Введение к работе
Актуальность проблемы. Чума - особо опасная инфекционная болезнь, которая и в настоящее время требует к себе пристального внимания и координированного контроля со стороны всего мирового сообщества. Природные очаги чумы расположены на территории Азии, Африки, Европы, Северной и Южной Америк. В Российской Федерации и ближнем зарубежье существует 45 природных очагов чумы, 11 из которых находятся непосредственно на территории России [Онищенко Г.Г.с соавт., 2004; Попов Н.В.с соавт., 2011]. Широкое распространение возбудителя чумы, его высокие поражающие свойства делают чуму важной социально-значимой проблемой международного масштаба. Решение этой проблемы требует разработки новых высокоэффективных методов и средств диагностики и профилактики чумы.
Применение современных молекулярных технологий в изучении возбудителя чумы и секвенирование последовательностей полных геномов ряда штаммов показало, что возбудитель чумы является ветвью эволюции псевдотуберкулезного микроба, от которого он отделился относительно недавно [Achtman М. et al., 1999; Parkhill J. et al., 2001; Deng W. et al, 2002; Chain P. et al., 2004; Garcia E. et al., 2008; Eppinger M. et al., 2010; Morelli G. et al., 2010]. Несмотря на свою эволюционную молодость, возбудитель чумы отличается значительным внутривидовым разнообразием и вариабельностью его фенотипических свойств, что связано с существованием штаммов Yersinia pestis в различных ландшафтно-географических условиях. Развитие методов современной фундаментальной генетики и молекулярной микробиологии позволяют перевести существующие классификации Y.pestis на качественно новый уровень, основанный на генетических свойствах возбудителя. Создание генетической классификации повысит надежность систематизации и позволит избежать недостатков, присущих фенотипическим схемам. Особую актуальность приобретает разработка системы молекулярного типирования штаммов Y.pestis, которая необходима для определения принадлежности выделяемых штаммов возбудителя чумы к подвиду, биовару и природному очагу, а также для получения молекулярных характеристик штаммов, циркулирующих в различных природных очагах чумы.
Для молекулярного типирования возбудителя чумы применяются различные генетические методы, такие как анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и его варианты - IS - и риботипирование; мультилокусное или полногеномное секвенирование; мультилокусный анализ вариабельного числа тандемных повторов (MLVA); анализ отличающихся участков (DFR) и кластерных регулярно разделенных коротких палиндромных повторов (CRISPRs) [Бобров А.Г., Филиппов А.А. 1997; Горшков О.В. с соавт., 2000; Guiyoule A. et al., 1994; 1997; Achtman М. et al., 1999; 2004; Keim P. et al, 2000; Kotetishwili M. et al., 2005; Kingston J. et al., 2008; Li Y. et al., 2008; 2009; Morelli G. et al., 2010]. Также используются варианты ПЦР
4 типирования: с праймерами на случайно амплифицируемую полиморфную ДІ
(RAPD), повторяющуюся экстрагенную палиндромную ДНК (REP), на повторяю
щиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий (ERIC) и дру
гие [Kim W. et al., 2003; De Gregorio E. et al., 2005; Kingston J. et al, 2008].
Каждый из перечисленных методов был апробирован на возбудителе чумы имеет свои преимущества и недостатки. С помощью метода IS типирования прове ден анализ родственных связей штаммов Y.pestis, циркулирующих на различных гео графических территориях, и осуществлена реконструкция внутривидовой эволюци возбудителя чумы [Бобров А.Г., Филиппов А.А. 1997; Горшков О.В. с соавт., 2000 Achtman М. et al., 1999, 2004]. Другой вариант RFLP - риботипирование был исполь зован для изучения мировой коллекции штаммов Y.pestis [Guiyoule A. et al, 199 1997], однако, этот метод практически не применялся для исследования штаммо Y.pestis из природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья.
В изучении эволюционного родства чумного и псевдотуберкулезного микроб широкое распространение получил метод мультилокусного секвенировани [Achtman М. et al., 1999; 2004; Kotetishwili М. et al., 2005]. В то же время число и пользуемых ДНК мишеней ограничено, и необходимо значительно расширить их к личество для повышения эффективности внутривидовой дифференциации Y.pesti Все более очевидным становится преимущество полногеномного секвенировани однако, необходимость применения дорогостоящего оборудования значительно о раничивает его использование [Parkhill J. et al., 2001; Deng W. et al., 2002; Garcia E. al., 2008; Eppinger M. et al., 2007; Morelli G. et al., 2010].
Высокой разрешающей способностью обладают методы генотипирования, о нованные на использовании высоко вариабельных участков ДНК -VNTR, DFR CRISPRs [Сучков И.Ю. с соавт., 2004; Keim P. et al., 2000; Le Fle'che P. et al., 200 2002; Zhou D. et al, 2004; Pourcel С et al., 2004; Cui Y. et al., 2008; Li Y. et al., 200 2009]. Эти методы позволяют выявлять близкородственные штаммы Y.pestis, однак ввиду высокой вариабельности используемых ДНК-мишеней необходимо совмес ное применение этих методов в комплексе с другими, дающими более стабильн результаты.
Данные по разрешающей способности еще одной группы методов - П (RAPD, ERIC, REP) носят противоречивый характер, и их место в общей схеме м лекулярного типирования штаммов Y.pestis остается неясным [Kim W. et al., 2003; Gregorio E. et al., 2005; Kingston J. et al., 2008].
Таким образом, в настоящее время не разработан единый методический по ход к молекулярному типированию штаммов Y.pestis, и не определено оптимальн сочетание методов для проведения внутривидового генотипирования штамм Y.pestis. Не создана система молекулярного типирования возбудителя чумы, котор
5 может решать задачи по многоуровневой дифференциации штаммов Y.pestis, в том
числе, отделять штаммы основного высоковирулентного подвида от штаммов неосновных подвидов и от возбудителя псевдотуберкулеза; дифференцировать неосновные: кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский подвиды; делить штаммы Y.pestis основного подвида по их биоварной принадлежности, а также устанавливать принадлежность штаммов Y.pestis к определенным природным очагам.
Создание системы молекулярного типирования необходимо и для выяснения современной структуры вида Y.pestis и оценки правильности используемых феноти-пических классификаций возбудителя чумы. Стандартизация используемых методических подходов и создание эффективной системы молекулярного типирования штаммов Y.pestis позволит внести необходимые изменения в существующую классификацию возбудителя чумы.
Цель работы. Сравнительный анализ эффективности методов молекулярного типирования возбудителя чумы и выбор их оптимального сочетания для определения подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ микробиологических, биохимических и генетических особенностей штаммов Y. pestis из природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья и установить приуроченность штаммов античного и средневекового биоваров к очагам определенного (сурочьего, сусликового и песчаночьего) типов.
-
На основе метода ПЦР разработать способ дифференциации штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и Yersinia pseudotuberculosis. Провести анализ эффективности методов ПЦР типирования для внутривидового генотипирования возбудителя чумы.
-
Модифицировать метод анализа полиформизма длин рестрикционных фрагментов генов биосинтеза рРНК (риботипирования) для повышения его эффективности для молекулярного типирования возбудителя чумы. Создать классификацию риботипов штаммов Y pestis, циркулирующих в Российской Федерации и в зарубежных странах.
-
Провести поиск высокоразрешающих ДНК мишеней и разработать схему дифференциации штаммов Y. pestis по подвидовой и биоварной принадлежности на основе метода мультилокусного секвенирования.
-
Изучить эффективность совместного использования трех участков вариабельных тандемных повторов - msOl, ms04 и ms46 для установления очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.
6. Провести выбор оптимального сочетания методов молекулярного типирования для определения подвидовой, биоварнои и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.
Научная новизна работы. На основе комплексного исследования генетических и микробиологических свойств штаммов возбудителя чумы из природных очагов России и ближнего зарубежья установлена приуроченность штаммов средневе кового биовара к очагам сусликового и песчаночьего типов (за исключением Заба кайльского степного очага), а штаммов античного биовара к очагам сурочьего типа.
Впервые выявлены генетические локусы - гены жизнеобеспечения terC, ilvN inv, вариабельность которых позволяет быстро и эффективно проводить разделени штаммов основного и неосновных подвидов методом ПЦР. Штаммы основного под вида содержат в генах terC и ilvN, соответственно, делеции размером 89 п.н. и 4 п.н., что отличает их от неосновных подвидов, у которых эти гены находятся в ин тактном виде. Наличие инсерции последовательности IS1541 размером 708 п.н в ген inv отличает штаммы Y. pestis основного и неосновных подвидов от штаммо Y. pseudotuberculosis. Получено решение о выдаче патента по заявке № 201011979 (приоритет от 17.05.2010 г.) на изобретение «Способ дифференциации штаммов воз будителя чумы основного и неосновных подвидов методом полимеразной цепної реакции». Установлено, что ERIC ПЦР обладает большей эффективностью для гено типирования штаммов Y. pestis по сравнению с другим методом ПЦР типирования RAPD ПЦР.
На основе изучения вариабельности участков хромосомы, содержащих ген 16S-rRNA, разработана схема классификации риботипов, по которой штаммы осно ного подвида из очагов России и сопредельных государств отнесены к I и III рибот пам, а неосновных подвидов - к VI риботипу.
Выявлены ДНК мишени - гены жизнеобеспечения rhaS, aspA, metB, парА tcaB, применение которых на основе метода мультилокусного секвенирования обе печивает определение принадлежности штаммов Y. pestis к определенному подвид и биовару.
Показано, что совместное применение трех участков вариабельных тандемнь повторов - локусов msOl, ms04 и ms46 позволяет проводить кластеризацию штамм возбудителя чумы по очаговой принадлежности, а комплексное использование мет дов мультилокусного секвенирования и мультилокусного анализа числа вариабел ных тандемных повторов обеспечивает дифференциацию штаммов возбудителя ч мы по их принадлежности к подвидам, биоварам и природным очагам.
Практическая значимость работы. По результатам работы разработаны м тодические рекомендации «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пр годной для тонких молекулярно-биологических экспериментов» (утверждены дире
7 тором РосНИПЧИ «Микроб» 17 апреля 2007 г.) и «Дифференциация штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» 14 октября 2010 г.).
В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы два штамма: Y. pestis КМ 229 и КМ 956. в качестве референс-штаммов античного и средневекового биоваров для внутривидовой дифференциации Y. pestis методом мультило-кусного секвенирования, циркулирующих в Российской Федерации и в ближнем зарубежье.
Полученные в ходе выполнения данные по генетической организации штаммов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика возбудителя чумы» на курсах специализации по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».
Положения, выносимые на защиту:
1. На территории Российской Федерации и ближнего зарубежья в природных очагах
чумы сусликового и песчаночьего типов (за исключением Забайкальского степного очага) циркулируют штаммы Y. pestis, содержащие мутацию (G —>на Т) в позиции 613 гена периплазматической нитратредуктазы пар А (средневековый биовар), а в очагах сурочьего типа - штаммы, у которых эта мутация отсутствует (античный биовар).
-
Мультилокусная ПЦР с использованием эффективных ДНК мишеней, таких как гены terC (устойчивость к теллуру), ilvN (ацетолактатсинтаза) и inv (инвазин-адге-зин) обеспечивает надежную дифференциацию штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов, а также штаммов Ypseudotuberculosis. Метод ПЦР типирования с праймерами на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энте-робактерий - ERIC ПЦР может быть использован для установления генетического родства штаммов возбудителя чумы.
-
Вариабельность хромосомных участков ДНК, содержащих гены биосинтеза рРНК, позволяет проводить дифференциацию штаммов Y.pestis по их происхождению. Штаммы основного подвида из природных очагов России и ближнего зарубежья относятся к I и III риботипам, а штаммы неосновных подвидов к VI риботипу.
-
Метод мультилокусного секвенирования с применением вариабельных последовательностей генов жизнедеятельности (rhaS, aspA, metB, парА, tcaB) обеспечивает установление принадлежности штаммов Y. pestis к подвиду и биовару; а метод мультилокусного анализа трех областей вариабельных тандемных повторов msOl, ms04 и ms46 проводит кластеризацию штаммов по их очаговой принадлежности. Комплексное использование методов мультилокусного секвенирования и мультилокусного
анализа числа вариабельных тандемных повторов позволяет проводить определение
подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на: 2-ой Всероссийской научно-практической конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями», г. Санкт-Петербург, 12-13 октября 2006 г.; Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика», Москва, 2006 г.; научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 31 мая 2006 г.; 7-ой Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, Оболенск, 2006 г.; X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств - участников СНГ», 2010 г.; а также на ежегодных итого вых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2006- 2011 гг.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них в периодических изданиях, входящих в перечень ведущих рецензируемых научнь журналов, рекомендованных ВАК России.
Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 166 страни цах, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследо ваши (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 27 рисунками. Библиографически указатель содержит 218 отечественных и зарубежных источников.
