Введение к работе
Актуальность темы исследования
Псевдотуберкулез остается актуальной проблемой здравоохранения в России и во многих странах мира. Заболевание отличают выраженный полиморфизм клинических проявлений, отсутствие четких патогномоничных симптомов, склонность к затяжному и хроническому течению. Между тем причины, обуславливающие данное многообразие и сложность патогенеза, остаются невыясненными.
Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды. В этой связи чрезвычайно актуально изучение роли детерминант вирулентности Y. pseudotuberculosis, влияния их продуктов на течение инфекционного процесса и территориальное распространение бактерий.
В отдельных работах предприняты попытки объяснить разнообразие клинических форм псевдотуберкулеза за счет наличия у возбудителя тех или иных генетических детерминант вирулентности (Fukushima H. et al., 2001; Carniel E., 2001; Mollaret H., 1990; Чеснокова М.В. и соавт., 2006). Типичный для России симптомокомплекс псевдотуберкулеза получил название – дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. Основные клинические симптомы инфекции, вызванной Y.pseudotuberculosis в России, Японии и Южной Корее разнообразнее и тяжелее, чем на Европейских территориях и характеризуются системными проявлениями болезни.
Открытие способности к синтезу суперантигена и установление его роли в патогенезе инфекции позволили пересмотреть механизм появления некоторых симптомов при псевдотуберкулезе. В настоящее время с продукцией Y. pseudotuberculosis суперантигена YPMa связывают такие иммунопатологические осложнения псевдотуберкулеза, как реактивный артрит, синдром Рейтера, острый увеит и синдром Кавасаки (Sato К. et al., 1983; Treacher D. et al., 1986; Baba K. et al., 1991).
Хорошо изучен «остров» высокой патогенности Y. pseudotuberculosis, ответственный за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа. Считают, что он необходим для проявления высоковирулентного фенотипа возбудителя (Carniel E., 2001).
Особый интерес представляет плазмида с молекулярной массой 82 МДа (pVM82), обнаруживаемая до настоящего времени у штаммов Y..pseudotuberculosis серотипа О:1b только в России, и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia. Доказано, что наличие плазмиды pVM82 у возбудителя способствует более тяжелому течению инфекции (Шурыгина И.А., 2007).
К настоящему времени выявлены особенности распространения штаммов Y..pseudotuberculosis, содержащих ypmA или «остров» высокой патогенности, cвязанные с географическими регионами (Fukushima H. et al. 2001).
Учитывая многообразие вариантов течения болезни, обусловленного различиями в патогенных свойствах возбудителя псевдотуберкулеза, для клинической практики актуально, прежде всего, изучение биологических характеристик штаммов Y. pseudotuberculosis циркулирующих на различных территориях. Вместе с тем, для оптимизации мониторинга за возбудителем, а также выбора тактики обследования больных требуются наиболее полные знания о влиянии возбудителя псевдотуберкулеза с различным набором генетических детерминант вирулентности на патогенез и совершенствование специфической диагностики инфекции.
Ограниченные возможности распознавания случаев заболевания иерсиниозами, в частности псевдотуберкулеза, на поздних сроках приводят к гиподиагностике, развитию хронических форм (до 30% случаев) и осложнений. Это обуславливает необходимость поиска новых более чувствительных методов этиологической диагностики заболевания.
В связи с изложенным, представлялось актуальным изучение генетических характеристик штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и разработка набора для серологической диагностики иерсиниозов.
Степень разработанности темы исследования
До настоящего времени не определена последовательность нуклеотидов плазмиды Y. pseudotuberculosis pVM82, способствующей более тяжелому течению инфекции, не установлены гены плазмиды, оказывающие влияние на вирулентность бактерии. Методом дот-блот гибридизации не была исследована коллекция штаммов Y..pseudotuberculosis на наличие генов вирулентности icm/dot системы секреции IVB типа и umuDC плазмиды pVM82, выделенных в разных регионах мира.
Ранее изучена коллекция штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на пяти континентах на наличие генетических детерминант вирулентности: генов суперантигена уpmА, уpmB и уpmC; HPI и R-HPI и pVM 46 МДа. При этом исследований на выявление плазмиды pVM82; YAPI и L-YAPI не проводилось. Фрагментарные сведения имеются относительно определения плазмиды pVM82, генов суперантигена и HPI у штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока. Штаммы из Северо-Западного региона, Украины на наличие генетических детерминант вирулентности не изучались.
При генотипировании штаммов Y. pseudotuberculosis по содержанию уpmА, уpmB и уpmC; HPI и R-HPI и pVM 46 МДа, выделенных на пяти континентах, охарактеризовано 6 генетических групп штаммов. Было установлено, что для территорий России (исследованы только дальневосточные штаммы), Японии и Кореи для штаммов Y..pseudotuberculosis характерно содержание уpmА и отсутствие HPI. В то же время для штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на всех остальных территориях мира, главным образом, характерно содержание HPI и отсутствие уpmА, что свидетельствует о взаимосвязи наличия этих детерминант вирулентности с клиническими симптомами псевдотуберкулеза, различными для этих территорий. Описаны клинические проявления псевдотуберкулеза у больных, от которых выделены штаммы 2 (HPI+), 3 (ypmA+) и 5 (R-HPI+ ypmС+) генетических групп. В то же время по содержанию генов pVM82, YAPI и L-YAPI генотипирование не проводилось, хотя ранее было доказано, что наличие плазмиды pVM82 оказывает влияние на тяжесть течения псевдотуберкулеза.
Существующие отечественные препараты и тест-системы для диагностики иерсиниозов недостаточно эффективны, особенно при хроническом течении заболеваний. В мировой практике «золотым» стандартом серологической диагностики иерсиниозов признан метод иммуноблота. В настоящее время на основе этого метода существуют зарубежные наборы. В РФ до настоящего времени не разработана методика конструирования набора для определения антител классов А, М и G методом иммуноблота.
Цель исследования
Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Y..pseudotuberculosis и совершенствование этиологической диагностики иерсиниозов.
Задачи работы:
-
Изучить наличие генетических детерминант вирулентности у штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных в различных географических регионах мира.
-
Охарактеризовать генотипы штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения и их распространенность в разных регионах мира.
-
Установить особенности клинического течения псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis различных генотипов.
-
Разработать набор для серологической диагностики иерсиниозов.
Научная новизна:
С использованием метода дот-блот гибридизации у штаммов Y..pseudotuberculosis различного происхождения выявлена плазмида pVM82, несущая гены вирулентности, основные из них - гены icm/dot системы секреции IVB типа, опосредующие внутриклеточное персистирование микроорганизма в эпителиальных клетках, что может обуславливать скарлатиноподобные проявления заболевания.
Впервые изучена распространенность pVM82 у представителей мировой популяции Y. pseudotuberculosis.
На основании содержания основных генетических детерминант вирулентности: pVM82, генов суперантигена, YAPI и HPI выделено 14 генотипов штаммов Y. pseudotuberculosis. Показано распространение штаммов Y..pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран пяти континентов.
Установлено, что псевдотуберкулез с симптомами ДСЛ вызывают все штаммы Y. pseudotuberculosis, обладающие геном ypmA, кодирующим YPMa.
Получены новые знания о тяжести течения псевдотуберкулеза, обусловленного штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3a, 3b, 3c. Полученные данные могут свидетельствовать о более тяжелом течении инфекции, вызванной штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3b (ypmA+L-YAPI+) и 3c (ypmA+L-YAPI+pVM82+), по сравнению с инфекцией, обусловленной штаммами Y..pseudotuberculosis генотипа 3a (ypmA+).
Практическая значимость работы:
Изученные российские штаммы Y. pseudotuberculosis и их характеристики представлены в коллекции лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург.
Для повышения эффективности диагностики псевдотуберкулеза обоснованы показания к обследованию больных с симптомами острого аппендицита, мезентериального лимфаденита и гастроэнтеральными симптомами с целью выявления их инфицированности Y. pseudotuberculosis генотипов 2a и 2b, вызывающих инфекцию с абдоминальными проявлениями.
Для микробиологического мониторинга за возбудителем псевдотуберкулеза предложена методика генотипирования штаммов Y..pseudotuberculosis.
Разработана методика конструирования набора для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, A, и M в крови или плазме человека методом иммуноблота.
На основе результатов работы подготовлены следующие документы:
1. Методические рекомендации для эпидемиологов, инфекционистов, педиатров и микробиологов «Псевдотуберкулез и иерсиниоз» Г.Я. Ценева, Г.И. Кокорина, Е.А. Воскресенская и др. СПб, 2005. – 49 с.
2. Материалы диссертации представлены в монографии «Иерсинии и иерсиниозы» (Глава 8, «Современные возможности лабораторной диагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза» Г.Я. Ценева, Г.И. Кокорина, Е.А. Воскресенская и др.) СПб.: ООО «Бастион», 2006. – 168 с.
3. СП 3.1.7.2615-10 «Профилактика иерсиниоза» М., 18 с.
4. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I». - № 2465319 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И.
5. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы Ia». - № 2465321 от 16.09.2011. – Авторы: Ценева Г.Я., Кокорина Г.И., Климов В.Т.
6. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы II». - № 2465317 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Чеснокова М.В.
7. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы IIa». - № 2465318 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Климов В.Т.
8. Материалы диссертации представлены в «Национальном руководстве по клинической лабораторной диагностике» (Раздел: «Иерсинии»), - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.- 2т.
Методология и методы исследования
В соответствии с целью и задачами исследования был использован следующий материал и применены методы, представленные в таблице 1.
Таблица 1. Объем проведенных исследований различными методами
Для выполнения исследований использовано 309 штаммов Y..pseudotuberculosis: 232 из коллекции Национального Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами и 77 штаммов из Коллекции Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера за период 1989 по 2008 гг. В работе использовано 4 референс-штамма, содержащие различные детерминанты вирулентности Y. pseudotuberculosis из Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера. Плазмида pVM82 выделена из штамма Y. pseudotuberculosis IP31758, изолированного от больного псевдотуберкулезом с типичными симптомами ДСЛ.
Для иммунизации кроликов использован охраноспособный штамм Y..enterocolitica O:3 КМ 174 (Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», Саратов), содержащий плазмиду pYV 46 MДа.
Выделение, идентификацию и культивирование микроорганизмов проводили в соответствии с Методическими рекомендациями «Псевдотуберкулез и иерсиниоз» № 11-3/8-09 (2005).
Серотипирование культур Y. pseudotuberculosis осуществляли в мультиплексной ПЦР с использованием специфичных праймеров по методике Bogdanovich T. (2003) или с применением набора коммерческих моновалентных сывороток (производства ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) к серотипам Y. pseudotuberculosis О:1 и О:3 с помощью реакции агглютинации на стекле.
Выделение тотальной бактериальной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции (Carniel E., 1989).
Методом дот-блот гибридизации или ПЦР проведена детекция генов ypmB, ypmA/C, irp2, fyuA, pilPQ, api 74, yopM, yscQ, dot O, mucAB.
Для дот-блот гибридизации денатурированную ДНК штаммов наносили по 5 мкл на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Hybond N+; Amersham, Англия), фиксировали, облучая ультрафиолетовыми лучами в течение 4 минут с использованием прибора GS Gene Linker UV Chamber (Bio Rad) в режиме C3. Зонды получали с помощью ранее известных (Carnoy C., 1999; Schubert S., 1998; Collyn F. 2004; Collyn F. 2005; ., 1996) и сконструированных праймеров, синтезируя их методом ПЦР. Праймеры разработаны с помощью программы OFD Method и BlastN. Продукты амплификации были очищены от агарозы и примесей с помощью набора микроколонок QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Мечение продукта ПЦР пероксидазой и использование его в качестве комплементарного ДНК-зонда для гибридизации с фиксированными на мембране ДНК исследуемых штаммов осуществляли при 42 оС с помощью набора реагентов для мечения ECL (ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems; Amersham, Англия). Для выявления ДНК иерсиний, гибридизованных с зондами, мембрану обрабатывали с помощью набора реагентов ECL и экспонировали в течение 30 минут на светочувствительной пленке Hyperfilm ECL, помещенной в кассету.
ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на приборе PTC-100 (MJ Pesearch, Inc). Финальный объем реакционной смеси составил 50 мкл и содержал 1,25 U Taq ДНК полимеразы (Roche/Cetus) с прилагаемым буфером, MgCl2 в концентрации 2 мМ и по 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозид- трифосфатов. Все праймеры использовали в финальной концентрации 0,3 мкМ. ПЦР проводили по программе: 1 цикл 94 0С -3 мин; 30 циклов амплификации 94 0С - 30 сек, 55 0С – 1 мин, 72 0С – 2 мин; 72 0С – 10 мин. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием этидий бромидом и последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете.
Проведено секвенирование генома плазмиды pVM82 по методике «дробовика» (работа проводилась в рамках совместного проекта с Институтом геномных исследований, (США)). Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочной экстракции ДНК по Бирнбоу-Долли с модификацией (Feliciello J., 1993). Плазмидную ДНК подвергали случайному дроблению (Nelson K.E., 1999), последовательность генома плазмиды была собрана используя Celera assembler (Huson D.H., 2001). Для аннотации генома использовали TIGR Manatee system.
Для секвенирования генов ypmA и ypmC проводили ПЦР со штаммами Y. pseudotuberculosis с использованием праймеров к гену ypmA. Продукт ПЦР очищали, применяя набор микроколонок QIAquick PCR purufication Kit (Qiagen). Секвенирование проводили, используя Big Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit (Perkin-Elmer) и ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin-Elmer).
В ходе разработки тест системы получены гипериммунные сыворотки. Для этого штамм Y. enterocolitica O:3 культивировали 24 ч в мясопептонном бульоне, затем 24 ч на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 28 оС, готовили взвесь бактерий в физиологическом растворе с концентрацией 109 кл/мл. Кроликам массой 2,5 - 3 кг вводили взвесь бактерий по схеме: под конъюнктиву - 0,1 мл, через 3 дня и далее вводили такую же дозу внутривенно трехкратно с интервалом 3 дня, через 7 дней - под конъюнктиву, через 3 дня однократно внутривенно. Также готовили гипериммунные сыворотки к комплексу рекомбинантных белков (Yops) YopM Y. enterocolitica, YopE Y. enterocolitica, YopH Y. enterocolitica, YopD Y. enterocolitica (Cat. No. #RPY003, #RPY004, #RPY005, #RPY006 «Omnio AB», Швеция). Кроликов иммунизировали по схеме: внутримышечно – 10 мкг двукратно с интервалом в 7 дней, внутрибрюшинно - 2,5 мкг через 14 дней, подкожно - 15 мкг через сутки, внутрибрюшинно двукратно по 15 мкг через 3 дня, внутривенно по 15 мкг через 4, 2, и 2 дня соответственно.
Электрофорез белков проводили по Laemmli (1970), с использованием камеры для вертикального электрофореза Mini-Protean Tetra Cell; Bio-Rad, США. Для переноса белков на НЦМ по Towbin H (1992) полусухим методом применяли аппарат Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell; Bio-Rad, США.
Для выявления антител к иерсиниям методом иммуноблота использован диагностический набор Иммуноблот (А), разработанный в ходе настоящего исследования.
В качестве препарата сравнения использован коммерческий набор (Иммуноблот (К)) «Иерсинии IgG Вестерн-блот» и «Иерсинии IgА Вестерн-блот» производства «Euroimmun», Германия.
Применяли РНГА с коммерческими эритроцитарными диагностикумами: псевдотуберкулезным и кишечноиерсиниозными О:3 и О:9 (НИИВС, Санкт-Петербург).
Для постановки РА использовали иерсиниозные корпускулярные антигены серотипов: Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 и О:3, Y. enterocolitica серотипов О:3; О:5,27; О9 (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера).
Для выявления иерсиниозных антител методом ИФА применены коммерческие тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM» (ООО «Омникс», Санкт-Петербург), предназначенные для выявления антител классов A, M и G к белкам наружной мембраны иерсиний.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Для штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территории России и Японии, в сравнении со штаммами, выделенными на территории Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки характерно наличие различных генетических детерминант вирулентности (ypmA, ypmB, ypmС, HPI, R-HPI, YAPI, L-YAPI, pVM82).
-
У штаммов Y. pseudotuberculosis охарактеризовано 14 генотипов:1a (HPI+ ypmA+), 2a (HPI+), 2b (HPI+L-YAPI+), 2c (HPI+YAPI+), 3a (ypmA+), 3b (ypmA+L-YAPI+), 3c (ypmA+L-YAPI+pVM82+), 3d (ypmA+ pVM82+), 4 (ypmB+), 5a (R-HPI+ ypmC+), 5b (R-HPI+ ypmC+L-YAPI+), 6a (HPI-ypm-YAPI-pVM82-), 6b (L-YAPI+), 6c (pVM82+). Установлена особенность распространенности штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран мира пяти континентов.
-
У больных псевдотуберкулезом, от которых выделены штаммы генотипов 3b и 3c достоверно чаще выявляются поражения печени, что утяжеляет течение болезни, по сравнению с пациентами, заболевание которых обусловлено Y. pseudotuberculosis генотипа 3a.
-
Применение набора, разработанного для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, A, и M в образцах крови или плазмы человека методом иммуноблота, позволяет проводить этиологическую диагностику иерсиниозов, в том числе с хроническим течением. Чувствительность диагностического набора составляет 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%.
Степень достоверности и апробация результатов:
Штаммы Y. pseudotuberculosis, использованные в работе выделены от больных, животных, с продуктов питания в ходе расследования вспышек псевдотуберкулеза, а также спорадических случаев заболевания и при текущем эпидемиологическом надзоре. Больные включены в исследование на основании лабораторного подтверждения диагноза иерсиниозной инфекции при отрицательных результатах обследования на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии, за исключением сопутствующих инвазий, а также при отсутствии соматической патологии.
Статистическая обработка данных проведена методами статистического анализа при помощи стандартных пакетов программ STATISTICA 6.0. Для оценки достоверности различий между несколькими группами наблюдений использованы методы дисперсионного анализа. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t) и величины вероятности (p). За достоверность различий принимали значение р<0,05, вероятность различий составляла 95% и более.
По теме диссертации опубликованы: 18 работ, в том числе 4 – в изданиях, рекомендуемых ВАК, получено 4 патента.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях в 2006 -2011 гг.: 22-24 марта 2006 г. СПб, Российская научно-практическая конференция, посвященная 110 –летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины»; 12-13 октября 2006 г. СПб, II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями»; 11 апреля 2006 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 2-4 июня 2008 г. СПб, Четвертая международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями»; 18-20 мая 2010 г. СПб, НИИЭМ им. Пастера, Международная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями»; 10-12 ноября 2010 г. СПб, НИИЭМ им. Пастера Семинар «Унификация лабораторных методов индикации и идентификации иерсиний и антител к ним»;24-25 ноября 2011 г. СПб, 8-я Северо-Западная научная гастроэнтерологическая сессия «Гастроэнтнрология. Гепатология. Колопроктология. Фармакотерапия. Питание.»; 12-15 октября 2011 г. СПб, Третья всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями».
Личный вклад автора
Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов проведено в Национальных Yersinia референс-центрах ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера и Парижского института Пастера, ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России, ФГУЗ Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока и ЦГЭ Республики Карелия.
Исследования по генотипированию штаммов Y. pseudotuberculosis, секвенированию участков гена ypmA/C проведены автором на базе Парижского института Пастера и ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера в Санкт-Петербурге.
Микробиологические, серологические, экспериментальные исследования, систематизация и анализ полученных данных, статистический анализ данных проведен автором в лаборатории бактериальных инфекций ФБУН «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера».
Секвенирование плазмидой ДНК штамма Y. pseudotuberculosis проведено сотрудниками института геномных исследований, США, в рамках совместного проекта.
Структура и объем диссертации
Основной текст диссертации изложен на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав собственных исследований, заключения, приложений.
Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 9 рисунками. Список литературы содержит 157 источников, в том числе 39 отечественных авторов и 118 источников зарубежных авторов.
