, инфицированных образцами сывороток больных
- Культивирование изолятов Ctrachomatis из сыворотки крови
- Подбор наиболее эффективного метода выделения ДНК из сыворотки крови
- Изучение тропизма Ctrachomatis к клеткам печени
Детекция ДНК C.trachomatis в культуре клеток, инфицированных образцами сывороток больных
Клетки HepG2 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки и 2мМ глутамина в термостате (37 С, 5% СОг). Заражение проводили в 6-ти луночном планшете штаммом L2/Bu434 в соотношениях ВОЕ: клетка 1:1 и 2:1 в среде DMEM с добавлением 0.4% глюкозы без добавления фетальной сыворотки и циклогексимида и центрифугировали при 1500 тыс/об в течение часа. Планшет инкубировали при 37 С, 5% СОг в течение 24, 48, 72 часов.
Инфицированный C.trachomatis клеточный монослой фиксировали метанолом. Для выявления хламидий пермобилизованньїе клетки окрашивали моноклональными антителами ХлаМоноСкрин к ЛПС (ООО «Ниармедик Плюс»,Москва). Хламидийные включения определяли с помощью флуресцентного микроскопа Nikon Eclipse 50i при XI350 увеличении. клеток HepG2. С целью создания количественного теста для выявления уровня инфекции был разработан метод оценки процента инфицированных клеток с помощью проточной цитометрии. Процент инфицированных клеток оценивали по уровню свечения специфичного флуоресцентного красителя ФИТЦ при связывании меченых моноклональных антител к ЛПС хламидий. Для определения процента инфицированных клеток монослой из лунок механически снимали 0.1 М раствором ФСБ, переносили суспензию клеток в пробирки и после их однократного центрифугирования (3000 об/мин, 10 мин) и удаления надосадка проводили фиксацию 70% раствором этанола в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее проводилась двукратная отмывка в ФСБ. После удаления супернатанта клетки окрашивали специфическими антихламидийными Ат, меченными ФИТЦ. Подсчет процента инфицированных клеток (с высоким уровнем флуоресценции) проводился на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur с использованием программы CellQuest Pro. В каждом образце измерялось не менее 5x103 клеток, соответствующем по характеристикам светорассеяния жизнеспособным клеткам. V. РЕЗУЛЬТАТЫ
С.trachomatis вызывает тяжелые хронические заболевания не только урогенитальной сферы, но и заболевания иной локализации, среди которых синдром Рейтера, офтальмохламидиоз, перигепатит, холецистит, тазовый перитонит. Доказанный к настоящему времени интракананикулярный путь распространения возбудителя в организме плохо объясняет развитие таких патологий. Возможность гематогенного пути распространения возбудителя поддерживается многими клиницистами, однако прямых доказательств такого пути распространения патогена пока нет.
Изучение способности C.trachomatis инфицировать клетки крови выявило, что при заражении макрофагов, полученных от здоровых доноров, развивается продуктивная инфекция [115]. Данный факт был подтвержден исследованиями клеток периферической крови от больных с осложненным урогенитальным хламидиозом. При электронно-микроскопическом исследовании препаратов маточных труб больных хламидийным сальпингитом были обнаружены ЭТ C.trachomatis в моноцитах и просвете сосудов микрогемоциркуляторного русла. Таким образом, исследования, проведенные в условиях in vitro, позволили предполагать возможность распространения патогена с током крови. В наших исследованиях была поставлена задача изучения возможности генерализации C.trachomatis инфекции при ее хроническом течении и выявления особенностей и последствий системного распространения возбудителя. В качестве материала для исследования от больных с урогенитальным хламидиозом была использована сыворотка крови. Образцы сывороток крови исследовались с помощью комплекса методов выявления С. trachomatis. Среди них: - микробиологическое выделение на основе культивирования в клетках - детекция патогена методом прямой иммунофлуоресценции - выявление с помощью ПЦР -видовая идентификация на основе секвенирования фрагментов 16S рРНК -электронномикроскопическое исследование. С этой целью нами была обследована группа больных из 40 человек (18 мужчин и 22 женщины) с установленным диагнозом урогенитального хламидиоза. Диагноз был поставлен на основании выявления ДНК С.trachomatis с помощью ПЦР в соскобном материале из уретры или цервикального канала. Для выявления патогена в крови у пациентов 1 мл сыворотки крови центрифугировали при 14 000об/мин и полученным осадком заражали клетки линии McCoy. После 72 часов инкубирования клетки окрашивали родоспецифическими моноклональными антителами к ЛПС и видоспецифическими моноклональными антителами к белку МОМР С.trachomatis. В качестве контроля были использованы препараты, приготовленные из лабораторного штамма С.trachomatis BU-434 биовара лимфогранулемы (LGV) серовар L2 (АТСС VR 902В). В 31 случае из 40 проанализированных сывороток были выявлены единичные внутриклеточные хламидийные включения мелких и средних размеров. Интенсивность флуоресценции при окрашивании выявляемых включений двумя препаратами моноклональных антител была значительно слабее, чем в контроле. По размерам, форме и характеру окрашивания выделенные формы хламидии напоминали атипичные или персистирующие формы, получаемые либо в условиях их индукции in vitro, либо выделяемые от больных из соскобного материала при хроническом течении инфекции.
Культивирование изолятов Ctrachomatis из сыворотки крови
Согласно нормативным документам, диагноз урогенитального хламидиоза может быть поставлен только на основании прямого выявления самого возбудителя в клиническом материале. В случае хламидийной инфекции, вызванной С. trachomatis, материалом для исследования может служить соскобный материал урогенитального тракта, биоптаты органов малого таза, моча, соскоб с конъюнктивы глаза. Однако, в случаях хронического урогенитального хламидиоза, при его восходящем течении и при экстрагенитальной локализации выявить возбудитель достаточно сложно, т.к. исследование соскобов урогенитального тракта малоэффективно. Тем самым, в настоящее время практически отсутствуют методы диагностики хронических форм хламидийной инфекции.
В связи с этим нами был разработан метод прямого выявления хламидий с использованием сыворотки крови. Его основой является выделение ДЬЖ патогена из сыворотки крови и детекция С.trachomatis с помощью ПЦР-РВ. Этот метод может быть использован для диагностики хронических и экстрагенитальных форм хламидийной инфекции.
Подбор наиболее эффективного метода выделения ДНК из сыворотки крови Первым этапом работы был подбор наиболее эффективного метода выделения ДНК и определение минимального объема образца, необходимого для получения детектируемых в ПЦР количеств генетического материала патогена. Нами были использованы два метода выделения: стандартный метод выделения ДНК фенол-хлороформом, преимуществами которого являются возможность экстракции ДНК из 1 мл исследуемого образца и растворение ДНК в минимальном объеме элюирующего буфера от 25 до 50 мкл. - с помощью коммерческого набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Inc) с установленным максимальным объемом исследуемой пробы 200 мкл. Для сравнения эффективности выделения ДНК данными системами, мы отобрали 6 сывороток, предварительно проанализированные культуральным методом на наличие С.trachomatis. В трех из них была обнаружена С. trachomatis, три образца были отрицательными. Выделение ДНК из образцов проводили двумя сравниваемыми между собой методами согласно стандартным протоколам. Полученную ДНК анализировали с помощью ПЦР-РВ. Количественный анализ содержания C.trachomatis в сыворотке методом ПЦР-РВ. Выделение ДНК из 1 мл сыворотки крови фенол-хлороформом и из 200мкл набором QIAamp DNA Blood Mini Kit C.trachomatis в сыворотке крови при использовании двух методик выделения (фенол-хлороформ, набор QIAamp DNA Blood Mini Kit). В трех положительных по культуральному методу сыворотках, выделенных фенол-хлороформом, с помощью ПЦР-РВ была обнаружена C.trachomatis. Было выявлено, что хламидии присутствуют в сыворотке крови в количестве от 3.1 10 до - 8 103 хламидий/мл. При экстракции ДНК из 200 мкл этих же сывороток набором QIAamp DNA Blood Mini Kit патоген обнаружен не был. В 3 сыворотках, отрицательных по культуральному тесту, С. trachomatis не детектировалась ни при одном методе выделения. Данная работа выявила, что выделение ДНК из 200 мкл сыворотки крови является неэффективным, вследствие небольших количеств возбудителя в крови. Таким образом, учитывая чувствительность используемой тест-системы ГЩР-РВ, составляющей 50 коп/пробу, для получения воспроизводимых результатов минимально необходимый объем материала для анализа должен составлять не менее 1мл. Соответственно, это ограничивает возможность использования набора QIAamp DNA Blood Mini Kit без предварительной концентрации материала. Выделение ДНК из материала фенол-хлороформом, в свою очередь, также имеет ограничения, так как данный метод не стандартизирован и не удобен для обработки большого количества проб. В связи с этим, возникла необходимость в концентрации исследуемого материала до объема не более 200 мкл. Нами были отработаны условия концентрации сыворотки крови путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 45 минут. В результате были получены концентрированные образцы объемом 200 мкл, пригодные для эффективного выделения ДНК набором QIAamp DNA Blood Mini Kit. Для оценки эффективности данного метода из шести ранее исследованных сывороток крови, после предварительного центрифугирования была выделена ДНК набором QIAamp DNA Blood Mini Kit. QIAamp DNA Blood Mini Kit - набор, обеспечивающий минимальные временные затраты на процесс экстракции и позволяющий получать высокоочищенный препарат ДНК с максимальным выходом. Количественный анализ содержания C.trachomatis в образцах с помощью ПЦР-РВ выявил одинаковое содержание ДНК патогена в пробах как при экстракции ДНК фенол-хлороформом, так и при использовании коммерческой системы с предварительным концентрированием образца.
Подбор наиболее эффективного метода выделения ДНК из сыворотки крови
С целью отработки метода выявления патогена и количественного анализа содержания C.trachomatis в сыворотке по сравнению с соскобным материалом, нами была проанализирована группа пациентов (15 человек) с установленным диагнозом урогенитальный хламидиоз.
После взятия соскоба урогенитальный зонд помещали в пробирку с 500 мкл транспортной среды, образцы центрифугировали на 1000 об/мин 10 минут и отбирали ЗООмкл надосадка. Осадок ресуспендировали в 200 мкл оставшегося супернатанта. Далее выделение ДНК проводили по протоколу.
Экстракцию ДНК из сыворотки производили набором Qiagen Mini Extraction Kit из объема 1 мл с предварительным концентрированием образца до 200 мкл. Полученные образцы нуклеиновых кислот анализировали с помощью ПЦР-РВ.
Тем самым, количества хламидий, выявляемые в сыворотке, в среднем существенно меньше, чем в соскобном материале. При этом содержание C.trachomatis в сыворотке крови находится на пределе чувствительности тестирования с помощью ПЦР, что требует использования чувствительных методов выделения ДНК и чувствительной ПЦР системы. Апробированный нами подход позволял выявлять минимальные количества патогена в сыворотке крови с максимальной эффективностью, что дает возможность разрабатывать на его основе метод детекции возбудителя в сыворотке крови для диагностики хронических хламидиозов и ЭГП. Для оценки диагностической значимости выявления C.trachomatis в сыворотке крови при сравнении со стандартным методом постановки диагноза на основе выделения ДНК из соскоба, были исследованы пациенты с различными формами урогенитальной и экстрагенитальной патологии. У данных групп больных были исследованы урогенитальные соскобы и сыворотка крови с помощью ПЦР-РВ а также проведен анализ сыворотки крови на наличие специфических антител классов G/M/A к белку наружной мембраны (МОМР) C.trachomatis и класса G к белку теплового шока, Для параллельного выявления C.trachomatis в соскобах и сыворотке крови методом ПНР нами были выбраны следующие группы больных: человек с хроническими заболеваниями урогенитального тракта и осложненными формами восходящей инфекции (хронический хламидиоз, хронический аднексит, сальпиногоофорит, цервицит, адеомиоз, бесплодие), у которых были собраны данные анамнеза за последние 10 лет; человека с артрологической патологией (болезнь Бехтерева, моносиновит, остеоартроз, псориатический артрит, синдром Рейтера, псориатический полиартрит, ревматоидный олигоартрит); - 20 человек контрольная группа (студенты без жалоб на инфекцию мочеполовой системы). При обследовании клинического материала от больных (соскобный материал и сыворотка крови) с хроническими заболеваниями урогенитального тракта методом ПЦР, C.trachomatis была обнаружена у 22 (61,1%) человек в У всех 6 пациентов, положительных по соскобному материалу, C.trachomatis выявлялась также в сыворотке. Хламидиоз в анамнезе за последние 2-10 лет был у 20 из 36 человек. Среди них C.trachomatis в сыворотке в момент обследования была обнаружена у 14 человек (70%), в соскобе - у трех (15%). При выявлении специфических антител классов G/M/A к белку наружной мембраны (МОМР) C.trachomatis у больных с урогенитальной патологией было показано, что диагностически значимые титры IgG детектировались у 7 (19,5%) из 36 человек, у одного из них одновременно IgG и IgA; IgM не были выявлены ни у одного пациента. Из 7 серопозитивных ни у одного пациента С.trachomatis не была выявлена в соскобном материале, у 6 из них C.trachomatis была выявлена в сыворотке крови методом ПЦР. У всех 6 больных, у которых инфекция была выявлена в нижних отделах урогенитального тракта, антитела отсутствовали. При сравнении выявления специфических антител и C.trachomatis в сыворотке крови было установлено, что только у 7 (32%) из 22 положительных на наличие инфекции в сыворотке обнаруживались диагностические титры антител. При определении антител IgG к белку теплового шока Hsp-60 C.trachomatis, являющихся одним из маркеров хронической хламидийной инфекции, было выявлено 5 серопозитивных больных, для троих (23 %) из которых наличие хламидий в сыворотке крови было также подтверждено методом ПЦР-РВ. Таким образом, при обследовании клинического материала от больных с хроническими заболеваниями урогенитального тракта методом ПЦР в сыворотке крови C.trachomatis выявлялась в 2-3,5 раза чаще, чем в соскобном материале. Определение дигностических титров иммуноглобулинов было малоэффективно для диагностики хронических форм хламидиоза. Неэффективность серологической диагностики связана с нарушенем метаболизма и антигенной структуры C.trachomatis вследствие чего не образуются антитела к ЛПС и хламидийному белку МОМР. Более эффективное выявление возбудителя в сыворотке крови при сравнении с выявлением в соскобном материале было показано также для группы больных с артрологической патологией. У 33 пациентов в соскобе из урогенитального тракта C.trachomatis была обнаружена у 11 (33,3%) больных, в то время как в сыворотке - у 21 (63,5%). При этом, у 9 человек, положительных по наличию C.trachomatis в соскобе, патоген был таюке детектирован в сыворотке крови.
Изучение тропизма Ctrachomatis к клеткам печени
Урогенитальная хламидийная инфекция является актуальной проблемой для изучения как для практических врачей, так и для ученых-исследователей уже в течение многих лет. Сведения об этом возбудителе за последние годы существенно изменились и расширились. В настоящее время с хламидиями связывают заболевания мочеполовых органов, глаз, суставов, респираторные поражения и ряд системных проявлений. Исследования и клинические наблюдения показывают, что хламидий могут обусловливать бесплодие, вызывать патологию беременности, болезни новорожденных и детей раннего возраста. Значение урогенитальных хламидиозов в инфекционной патологии человека определяется непосредственными многоочаговыми поражениями мочеполовой системы и их последствиями, влияющими на репродуктивную функцию, а также потенциальной опасностью стать источником хламидийных инфекций экстрагенитальной локализации.
Урогенитальная хламидийная инфекция наиболее часто принимает подострую, хроническую или персистентную форму, реже вызывает острые воспалительные процессы. Клиническая картина заболевания зависит от времени, прошедшего с момента инфицирования, топографии поражения и выраженности местных и общих реакций макроорганизма. Эти факторы обусловливают разнообразие клинических проявлений манифестных форм хламидийной инфекции, также как и ее бессимптомное течение.
Возможность развития хронических хламидийных инфекций связана со способностью патогена переходить в персистирующее состояние в клетке хозяина и длительно там выживать. Условия индукции таких персистирующих форм и молекулярные механизмы их образования к настоящему времени детально изучены на моделях клеточных культур. В исследованиях in vitro было установлено, что персистирующие формы хламидий являются метаболически активными, жизнеспособными, но некультивируемыми формами патогена в связи с тем, что у них нарушен процесс образования инфекционных частиц - ЭТ. У этих форм микроорганизма изменена не только морфология, но также и экспрессия ключевых хламидийных антигенов. У персистирующих или аберрантных форм отмечается уменьшение синтеза основных структурных компонентов, придающих особую прочность клеточной стенке (МОМР, белок клеточной стенки массой 60 кДа и липополисахарид (ЛПС)). На этом фоне идет беспрерывный синтез белка теплового шока (hsp 60). Данный белок запускает перекрестный иммунный ответ, что является важным моментом в иммунопатогенезе хронической инфекции и поддержании воспалительной реакции.
Нарушение метаболизма у персистирующих форм приводит к приобретению резистентности к основным группам используемых при лечении хламидиоза антибиотиков. Кроме того, эти формы хламидий реализуют механизмы инактивации клеточного ответа, такие как подавление апоптоза клетки хозяина, инактивация сигнал-проводящих путей, нарушение механизмов презентации антигенов.
Предполагается, что в условиях in vivo персистенция хламидий индуцируется под влиянием цитокинов воспаления и/или регуляторных цитокинов иммунного ответа и переход в персистирующее состояние является основной формой взаимодействия с организмом хозяина при хроническом течении инфекции. Однако, это состояние патогена в условиях макроорганизма остается еще практически не изученным из-за объективных трудностей выявления таких измененных форм и изучения механизмов их образования.
Урогенитальный хламидиоз характеризуется весьма широким спектром осложнений, связанных с диссеминацией С.trachomatis из первичного очага инфекции в удаленные органы. На данный момент достаточно хорошо изучены интраканаликулярный (восходящий), лимфогенный и интранатальный (при прохождении через родовые пути) пути распространения патогена. Тем не менее, экстрагенитальную патологию, такую как артриты и внутриутробное инфицирование плода, обусловленные С.trachomatis, многие клиницисты рассматривают как следствие диссеминации патогена гематогенным путем. Однако, на сегодняшний день существует достаточно ограниченное количество исследований, доказывающих ключевую роль данного пути в развитии экстрагенитальных патологий хламидийной этиологии. В связи с этим, актуальным является детальное изучение механизмов распространения С.trachomatis гематогенным путем.
Так, в исследованиях Gerard Н.С. et.al. (1998) на модели культуры человеческих моноцитов периферической крови была показана возможность персистирования в клетках крови С.trachomatis. У микроорганизмов отмечалась массивная экспрессия белка HSP60 при сниженной продукции белков хламидийной клеточной стенки. При этом хламидии имели внутриклеточную локализацию, атипичную форму, были метаболически активны, но не продуцировали новых элементарных телец. Авторы сделали вывод о том, что, вероятно, инфекция моноцитов периферической крови хламидиями может способствовать диссеминации хламидийной инфекции из урогенитального очага.
В другом исследовании на клиническом материале была показана возможность образования инфекционных частиц — ЭТ в моноцитах периферической крови от больных с осложненным урогенитальным хламидиозом. При электронно-микроскопическом исследовании препаратов маточных труб больных хламидийным сальпингитом были обнаружены ЭТ С. trachomatis в моноцитах и просвете сосудов микрогемоциркуляторного русла. Таким образом, эти немногочисленные исследования позволяют предполагать возможность распространения патогена с током крови и поражать различные органы, удаленные от первичного очага инфекции.
В данной работе первой поставленной задачей явилась возможность выявления С. trachomatis в крови больных с урогенитальным хламидиозом. Образцом для исследования являлась сыворотка крови. В ходе исследования образцов сывороток больных с диагнозом УГХ на наличие хламидий, микробиологическими и молекулярными методами было установлено, что в крови в значительном проценте случаев присутствует возбудитель УГХ. При этом методом ПЦР-РВ C.trachomatis выявлялась в 92,5% случаев, а культуральным методом - в 77,5% случаев.
Выделяемые микробиологическим методом хламидий вырастали в виде единичных внутриклеточных хламидийных включений мелких и средних размеров, характерных для персистирующих форм. Электронно-микроскопическое исследование осадков сывороток позволило выявить бактериальные клетки, имеющие характерную для элементарных телец хламидий структуру, а именно: двухслойную мембрану клеточной стенки и электронно-плотную цитоплазму. Размеры клеток колебались в диапазоне от 0,2 до 0,3 мкм.
Таким образом, микробиологические и электронно-микроскопическое исследования показали, что C.trachomatis, выделяемая из сыворотки крови, может быть определена как внеклеточная инфекционная форма персистирующих in vivo хламидий.