Введение к работе
Актуальность проблемы. Бактерии рода Azospirillum являются модельным объектом в исследованиях молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия растений и микроорганизмов. Азоспириллы – ризобактерии, стимулирующие рост и развитие растений (PGPR – Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), благодаря своей способности к фиксации атмосферного азота, продукции фитогормонов, контролю фитопатогенов и др. (Berg, 2009; , , 2009). Существование в гетерогенных условиях почвы, смена экологических ниш (почва – ризосфера – растение) требуют от бактерий богатого набора адаптивных способностей.
Наличие специализированных двигательных органелл, наряду со способностью реагировать на постоянно изменяющиеся условия окружающей среды посредством тактических реакций, существенно расширяет адаптационные возможности бактерий, живущих в разнообразных местах обитания (Armitage 1992; Кацы, 1996; Дебабов, 1999; Vladimirov, Sourjik, 2009). Эффективность экспансии микроорганизмов повышается в результате перехода индивидуально движущихся клеток к коллективной миграции (Henrichsen, 1972; Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). В настоящее время описано значительное количество типов индивидуальной и коллективной подвижности микроорганизмов (плавание, роение, скольжение, тянущая подвижность и др.). Особенности совместного перемещения микроорганизмов определяются механизмами, обеспечивающими движение; межклеточными контактами, обусловленными мажорными компонентами клеточной поверхности; а в некоторых случаях зависят от продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003). Генетико-физиологический анализ изменений в подвижности бактерий и архитектуре их клеточной поверхности необходим для выяснения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.
Исследование подвижности и хемотаксиса бактерий является одной из динамично развивающихся областей современной микробиологии. Столь пристальное внимание к проблеме во многом вызвано тем обстоятельством, что на сравнительно простой биологической системе, каковой является бактериальная клетка, можно установить закономерности, лежащие в основе поведенческих реакций, которые можно экстраполировать на более сложные системы (Adler, 1987; Иваницкий, 1999; Олескин, 2009). Наряду с классическими объектами Escherichia coli и Salmonella typhimurium внимание исследователей привлекают и почвенные бактерии. Именно у них обнаружены более сложные, чем у Enterobacteriaceae, хемосенсорные системы, большее разнообразие двигательных органелл и механизмов, приводящих клетки в движение. Усложнение организации систем подвижности и хемотаксиса у почвенных бактерий считают отражением высокой пластичности их метаболизма (Manson et al., 1998; Кацы, 2003).
В природных экосистемах большинство бактерий существуют в виде прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложный строго регулируемый биологический процесс. Формирование микроорганизмами биопленочных сообществ является одной из стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в инфицируемых макроорганизмах. В составе биопленок бактерии объединены сложными межклеточными связями и во многом функционально сходны с многоклеточными организмами (Shapiro, 1998; Ильина с соавт., 2004; Dobretsov et al., 2009). Учитывая то обстоятельство, что в случае ассоциативного взаимодействия не происходит образования каких-либо специфических структур, наподобие клубеньков, характерных для бобово–ризобиального симбиоза (Pedrosa, 1988), формирование азоспириллами биопленок может играть существенную роль в успешном функционировании ассоциации.
В последнее десятилетие интенсивное изучение разнообразных процессов, реализуемых при наличии достаточной плотности популяции микроорганизмов (“ощущение кворума”, формирование биопленок или плодовых тел, различные способы коллективной подвижности, синтез экзоферментов, конъюгативный перенос плазмид и пр.), вышло на качественно новый теоретический и методический уровень. В 2005 г. для данной области исследований предложено название “социомикробиология” (Parsek, Greenberg, 2005). В обзоре А.В. Олескина (2009) отмечено, что бактерии проявляют различные формы коллективного поведения (кооперацию, координированную агрессию и избегание); бактериальные системы характеризуются контактной и дистантной коммуникацией; микроорганизмы формируют надклеточные системы, которые можно рассматривать как бактериальные биосоциальные системы, по аналогии с сообществами животных. Бактериальные биосоциальные системы характеризуются целостностью, единым жизненным циклом и иерархической или сетевой организацией (Олескин, 2009). Таким образом, выбор популяцией микроорганизмов оптимального варианта взаимодействия с внешней средой и клетками высших организмов, осуществляемый в результате обмена информацией между отдельными особями, можно считать социальным поведением.
Новые знания о генетических и внешних факторах, влияющих на социальное поведение ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий, методов мониторинга состояния окружающей среды (создание биосенсоров) и фиторемедиации загрязненных почв.
В качестве основного объекта данного исследования выбраны бактерии штамма Azospirillum brasilense Sp245, обладающие всеми характеристиками, которые могут влиять на их ассоциативное взаимодействие с растениями (диазотрофность, хемотаксис, подвижность, образование фитогормонов, полисахаридов клеточной поверхности и др.). Кроме того, бактерии данного штамма, наряду с бактериями штаммов A. brasilense Sp242, Sp107 и Sp108 (Baldani et al., 1983) и A. irakense KBC1 (Faure et al., 1999), способны не только колонизировать ризосферу, но и проникать внутрь корней и существовать в них в метаболически активном состоянии (Dbereiner, De-Polli, 1981; Jain, Patriquin, 1984). Все перечисленное выше делает бактерии A. brasilense Sp245 крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов. В работе были использованы и другие штаммы азоспирилл – представители видов A. brasilense, A. halopraeferans, A. irakense и A. lipoferum.
Бактерии рода Azospirillum способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений, распространены практически во всех климатических зонах и экологических нишах (в почве, в корнях растений, на поверхности подземной и надземной частей растений, в воде и др.) (Umali–Garcia et al., 1980; Басилашвили, Нуцубидзе, 1984; Федорова с соавт., 1985; Assmus et al., 1995; Bashan, Holguin, 1997). В данном контексте интересно сравнение поведения A. brasilense Sp245 и других штаммов для выявления универсальных механизмов, обеспечивающих разнообразные проявления социальной активности азоспирилл.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в комплексном генетико-физиологическом анализе социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense.
В связи с поставленной целью в наши задачи входило следующее:
1. Охарактеризовать социальную подвижность штаммов A. brasilense дикого типа и мутантов штамма A. brasilense Sp245 c изменениями в жгутиковании и составе углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности.
2. Оценить роль полисахаридов и белка-гемагглютинина, локализованных на клеточной поверхности, в реализации социальной подвижности бактерий штамма A. brasilense Sp245.
3. Изучить возможное влияние на подвижность азоспирилл ряда внешних факторов (состав среды культивирования; присутствие прижизненного красителя конго красного, корневых экссудатов проростков пшеницы, растительных и грибного лектинов, поликлональных антител на поверхностные полимеры бактериальных клеток).
4. Охарактеризовать нуклеотидную последовательность сегмента резидентной 85-МДа плазмиды штамма A. brasilense Sp245, мутагенез которого приводит к дефектам в жгутиковании и/или подвижности азоспирилл.
5. Провести анализ изменений в структуре генома A. brasilense Sp245, сопровождающихся вариациями в социальной подвижности этих бактерий.
6. Исследовать процесс формирования биопленок культурами штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов с изменениями в структуре клеточной поверхности и подвижности на абиотических плотных средах и на корнях проростков пшеницы.
Научная новизна работы. Дана характеристика новых проявлений социальной подвижности азоспирилл: ускоренное роение, зависящее от работы жгутиков, и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний, реализуемое и в отсутствие жгутиков. Описаны новые экстраклеточные органеллы бактерий штамма A. brasilense Sp245 – полярный пучок пилей, продукция которых, возможно, альтернативна сборке полярного жгутика.
Установлено, что социальная подвижность азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбировать прижизненный краситель конго красный.
Показано, что межклеточные контакты бактерий A. brasilense Sp245, двигающихся в полужидких средах, опосредуются взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида этих бактерий.
Определены некоторые факторы (сниженная концентрация кислорода, аминокислоты аспарагиновая кислота, серин и треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил--D-глюкозамина, соли аммония, нитраты и нитриты), способствующие переходу части популяции клеток A. brasilense от плавания и роения к распространению с образованием микроколоний или оказывающие модулирующее действие на скорость движения клеток.
Обнаружено, что спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальное поведение бактерий. В ДНК 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245 идентифицированы гены hdfR и ccoN, предсказанные белковые продукты которых могут влиять на поведенческие реакции бактерий.
Выявлены поверхностные структуры бактерий и типы подвижности, участвующие в процессе формирования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность” или на корнях проростков пшеницы.
Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены оригинальные мутанты штамма A. brasilense Sp245 с изменениями в индивидуальной и социальной подвижности, продукции жгутиков и поверхностных полисахаридов, которые могут быть полезны при изучении механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Разработанные методические приемы и теоретические положения нашли применение в исследованиях, выполняемых в пяти лабораториях ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, биохимии, микробиологии, иммунохимии и экологической биотехнологии), объектами которых были не только бактерии рода Azospirillum, но и бактерии других родов (что частично отражено в публикациях, представленных в списке основных публикаций по теме диссертации).
Предложенная биотест-система, основанная на ингибировании подвижности разных штаммов азоспирилл поликлональными антителами на поверхностные бактериальные структуры, может быть использована для первичной оценки серологического родства этих бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности интактных клеток.
Результаты работы использованы при подготовке учебно-методического пособия “Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам” / Составители: Шелудько А.В., Кацы Е.И., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Щеголев С.Ю. / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с. Данное пособие, рекомендованное к печати кафедрой органической и биоорганической химии и кафедрой биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), предназначено для студентов и аспирантов химического и биологического факультетов СГУ.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Ускоренное роение и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний представляют собой новые проявления социальной подвижности азоспирилл. Коллективное движение азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбирировать прижизненный краситель конго красный.
2. Распространение бактерий A. brasilense Sp245 по полужидким средам опосредуется взаимодействием белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Источники азота в окружающей среде и кислород модулируют гемагглютинирующие свойства бактериальных клеток и, как следствие, подобные взаимодействия.
3. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил--D-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense от плавания или роения к распространению с образованием микроколоний. На эффективность роения азоспирилл влияют природа источника азота в среде, концентрация кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы.
4. Генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма A. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и подвижности азоспирилл. На социальное поведение азоспирилл могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в p85 генов hdfR и ccoN – негативный регулятор транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и каталитическая субъединица I цитохромоксидазы, соответственно.
5. Изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Липополисахариды, полисахариды, связывающие калькофлуор, и полярный жгутик участвуют в организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность”.
6. После “заякоривания” на корнях пшеницы формирование биопленки клетками штамма A. brasilense Sp245 и его нероящихся мутантов опосредовано распространением с образованием микроколоний. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.
7. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии чужеродного лектина, “распознаются” организмом, продуцирующим лектин, с наименьшим проявлением антагонизма.
8. Эффект ингибирования подвижности азоспирилл антителами на поверхностные структуры или лектинами различного происхождения может быть использован для оценки серологического родства бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности клеток.
Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: “Изучение генов почвенных азотфиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками” (№ госрегистрации 01960001676); “Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образование мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense” (№ госрегистрации 01200606181); “Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями” (№ госрегистрации 01200904390). Работа частично поддержана грантом Президента РФ МК-235.2003.04 для молодых кандидатов наук (канд. биол. наук А.В. Шелудько) и их научных руководителей (д-р биол. наук Е.И. Кацы); грантами Президента РФ НШ-1529.2003.4, НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для ведущей научной школы засл. деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова; грантом Роснауки № 2005-РИ-112/001 (рук. – д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов); грантом Фонда содействия отечественной науке для канд. биол. наук А.В. Шелудько и грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04-48204-а (рук. – д-р биол. наук Е.И. Кацы).
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в планировании и осуществлении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность своему научному консультанту – заведующей ЛГМ ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Е.И. Кацы за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы. Автор признателен участвовавшим в проведении исследований сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.П. Петровой, канд. биол. наук И.В. Борисову, канд. биол. наук О.В. Кулибякиной и О.Э. Варшаломидзе; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.Ю. Матора, канд. биол. наук Г.Л. Бурыгину и канд. биол. наук А.А. Широкову; сотрудникам лаборатории биохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.П. Антонюк, канд. биол. наук А.В. Тугаровой и В.А. Крестиненко; сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.В. Степановой, канд. биол. наук Е.Г. Пономаревой и канд. биол. наук Е.П. Ветчинкиной; сотруднику лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН канд. биол. наук М.К. Соколовой; чей вклад отражен в совместных публикациях; а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Школе-конференции молодых ученых “Горизонты физико-химической биологии” (Пущино, 2000), 10-м Международном конгрессе IUMS The “World of Microbes” (Париж, 2002), 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой” (Саратов, 2002, 2004), 6-й, 9-й и 10-й Школах-конференциях молодых ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2000, 2005, 2006), международной конференции “Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants” (Саратов, 2003), 3-й Всероссийской школе-конференции “Химия и биохимия углеводов” (Саратов, 2004), 30-м конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), Всероссийской конференции “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты” (Саратов, 2005), Международной научной конференции “Мiкробнi бiотехнологi” (Одесса, 2006), Международной школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология” (Москва–Пущино, 2006), 3-й и 4-й Межрегиональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2006, 2008), Всероссийской конференции с международным участием “Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, 2007), Международной научной конференции “Микроорганизмы и биосфера” (Москва, 2007), 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии “Успехи медицинской микологии” (Москва, 2007), Международном рабочем совещании “Azospirillum VII and related PGPR: Genomics, molecular ecology, plant responses and agronomic significance” (Монпелье, 2007), Международной конференции “Вавиловские чтения–2007”, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Саратов, 2007), Международной научно-практической конференции “Вавиловские чтения–2008”, посвященной 95-летию Саратовского госагроуниверситета (Саратов, 2008), 5-м Московском междунар. конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2009), отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 2003, 2004, 2008).
Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 09.06.2010, протокол № 175.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, в том числе, 18 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы и 54 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 14 подразделов), а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 510 литературных источников, из них 80 на русском и 430 на английском языках. В приложении приведены аннотированные нуклеотидные последовательности обсуждаемых в работе генов 85-МДа плазмиды бактерий штамма A. brasilense Sp245, депонированные в международную базу данных GenBank (NCBI, США) (GenBank accession no. EU194339, EU784144, EU595702, EU595701 и EU595706).
