Введение к работе
Актуальность проблемы. Анализ молекулярных механизмов взаимодействия растений с микроорганизмами является актуальным направлением современной биологии (Проворов, 2005; Тихонович и Проворов, 2005, 2007; Проворов с соавт., 2008). За примерно 40-летнюю историю активного исследования взаимовыгодных растительно-микробных ассоциаций бактерии, стимулирующие рост растений, были обнаружены в семействах Azotobacteriaceae, Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhodospirillaceae и др. (Dobereiner and Day, 1976; Tarrand et al., 1978; Baldani et al., 1997; Боронин, 1998; Bashan and Holguin, 1998; Hurek and Reinhold-Hurek, 2003). Сравнительно недавно описаны ассоциации клубеньковых бактерий со злаками (Marek-Kozaczuk et al., 2000; Tan et al., 2001; Perrine et al., 2005). С начала 1980-х гг. одним из наиболее интенсивно изучаемых ассоциативных партнеров растений стали альфа-протеобактерии рода Azospirillum из семейства Rhodospirillaceae, обладающие гибким метаболизмом и способностью к обитанию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах (Bashan and Holguin, 1997; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan et al, 2004).
Основной формой существования микроорганизмов в природе, по-видимому, являются биопленки - пространственно и метаболически структурированные сообщества, заключенные в экстраклеточный полимерный матрикс (Романова с соавт., 2006; Николаев и Плакунов, 2007). Каких-либо сведений об особенностях формирования биопленок азоспирилл и роли в этом процессе их поверхностных полимеров к началу наших работ не было.
Среди полимеров клеточной поверхности азоспирилл доминируют липополисахариды (ЛПС, Lps), опосредующие первые этапы взаимодействия этих бактерий с растениями (Федоненко с соавт., 2001, 2004; Yegorenkova et al., 2001). ЛПС состоят из липида А, корового олигосахарида и О-специфического полисахарида (ОПС), или О-антигена (Книрель и Кочетков, 1993; Schnaitman and Klena, 1993). Выяснена структура повторяющегося звена ОПС (являющегося пента-Б-рамнаном) ЛПС штаммов A. brasilense Sp245, SR75 и Spl07 (Fedonenko et al., 2002; Федоненко с соавт., 2005; Бойко с соавт., 2008), а также ряда других штаммов азоспирилл (Fedonenko et al., 2004, 2005, 2008). Сведения о строении липида А и кора ЛПС A. brasilense в доступной литературе нами не найдены.
Для азоспирилл характерна способность к образованию полисахаридов, связывающих прижизненный краситель калькофлуор (ПССК) (Cal фенотип). ПССК A. brasilense представлены экзополисахаридами (ЭПС) и капсульными полисахаридами (КПС) (Del Gallo et al., 1989). Отсутствие флуоресценции колоний на средах с калькофлуором (СаГ фенотип) использовано для отбора мутантов модельного штамма A. brasilense Sp245 по синтезу ПССК (Katzy et al., 1998).
Работы, посвященные генетическим аспектам образования ЛПС и ПССК у азоспирилл, пока немногочисленны. Как у многих других альфа-протеобактерий, существенную часть многокомпонентного генома азоспирилл составляют крупные плазмиды, по-видимому, значимые для обеспечения экологического успеха бактерий-хозяев (Martin-Didonet et al., 2000; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Капы, 2002, 2003, 2007). В пока единственной из секвенированных плазмид азоспирилл, 90-МДа плазмиде (pRhico) типового штамма A. brasilense Sp7, идентифицированы многочисленные открытые рамки считывания (open reading frames, или orf), предсказанные продукты которых, по-видимому, участвуют в биосинтезе и экспорте полисахаридов (ПС) (Vanbleu et al., 2004).
Использование омегонового мутагенеза позволило выявить в 120-МДа плазмиде (р 120) A brasilense Sp245 четыре локуса, существенных для образования LpsI и LpsII, имеющих различия в антигенной структуре и заряде, но содержащих ОПС с одинаковым повторяющимся звеном (Katzy et al., 1998; Федоненко с соавт., 2004). Мутагенез двух из этих локусов р120 привел к дефектам в образовании не только ЛПС, но и ПССК (Katzy et al., 1998). Более тонкий анализ функций и свойств р120 и других плазмид азоспирилл представляется одной из важнейших предпосылок выяснения молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия этих микроорганизмов с растениями.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилась идентификация в плазмидах A. brasilense новых последовательностей, кодирующих ферменты синтеза полисахаридов, и оценка влияния дефектов в образовании липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок A. brasilense.
В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:
1. Анализ нуклеотидной последовательности 14-т.п.н. Xhol фрагмента 120-МДа
плазмиды A. brasilense Sp245, мутагенез которого сопровождается изменениями в
структуре ЛПС.
Поиск генов, продукты которых могут участвовать в биосинтезе полисахаридов, в клонированном фрагменте 85-МДа плазмиды (р85) A. brasilense Sp245.
Характеристика предполагаемых продуктов экспрессии кодирующих последовательностей, выявленных в р120 и р85, с использованием методов биоинформатики.
4. Поиск локусов, гомологичных секвенированным фрагментам р120 и р85, в
ДНК штаммов A. brasilense, ЛПС которых содержат ОПС с такой же, как у Sp245,
или иной структурой повторяющегося звена.
5. Сравнительный анализ биопленок, формируемых на абиотических
поверхностях штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами по образованию ЛПС
и ПССК.
Научная новизна работы. В двух плазмидах модельного штамма A. brasilense Sp245 впервые идентифицированы гены предсказанных гликозилтрансфераз, участвующих в синтезе кора ЛПС, ОПС и ЭПС.
Установлено, что инсерционный мутагенез гена р120, кодирующего АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазу - один из ферментов синтеза корового олигосахарида ЛПС, приводит к утрате LpsI с кислой углеводной компонентой, но не влияет на образование LpsII с нейтральной углеводной компонентой и такой же, как у LpsI, структурой повторяющегося звена ОПС (пента-О-рамнан).
В 120-МДа плазмиде штамма A brasilense Spl07, ОПС которого, как и у Sp245, является neHTa-D-рамнаном, впервые выявлен высокий уровень гомологии с сегментом р120, содержащим гены ферментов синтеза кора ЛПС, ОПС и ЭПС.
Впервые показано, что изменения состава и (или) структуры плазмид А. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок. Установлено, что ЛПС и ПССК участвуют в структурной организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".
Научно-практическая значимость работы. Результаты мутагенеза плазмидного гена АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы, свидетельствующие о наличии у A. brasilense Sp245, по меньшей мере, двух гликоформ кора ЛПС, могут быть учтены в работах по анализу структуры коровых олигосахаридов азоспирилл.
Данные об одинаковой организации у A. brasilense Sp245 и Spl07 локусов 120-МДа плазмид, кодирующих гликозилтрансферазы, и о высоком уровне идентичности двух генов р85 из Sp245 с плазмидными генами гликозилтрансфераз из широкого круга микробов могут найти применение при анализе горизонтального распространения генов в популяциях бактерий, колонизирующих растения.
Новые знания о генетических аспектах биогенеза мажорных углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности и о роли этих полимеров в формировании биопленок ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
В плазмиде р120 из штамма A brasilense Sp245 идентифицированы четыре гена предсказанных гликозилтрансфераз. Результаты инсерционного мутагенеза одного из этих генов, АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы, свидетельствуют об участии данного фермента в образовании LpsI.
В 120-МДа плазмиде штамма A. brasilense Spl07, ОПС которого, как и у Sp245, является пента-О-рамнаном, выявлен высокий уровень гомологии с фрагментом р120, кодирующим предсказанные ферменты синтеза кора ЛПС, ОПС и ЭПС. Гомология другому сегменту р120, не связанному с образованием ЛПС, в ДНК A brasilense Spl07 отсутствует.
3. Несмотря на сходство пяти белков, кодируемых секвенированным
фрагментом р120, с гипотетическими продуктами генов 90-МДа плазмиды
(pRhico) из типового штамма A. brasilense Sp7, этот район р120 не содержит
протяженных участков гомологии pRhico.
Выявленные в 85-МДа плазмиде A. brasilense Sp245 orf414 и orf418, обладающие высоким уровнем идентичности с генами гликозилтрансфераз и консервативных мембрансвязанных белков из широкого круга почвенных бактерий, не существенны для образования ЛПС с пента-О-рамнановым ОПС.
Дефекты в образовании ЛПС и ПССК, вызванные мутациями в р120, оказывают влияние на формирование биопленок производных A. brasilense Sp245 на гидрофобной и гидрофильной поверхностях.
Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках плановой темы НИР "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense'" (№ госрегистрации 01200606181; научный руководитель - д-р биол. наук Е.И. Кацы). Исследования частично поддержаны грантом Российского фонда фундаментальных исследований 06-04-48204-а (руководитель - д-р биол. наук Е.И. Кацы) и грантами Президента РФ НШ-6177.2006.4, НШ-3171.2008.4 (руководитель - заслуженный деятель науки РФ, д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Секвенирование ДНК осуществлено в лаборатории молекулярной генетики ГУ НИИВ РАМН, а анализ полученных последовательностей - автором совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН. Иммуноферментный анализ биопленок азоспирилл выполнен совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН. Соискатель принимала непосредственное участие в постановке всех задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III и IV Межрегиональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2006, 2008), Международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященной 100-летию со дня рождения СИ. Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), Всероссийской конференции с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), отчетной научной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, 2008), 5-м Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009).
Диссертационная работа обсуждена и рекомендована к защите на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 14.09.2009, протокол № 167.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы, в том числе, 2 работы в журналах, включенных ВАК в "Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук".
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением собственных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 257 источников. Объем диссертации составляет 108 машинописных страниц. Работа содержит 16 рисунков и 6 таблиц.
