Изучение структурной роли белков клеточной стенки дрожжей Алексеева Ольга Вячеславовна

Содержание к диссертации

1. ВВЕДЕНИЕ 3

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

2.1 Морфологическое строение клеточной стенки дрожжей 6

1. Маннопротеиновый слой клеточной стенки дрожжей 8

2. Глкжановый слой клеточной стенки дрожжей 9

3. Локализация хитина в клеточной стенке дрожжей 11

4. Локализация липидов в клеточной стенке дрожжей 12

5. Дополнительные структуры на поверхности клеточной стенки дрожжей 12

6. Капсула 13

2.2 Структура и функции компонентов, входящих в состав клеточной
стенки дрожжей 14

7. р-глкжаны 15

8. Минорные компоненты клеточной стенки дрожжей 20

9. Хитин 20

10. Липиды 22

11. Полифосфаты ..'.'.....; 22

2.3 Особенности белков клеточной поверхности дрожжей 22

12. Закрепление маннопротеинов в клеточной стенке дрожжей 23

13. Гликозилирование 28

2.4 Разнообразие белков клеточной поверхности дрожжей 31

2.4.1 Ферменты, участвующие в формировании и поддержании надмолекулярной
структуры клеточной стенки 32

14. Ферменты, участвующие в метаболизме хитина 33

15. Ферменты, участвующие в метаболизме глюкана 34

16. Ферменты, участвующие в метаболизме маннопротеинов 37

2. Гидролитические ферменты, действующие на экзогенные субстраты 39

3. Белки- рецепторы 46

1. Белки-рецепторы Candida albicans 46

2. Белки-рецепторы Saccharomyces cerevisiae 51

4. Белки, характерные для различных морфологических форм дрожжей 53

5. Белки теплового шока 56

6. Гликолитические ферменты 60

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 64

1. Культура дрожжей и условия ее выращивания 64

2. Препараты ферментов 65

3. Окрашивание клеток дрожжей примулином 65

4. Получение клеточных Стенок дрожжей 66

5. Экстракция белков из клеточных стенок дрожжей 66

6. Получение пептидов 67

7. Кислотный гидролиз белка 67

8. Анализ аминокислотного состава белка 68

9. Получение поликлональных антител и иммуноферментныи анализ 68

10. Методы определения ферментативных активностей 69

Белки клеточной стенки дрожжей Стр. 1

Биофак МГУ им.М.В.Ломоносова Содержание

11. Общая протеолитическая активность 69

12. Инвертазная активность 70

3.11 Аналитические методы 70

3.11.1 Определение белка 70

3.12 Электрофоретические методы 71

3.12.1 Электрофорез в денатурирующих условиях 71

13. Фракционирование с помощью цетавлона 71

14. Хроматографические методы 71

1. Гель-хроматография 71

2. Высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенной фазе 72

3. Рехроматография пептидов 72

15. Электронная микроскопия клеточной стенки 73

16. Электроперенос белков 73

17. Определение N-концевой последовательности белков 74

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 75

1. Выявление белков, играющих важную структурную роль в клеточной стенке дрожжей 75

2. Выделение белка MSP116 84

3. Получение грубого препарата белка MSP116 84

4. Дополнительная очистка препарата белка MSP116 с помощью цетавлона 88

5. Получение чистого препарата белка MSP116 88

6. Очистка грубого препарата белка методом колоночной хроматографии 89

7. Очистка грубого препарата белка MSP116 методом препаративного электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях 90

4.3 Идентификация и характеристика MSP116 93

8. Получение пептидов из чистого препарата MSP116 и идентификация MSP 116....96

9. Сравнение инвертазы Candida utilis с инвертазами других дрожжей 103

10. Сравнение физико-химических свойств инвертаз 104

11. Сравнение аминокислотных последовательностей инвертаз, выделенных из различных видов дрожжей 107

4.3.3 Локализация инвертазы у дрожжей Candida utilis 110

4.4 Структурная роль и закрепление инвертазы в клеточной стенке
дрожжей Candida utilis 118

12. Структурная роль инвертазы в клеточной стенке дрожжей Candida utilis 118

13. Закрепление инвертазы в клеточной стенке дрожжей Candida utilis 123

4.5 Структурная роль белка MSP33 в клеточной стенке дрожжей 131

ВЫВОДЫ 141

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 142

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 171

БЛАГОДАРНОСТИ 172

Белки клеточной стенки дрожжей Стр. 2

Введение к работе

Клеточная стенка дрожжей представляет собой полифункциональную, физиологически активную органеллу. Она составляет наружный скелет клетки, активно участвует в процессе транспорта различных соединений из внешней среды в цитоплазму и обратно, играет большую роль в иммунологических реакциях клетки, в осуществлении контроля метаболических процессов клетки факторами внешней среды. В условиях голодания клеточная стенка может служить источником запасных питательных веществ. Она несет нагрузку по осуществлению всего комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей его средой. Это делает клеточную стенку весьма интересным объектом для исследователей.

Сведения, которыми располагают исследователи в области изучения клеточной стенки дрожжей весьма не полны и зачастую противоречивы. Так, в настоящий момент известно, что основными структурными компонентами этой органеллы являются полисахариды (глюкан, маннан, хитин) и белки (в основном маннопротеины). Однако, до настоящего времени отсутствует модель структуры клеточной стенки дрожжей, соответствующая разнообразию ее функций.

Одним из наименее изученных на данный момент компонентов клеточной стенки являются белки.

В настоящее время в составе клеточной стенки дрожжей насчитывают более 30 белков различной степени гликозилирования. Показано, что белки клеточной стенки несут на себе множество функций: участвуют в формировании и динамических изменениях надмолекулярной структуры клеточной стенки, обеспечивают питание клетки, играют большую роль во взаимодействии клеток с внешней средой (белки - рецепторы и белки теплового шока). Следует отметить, что роль белков, входящих в состав клеточной стенки изучена далеко не полностью. Однако, основываясь на уже известных фактах можно предположить, что белки играют важную роль в структуре, функционировании и динамических изменениях клеточной стенки дрожжей. Возможно, что более подробное изучение уже известных и открытие новых белков клеточной

Белки клеточной стенки дрожжей

Стр. 3

Биофак МГУ им.М.В.Ломоносова

Введение стенки позволит подойти к решению вопроса о молекулярной организации клеточных стенок.

Т.о. сказанное выше свидетельствует о том, что изучение белков клеточной стенки дрожжей, а также разработка методов исследования этих ее компонентов являются важными и актуальными задачами.

Известно, что использование гидролаз с различной субстратной специфичностью является удачным методическим подходом при изучении компонентов (таких, как глюкан, хитин, маннан) , входящих в состав сложноорганизованной и многокомпонентной структуры клеточной стенки дрожжей (Pastor et al., 1984; Valentin et al., 1984).

В лаборатории Кулаева И. С. было показано, что весьма перспективным представляется использование протеолитических ферментов в качестве инструментов для исследования локализации и роли белков клеточной стенки дрожжей (Калебина и др., 1994; Kalebina et al., 1988).

Совершенно очевидно, что без детального анализа роли белков в формировании и поддержании целостности единого молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей невозможно понять, как устроена и как функционирует эта органелла. Данный вопрос весьма далек от окончательного ответа.

В этой связи целью данной работы явилось изучение структурной роли белков клеточной стенки дрожжей Candida utilis и Saccharomyces cerevisiae, частичная характеристика белков, предположительно скрепляющих молекулы полисахаридов в клеточной стенке, и получение ответа на вопрос играют ли белки определяющую роль в скреплении молекул полисахаридов данной органеллы или же они закреплены на полисахаридном каркасе и структурной роли не играют.

В работе были поставлены следующиеэкспериментальные задачи:

1. Проверка гипотезы о том, что белки клеточной стенки дрожжей играют структурную роль в данной органелле. В частности проверка данной гипотезы для ранее обнаруженных белков клеточной стенки с молекулярными массами 33 и 116 кДа и названных соответственно MSP 33 и MSP116.

Белки клеточной стенки дрожжей

Стр. 4

Биофак МГУ им.М.В.Ломоносова

Введение

Выделение и частичная характеристика белка клеточной стенки дрожжей Candida utilis с молекулярной массой ИбкДа (MSP116). Изучение природы данного белка. Получение ответа на вопрос является ли данный белок ферментом.

Изучение структурной роли и способа закрепления MSP 116 в клеточной стенке дрожжей Candida utilis.

Изучение структурной роли других белков клеточной стенки дрожжей Candida utilis и Saccharomyces cerevisiae.

Белки клеточной стенки дрожжей

Стр. 5

2, Обзор литературы

Похожие диссертации на Изучение структурной роли белков клеточной стенки дрожжей

Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжейКарпова Елена Витальевна

Таксономическое изучение дрожжей Williopsis, Zygowilliopsis и Saccharomyces, выделенных из природных источников на Дальнем Востоке Газдиев Денис Олегович

Изучение роли полисахаридных компонентов поверхности бактерий рода Azospirillum на начальных этапах взаимодействия с корнями проростков пшеницыЕгоренкова Ирина Владимировна

Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмовСтепаненко Ирина Юрьевна

Изучение роли лектинов Paenibacillus Polymyxa в регуляции метаболизма животныхНеверова Наталья Николаевна

Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахаридКулибякина Ольга Владимировна

Антимикробное действие и экологическая роль полифункциональных белковГо Даньян

Механизмы и роль освобождения поверхностного белка ActA во взаимодействии Listeria monocytogenes с эпителиальными клеткамиСапенко Татьяна Петровна

Роль посттрансляционных модификаций клеточных белков в регуляции репликации и транскрипции у микроорганизмов Лёзина Лариса Евгеньевна

Роль агглютининов и неагглютинирующих белков Rhizobium leguminosarum в формировании симбиозаАллянова, Марина Сергеевна