Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1. Бактерии-деструкторы (хлор)ароматических соединений 16
Бактерии-деструкторы би'фенила/ПХБ 16
Бактерии-деструкторы хлорбензойных кислот 20
Бактерии-деструкторы фенола/хлорфенолов 22
1.2. Метаболические пути деструкции ароматических соединений
различного строения у бактерий 26
Катаболизм бифенила/ПХБ аэробными бактериями 27
Пути метаболизма хлорбензойных кислот 28
Пути аэробного разложения фенолов/хлорфенолов 31
1.2.4. Пути метаболизма пирокатехина, хлор- и метилзамещенных
пирокатехинов 32
1.3. Ключевые ферменты деструкции ароматических соединений 40
1.3.1. Бифенил 2,3-диоксигеназа - ключевой фермент разложения
бифенила/ПХБ 40
1.3.2. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа — ключевой фермент деструкции
пирокатехинов 45
1.4. Бактериальные генетические системы разложения ароматических
соединений 48
1.4.1. Организация генов деструкции бифенила/ПХБ 48
1.4.2. Организация генов, контролирующих дегалогенирование
4-хлорбензойной кислоты 53
1.5. Бактерии порядка Actinomycetales как перспективные деструкторы
ксенобиотиков 56
з
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 59
Бактериальные штаммы 59
Среды и условия культивирования 60
2.3. Определение субстратной специфичности бактериальных
штаммов 62
2.4. Определение ростовых характеристик 62
2.5. Морфологические и физиолого-биохимические методы
идентификации бактерий 63
Анализ хемотаксономических признаков бактерий 65
Молекулярно-генетические методы 65
Выделение тотальной ДНК 65
Электрофорез ДНК в агарозном геле 66
REP-ПЦР 66
Амплификация гена 16S рРНК 66
Скрининг функциональных генов с использованием ПЦР 67
Анализ полиморфизма длин рестрикционых фрагментов (ПДРФ-анализ) 68
Определение и анализ нуклеотидных последовательностей 68
2.8. Методы очистки и характеристики ферментов 69
Приготовление бесклеточного экстракта 69
Определение активности ферментов 70
Ds-Na-ПААГ-электрофорез 71
Выделение ферментов из биомассы Rhodococcus ruber Р25, выращенной на 4-метилбензойной кислоте 71
Выделение ферментов из биомассы Rhodococcus opacus IG, выращенной на феноле 73
Определение физико-химических свойств ферментов 74
Анализ кинетических данных 74
2.9. Статистическая обработка данных 75
Глава 3. БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ БИФЕНИЛА 76
3.1. Идентификация грамположительных бактерий-деструкторов
бифенила 76
Бактерии рода Rhodococcus 76
Бактерии рода Janibacter 81
Штамм К109 - представитель ponaDietzia 82
Штамм Р24а - представитель рода Arthrobacter 83
3.2. Скрининг бактерий-деструкторов бифенила на способность
использовать некоторые моно- и полиароматические углеводороды в
качестве субстратов 84
Глава 4. ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ а-СУБЪЕДИНИЦЫ
ПОДСЕМЕЙСТВА БИФЕНИЛ/ТОЛУОЛ ДИОКСИГЕНАЗ,
БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ БИФЕНИЛА 87
Скрининг бактерий-деструкторов бифенила на наличие генов, кодирующих а-субъединицы подсемейства Б/Т ДО 87
Изучение полиморфизма генов, кодирующих а-субъединицы подсемейства Б/Т ДО 91
4.3. Анализ нуклеотидных последовательностей генов,
кодирующих а-субъединицы подсемейства Б/Т ДО 93
4.4. Анализ выведенных аминокислотных последовательностей
С-концевого домена а-субъединиц подсемейства Б/Т ДО 98
Глава 5. /сб-ГЕНЫ БАКТЕРИЙ ПОРЯДКА ACTINOMYCETALES,
КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ДЕГАЛОГЕНИРОВАНИЕ 4-ХЛОРБЕНЗОЙНОЙ
КИСЛОТЫ 105
5.1. Скрининг бактерий-деструкторов на наличие^с^-генов 105
5.2. Исследование fcb-теаов бактерий родов Rhodococcus и
Arthrobacter 107
Глава 6. БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ ДЕСТРУКЦИИ
МОНОАРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ У БАКТЕРИЙ РОДА
RHODOCOCCUS 113
6.1. Рост бактерий рода Rhodococcus на моноароматических
субстратах 113
6.2. Выделение и характеристика ферментов расщепления
4-метилпирокатехина штамма Rhodococcus ruber Р25, индуцирующихся
при росте на 4-метилбензойной кислоте 117
6.3. Выделение и характеристика ферментов расщепления пирокатехина
штамма Rhodococcus opacus 1G, индуцирующихся при росте на
феноле 127
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 137
ВЫВОДЫ 141
ЛИТЕРАТУРА 143
ПРИЛОЖЕНИЯ 177
6 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АКО — аминокислотный остаток
БДГД - бифенил 1,2-дигидродиол
БДО - бифенил диоксигеназа
Б/Т ДО - бифенил/толуол диоксигеназы
ГОФДК — 2-гидрокси-6-оксо-6-фенилгекса-2,4-диеновая кислота
2,4Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
ДАПК — диаминопимелиновая кислота
диХБ - дихлорбифенил
диХБК - дихлорбензойная кислота
диХПК - дихлорпирокатехин
диХФ - дихлорфенолы
ДЛГ - диенлактонгидролаза
ДО - диоксигеназа
дНТФ - динуклеотид трифосфат
ЕЛГ - еноллактонгидролаза
MAP - малеилацетатредуктаза
4МБК (пара-МБК) - 4-метилбензойная кислота (иоря-метилбензойная кислота)
МЛИ - муконолактонизомераза
моноХФ - монохлорфенол
ЗМПК - 3-метилпирокатехин
4МПК - 4-метилпирокатехин
МЦИ — муконатциклоизомераза
НК - нуклеотидный
ПАУ - полициклические ароматические углеводороды
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПК — пирокатехин (катехол)
ПК 1,2-ДО - пирокатехин 1,2-диоксигеназа
пентаХФ - пентахлорфенол
ПК 2,3-ДО — пирокатехин 2,3-диоксигеназа (мета-пирокатехин диоксигеназа)
ПОБК - лора-оксибензойная кислота
ПХФ - полихлорированные фенолы
ПХБ - полихлорированные бифенилы
2,4,5Т - 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота
тетраХБ - тетрахлорбифенил
триХБ - трихлорбифенил
триХФ - трихлорфенол
ХБ - хлорбифенил
ХБК - хлорбензойная кислота
2ХБК (орто-ХБК) — 2-хлорбензойная кислота (opmo-хлорбензойная кислота)
ЗХБК (мета-ХБК) - 3-хлорбензойная кислота (жета-хлорбензойная кислота)
4ХБК (пара-ХБК) - 4-хлорбензойная кислота (иара-хлорбензойная кислота)
2ХМ - 2-хлормуконат
5ХМЛ - 5-хлормуконолактон
ХМЛИ - хлормуконолактонизомераза
ХМЦИ - хлормуконатциклоизомераза
ХПК 1,2-ДО-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа
2ХПК - 2-хлорпирокатехин
ЗХПК - 3-хлорпирокатехин
4ХПК - 4-хлорпирокатехин
ХФ - хлорфенол
2ХФ - 2-хлорфенол
ЗХФ - 3-хлорфенол
4ХФ - 4-хлорфенол
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
СТАВ (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) - бромид цетил-триметиламмония
ISP (Iron-sulfur protein) - железо-серный белок
ORF- Open reading frame (открытая рамка считывания)
SDS (Sodium dodecyl sulfate) - додецил сульфат натрия
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди ароматических углеводородов,
входящих в число распространенных химических загрязнителей окружающей
среды, имеются вещества, образующиеся в природных биохимических
процессах (фенолы, бифенил), а также соединения исключительно
антропогенного происхождения (галогензамещенные бифенилы и бензойные
кислоты - продукты их расщепления, галофенолы) (Bedard, 2003; Bajaj et al.,
2008). Благодаря устойчивости к физическим и химическим воздействиям
(галоген)ароматические соединения слабо подвержены абиотическому
разложению. Их высокая токсичность, способность накапливаться в организме
человека приводят к развитию ряда заболеваний, в том числе онкологических
(Faroon et al., 2003), что является причиной поиска эффективных способов
обезвреживания подобных поллютантов. Известно, что бактерии играют
основную роль в разложении (галоген)ароматических углеводородов в природе
и, таким образом, становятся все более перспективными объектами для
создания биотехнологий восстановления природной среды
(Gomez-De Jesus, 2009).
К настоящему времени хорошо исследованы грамотрицательные бактерии-деструкторы (галоген)ароматических соединений (Pieper, 2005; Field, Sierra-Alvarez, 2008). Грамположительные бактерии, в частности представители порядка Actinomycetales (класс Actinobacteria) (Stackebrandt et al., 1997), изучены в гораздо меньшей степени, хотя обладают обширным потенциалом в отношении разложения устойчивых ксенобиотиков, широко распространены в природных и антропогенных почвах, сохраняют метаболическую активность в разных диапазонах температур, рН и минерализации среды (Нестеренко и др., 1985; Ившина, 1997; Martinkova et al., 2009). Среди них описаны деструкторы бифенила/полихлорированных бифенилов (ПХБ), хлорбензойных кислот, фенольных соединений. Наиболее полно биохимические и генетические особенности катаболизма таких веществ исследованы у представителей рода Rhodococcus (Соляникова, 2007; Haggblom et al., 1988; Labbe et al. 1997; Takeda
et al., 2004). Информация о биодеградативных свойствах актиномицетов других родов, в том числе Arthrobacter, Dietzia, Janibacter, ограничена (Sierra et al., 2003; Abraham et al, 2005).
Большинство бифенилдеградирующих бактерий способны разлагать бифенил/ПХБ только до (хлор)бензойных кислот, дальнейшее разложение которых осуществляется другими группами бактерий (Unterman, 1996; Wiegel, Wu, 2000). Известно всего несколько природных штаммов грамотрицательных бактерий родов Burkholderia, Enter obacter, Pseudomonas, Ralstonia, осуществляющих полную деструкцию хлорированных бифенилов (Kim, Picardal, 2001; Adebusoye et al., 2007, 2008a), а также активный деструктор моно(поли)ароматических углеводородов Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ 896), выделенный сотрудниками нашей лаборатории (Плотникова и др., 2005). Изучение молекулярных основ разложения хлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот у штамма R. ruber Р25 представляет несомненный интерес. С другой стороны, в качестве одного из распространенных интермедиатов расщепления ароматических соединений, в том числе хлор(метил)замещенных бифенилов, бензойных кислот и фенольных соединений, выступает (замещенный)пирокатехин, раскрытие ароматического кольца которого является ключевой реакцией, осуществляемой дециклизующими диоксигеназами — пирокатехин диоксигеназами (Schlomann, 1994). Информация о ферментах о/?шо-расщепления метилзамещенных пирокатехинов и биохимических путях ор/яо-расщепления фенола у грамположительных бактерий весьма ограничена (Solyanikova, Golovleva, 2004; Bruce, Cain, 1988; Chzetal, 1998).
Цель настоящей работы — изучение молекулярно-генетических и биохимических основ деградации ароматических соединений разного строения - фенола, бифенила, хлор- и метилбензойных кислот бактериями порядка Actinomycetales, выделенными из техногеннозагрязненных почв.
Основные задачи исследования
Определить таксономическое положение бактерий-деструкторов бифенила/хлорбифенилов, выделенных из техногеннозагрязненных почв Пермского края.
Изучить разнообразие генов, кодирующих большую субъединицу диоксигеназ, гидроксилирующих бензольное кольцо ароматических соединений, бактерий-деструкторов бифенила/хлорбифенилов.
Исследовать гены бактерий родов Rhodococcus и Arthrobacter, контролирующие дегалогенирование ядря-хлорбензойной кислоты -промежуточного продукта разложения иора-хлорированных бифенилов.
Изучить биохимические пути деструкции иора-метилбензойной кислоты у штамма Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ 896).
Исследовать ключевые ферменты разложения фенола у штамма Rhodococcus opacus 1G.
Научная новизна. Определено таксономическое положение
грамположительных бактерий-деструкторов бифенила/хлорбифенилов,
выделенных из техногенных почв Пермского края. У бактерий родов Arthrobacter, Dietzia, Janibacter, Rhodococcus, способных к разложению бифенила, определены нуклеотидные последовательности, кодирующие каталитическую субъединицу диоксигеназ, гидроксилирующих бензольное кольцо ароматических соединений. На основании результатов исследования структуры и полиморфизма исследуемых фрагментов ДНК выявлены уникальные нуклеотидные последовательности, отличающиеся от гомологичных последовательностей известных бактерий-деструкторов ароматических соединений. Впервые у бактерий рода Rhodococcus обнаружены и охарактеризованы гены, кодирующие компоненты 4-хлорбензоат-дегалогеназы. Впервые у бактерий рода Rhodococcus выявлен новый тип ферментов, осуществляющих qpwo-расщепление ароматического кольца -метилпирокатехин 1,2-диоксигеназа. Выделены и охарактеризованы ключевые
11 ферменты оргао-расщепления фенола из клеток R. opacus 1G, отличающегося высокой биодеградативной активностью по отношению к этому соединению.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные
о разнообразии генов, кодирующих ключевые ферменты деструкции
моно(поли)ароматических соединений и их хлорпроизводных, у бактерий
порядка Actinomycetales вносят вклад в представления о закономерностях их
эволюции в направлении приспособления к разложению устойчивых
абиотических соединений. Нуклеотидные последовательности
функциональных генов исследуемых бактерий-деструкторов депонированы в
международной базе данных GenBank. Сведения о новом типе ферментов орто-
расщепления ароматического кольца расширяют представления о системах
деградации метилзамещенных ароматических соединений у
грамположительных бактерий. Особенности ключевых ферментов деструкции фенола штамма R. opacus 1G позволяют использовать его в системах очистки промышленных стоков, содержащих фенольные соединения, в качестве перспективного деструктора. На основании полученных данных разработан метод разложения фенола иммобилизованными клетками R. opacus 1G в установке колоночного типа (Шумкова и др., 2009). Полученные знания о новых генетических элементах и биохимических путях разложения устойчивых ксенобиотиков могут применяться при создании генноинженерных штаммов, обладающих необходимым метаболическим потенциалом, или получении ферментов с заданными свойствами для возможного их применения в биотехнологических целях. Материалы диссертации используются в лекционных курсах на кафедрах микробиологии и иммунологии, ботаники и генетики растений Пермского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Бактерии-деструкторы бифенила/хлорированных бифенилов, выделенные из техногеннозагрязненных почв Пермского края, принадлежат к родам Arthrobacter, Dietzia, Janibacter и Rhodococcus порядка Actinomycetales.
Бактерии порядка Actinomycetales характеризуются разнообразием генов, контролирующих начальный этап деструкции ароматических соединений - гидроксилирование бензольного кольца. Выявленные нуклеотидные последовательности представителей рода Rhodococcus гомологичны на 98-99% bphAl генам подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ известных бактерий-деструкторов бифенила/ПХБ этого рода, тогда как бактерии родов Arthrobacter и Janibacter содержат уникальные последовательности, отличающиеся от гомологичных генов известных диоксигеназ данного подсемейства.
Деструктор хлорбифенилов Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ 896) содержит fcb-тетл, контролирующие дегалогенирование яяра-хлорбензойной кислоты, не описанные ранее у бактерий этого рода. Сходство генов fcbA и/сЬВ с гомологичными нуклеотидными последовательностями известных деструкторов яяра-хлорбензойной кислоты рода Arthrobacter составляет 98% и 99%, соответственно.
У исследуемых бактерий рода Rhodococcus, обладающих широкой субстратной специфичностью по отношению к моно(поли)ароматическим углеводородам и их хлор(метил)производным, выявлены различные пирокатехин 1,2-диоксигеназы, осуществляющие орто-расщепление ароматического кольца. В клетках штамма Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ 896) обнаружен фермент нового типа — метилпирокатехин 1,2-диоксигеназа, не описанный ранее для грамположительных бактерий.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были представлены на 10-й, 11-й и 12-й международной школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», г. Пущино (2006, 2007, 2008); молодежной конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», г. Москва (2007); международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера», г. Москва (2007); региональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Екатеринург-Пермь (2007); III
международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал, ICOMID 2008», г. Пермь (2008) и международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», г. Минск (2008).
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах печатного текста, иллюстрирована 35 рисунками и 19 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 287 наименований, и приложений.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических соединений бактерий, перспективных для биотехнологии» (номер государственной регистрации НИР 0120.0406511). Исследования поддержаны грантами РФФИ (№ 04-04-96042-р_урал_а, №07-04-97625-р_урал_офи), Программой интеграционных фундаментальных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с учеными СО РАН (проект «Микробные сообщества экстремальных экосистем»).
