Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1 .Современные классификации патогенных иерсиний: возбудителей
чумы и псевдотуберкулеза 14
1.2.Область пигментации патогенных иерсиний: структура и функции 17
1.2.1.Организацияpgm области Yersiniapestis 19
1.2.2,Организация^т области Yersinia pseudotuberculosis 25
1.2.3 .Мутации, возникающие в пределах pgm области хромосомы у
природных штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis 27
І.З.Полимеразная цепная реакция как метод молекулярной индикации
и идентификации чумного микроба 31
1.3.1 .Полимеразная цепная реакция и её модификации 31
1.3.2.Индикация и идентификация Yersinia pestis методом
полимеразной цепной реакции 32
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3 7
ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3 7
2.1 .Бактериальные штаммы 37
2.2.Питательные среды, препараты и реактивы 48
2.3.Методы исследований 49
ГЛАВА 3.ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ
ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ РАЗНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПО ПРИЗНАКАМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С
ОСНОВНЫМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ ВИРУЛЕНТНОСТИ 59
3.1.Характеристика штаммов чумного микроба, использованных для
изучения распространения аллелей вариабельных локусов hutG-
YPO1950 региона области пигментации 59
3.2.Характеристика штаммов псевдотуберкулезного микроба,
использованных для изучения распространения аллелей вариабельных
локусов hutG-YFO\950 региона области пигментации 70
ГЛАВА 4.ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАЦИИ РЕГИОНА /шЮ-УРО1950
ОБЛАСТИ ІГИГМЕНТАЦИИ У ШТАММОВ ЧУМНОГО И
ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ РАЗНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ 89
4.1.Тактика поиска и выявление различий в регионе /m/G-YPO1950 у
штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного
происхождения 89
4.2.ПЦР - анализ вариабельных областей 1 и 2 hutG—YPO1950 региона
у штаммов чумного микроба разного происхождения и штаммов
псевдотуберкулезного микроба 103
4.3.ПНР - анализ вариабельной области 3 hutG - YPO1950 региона у
штаммов чумного микроба разного происхождения 109
4.4.ПЦР - анализ вариабельной области 3 /zw/Xj-YPO1950 региона
штаммов псевдотуберкулезного микроба из разных географических
регионов 114
4.5.ПНР - анализ вариабельной области 4 hutG-YPQ\950 региона у
штаммов чумного микроба разного происхождения 121
ГЛАВА 5.ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ
РЕГИОНА hutG - YPO1950 126
5Л.Определение и сравнение нуклеотидных последовательностей гена
порина YP01967 чумного и псевдотуберкулёзного микробов,
выделенных в разных географических регионах 126
5.1Л.Нуклеотидная последовательность интактного гена порина и
первичная структура порина чумного и псевдотуберкулёзного
микробов 130
4
5.1.2.Нуклеотидная последовательность трункированных генов порина
порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов 135
5.2.0пределение и сравнение нуклеотидных последовательностей hms оперона штаммов Yersinia pestis, выделенных в разных
географических регионах 140
ГЛАВА 6.РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПЦР СИСТЕМ
ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И АВИРУЛЕНТНЫХ
ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 143
6 Л .Мультиплексная ПЦР система для дифференциации вирулентных
и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения 144
6.2.Разработка ПЦР для дифференциации авирулентных вследствие
потери области пигментации и вирулентных штаммов (клонов)
чумного микроба 153
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 165
ВЫВОДЫ 176
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 177
5 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
б.м. - белая мышь
дНТФ - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты
кДа - килодальтон
КОЕ - колониеобразующая единица
Мда - мегадальтон
м.к. - микробная клетка
м.с. - морская свинка
млн.плі. - миллион пар нуклеотидов
н.д. - нет данных
н.о. -не определялось
ПЦР - полимеразная цепная реакция
тлт.н. - тысяча пар нуклеотидов
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Na
irp (ybt) - гены сидерафорзависимой системы утилизации ионов железа (iron-regulated
protein)
Hms - признак пигментации (hemin storage)
hms - оперон отвечающий за сорбцию гемина
HPI - остров высокой патогенности (high-pathogenicity island)
LD5o - доза, летальная для 50% животных
OD - оптическая плотность (optical density)
pgm - область пигментации хромосомы (pigmentation locus)
Apgm - делеция области пигментации
Psn - чувствительность штамма к действию пестицина (pesticin sensitivity)
psn - ген рецептора иерсиниабактина и пестицина у штаммов возбудителей чумы и
псевдотуберкулеза
Pst - признак продукции пестицина (pesticin production)
pst - структурный ген, кодирующий синтез пестицина
Тох - признак синтеза «мышиного токсина»
Ybt - сидерофор иерсиниабактин (yersiniabactin)
ybt- оперон сидерофор зависимой системы потребления Fe+
Введение к работе
Актуальность проблемы. Три патогенных для человека вида иерсиний — Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica вызывают разные по тяжести и эпидемической значимости заболевания. Возбудитель чумы вызывает быстротечное заболевание с генерализацией процесса и летальным исходом и явился причиной нескольких пандемий, унесших миллионы человеческих жизней. Два других вида микроорганизмов вызывают энтериты разной степени тяжести. Патогенные штаммы всех трех видов содержат ведущие факторы вирулентности: хромосомную область пигментации (pgm) и плазмиду кальцийзависимости (pCad) [108]. У возбудителей чумы и псевдотуберкулеза эти генетические структуры имеют высокую степень гомологии, но при этом выявлены небольшие как видовые, так и внутривидовые различия в их структурной организации и фенотипическом проявлении [143]. Учитывая исключительную важность этих детерминант для проявления вирулентных свойств микробов, выявление и характеристика даже небольших структурных и функциональных различий может приблизить нас к пониманию причин высокой патогенности возбудителя чумы, поможет в разработке систем молекулярного типирования и идентификации этого патогена. Основные сведения о структуре и функциональной активности ведущих детерминант патогенности получены на зарубежных штаммах. Однако на территории стран СНГ существует 42 природных очага чумы, в которых циркулируют различающиеся по фенотипу и вирулентности штаммы. Исследование геномов этих штаммов находится на начальном этапе. Поэтому сравнительное изучение структурно-функциональной организации детерминант патогенности штаммов разного происхождения с неодинаковой эпидемической значимостью и штаммов псевдотуберкулезного микроба, особенно 01 серотипа - наиболее близкой к чумному микробу эволюционной ветви, будет еще долгое время актуальным.
Область pgm Yersinia pestis (102 т.п.н.) состоит из двух регионов: «острова* высокой- патогенности»'-. оперона сидерофорзависимой системы утилизации; железа и hms региона^, обеспечивающего сорбцию гемина: на поверхности; микробной клетки: [125]. Оба региона участвуют в обеспечении чумного микроба необходимым для» жизни микроэлементом - железом. «Острова высокой патогенности»- у иерсиний' высокрконсёрвативны. їїеньї, расположенные на «острове1 высокой патогенности»^ не кодируют белки;-агрессии, но необходимы для выживания и нормального» размножения^ в организметеплокровныхживотных[139; 153].
Регион hms включает три функциональные области:, кластер генов, мембранных белков; hms: оперон и- ast оперощ отвечающий^ за утилизацию; аргинина. Экспрессию- hms генов; обеспечивающих; сорбцию гемина; связывают, со? способностью: чумного;» микроба» к образованию блока преджелудка у блохой; относят к--'факторам', способствующим трансмиссивному пути передачи-патогена [Г42]. В- настоящее времяї основным* биологическим. ' свойством, детерминируемым- этим; регионом?; считается образование биопленки^ способствующей блокообразованию: Интересно.; что бйопленку ..-образуют как штаммы чумного,.так- и штаммы псевдотубёркулезного микроба, но способность.блокировать преджелудок блох отмечается только у штаммов чумного; микроба. Причины этого: пока- не ясны. Штаммы биоваров orientalis, medievalis,. antiqua и microtias в; зависимости . от географического происхождения имеют некоторые различия в структурной организации pgm области, что выражается; в различной; стабильности признаков пигментации (Hms) и; чувствительности к пестицину (Psn); ассоциированных с pgm областью, а также в различных типах мутаций- по- этим признакам [149]t. У штаммов- псевдотуберкулезного микроба выявлены структурные особенности;; pgm- области, отличающие их от классических штаммов чумного-микроба,. но сближающих со штаммами* биовара; microtias; с: ослабленной? вирулентностью: у , Примером этого может служить отсутствие IS 100 элемента, ограничивающего
8 pgm область со стороны hms оперона, приводящее к отсутствию образования Apgm мутантов, у штаммов псевдотуберкулезного микроба [103] и авирулентных для человека штаммов биовара microtus [207]. В то время как, у высоковирулентных штаммов биоваров orientalis, medievalis и antiqua pgm область фланкирована двумя IS 100 элементами, вызывающими рекомбинационный процесс с утратой всей области [125, 177].
Штаммы чумного микроба пяти подвидов: основного и неосновных -кавказского, алтайского, гиссарского, улэгейского и таласской группы, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, имеют фенотипические различия, связанные с генами pgm области. Штаммы неосновных подвидов редко образуют Hms" мутанты (10" ). Штаммы основного подвида образуют такие мутанты в результате делеции всей области пигментации с частотой 10"5 [33]. Структурная организация hms региона штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба не изучена. Выявление областей вариабельных для чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба с одной стороны, даст новые сведения об эволюции патогенных иерсиний, с другой стороны, послужит основой при разработке тест-систем для идентификации и молекулярного типирования этих патогенов. С этой точки зрения представляется важным провести видовое и внутривидовое сравнительное изучение структурной организации hms региона у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.
Цель работы - провести сравнительный структурно-функциональный анализ hms — областей Yersiniapestis и Yersinia pseudotuberculosis.
Задачи исследования:
1,. Подобрать И\охарактеризовать штаммы чумного и псевдотуберкулезного. микробов разного происхождения-по основным?признакам, ассоциированным. с вирулентностью, и их генетическим детерминантам. Создать коллекцию ' штаммов Yersinia pestis'. И' Yersinia- pseudotuberculosis для сравнения хромосомного^ сегмента пигментации;
Выявить, и охарактеризовать вариабельные: области на сегменте пигментации для штаммов^чумногоишсёвдотуберкулезног0:микробовфазног0й происхождения с помощью метода ПЦР:
Определить и сравнить нуклеотидные последовательностиr/zms оперонов и вариабельных, концевых частей, сегмента: пигментации (ген порина)гу-штаммов чумного и псевдотуберкулезногомикроба разного происхождения.:
А. Разработать экспериментальную ГЩР систему для? дифференциации». .
вирулентных' и- авирулентных штаммов . чумного, микроба:- разного
происхождения^ и для выявления-авирулентных штаммов?(клонов), утративших
область, пигментации. .
5. Установить механизмы blms7 Psh: мутаций у вакцинного штамма Yesinia
pestis EV линии;ЬШИЭГ. . .
Научная новизна работы
Выявлены видовые и внутривидовые различия' в стабильности» сохранения признаков, ассоциированных с детерминантами вирулентности-(pgm областью и pCad) у штаммов чумногои псевдотуберкулезного микробов. Установлено, что частота мутаций по HmSj Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два - четыре порядка выше; чем у штаммов . чумного микроба. Эти данные свидетельствуют о: том, что-у штаммов чумного , микроба в процессе-эволюции произошла стабилизация основных детерминант вирулентности - генов: области пигментации и плазмиды. pCad;. Обнаружена" группа штаммов;чумного микроба основного подвида с частотой мутаций по
10 Hms признаку, характерной для штаммов неосновных подвидов. Показано, что снижение частоты и тип мутаций по Hms признаку у этой группы штаммов связаны со структурными особенностями краевого региона области пигментации — отсутствием одного из фланкирующих IS 100 элементов. Впервые было показано, что у штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 и ОЗ серотипа к Psn" фенотипу приводят разные типы мутаций. Впервые выявлены и охарактеризованы штаммы псевдотуберкулезного микроба Ol серотипа с областью пигментации, фланкированной IS 100 элементами. Установлено, что ориентация IS 100 элемента и сайт встраивания его в ген порина, различны у штаммов чумного микроба основного подвида и группы штаммов псевдотуберкулезного микроба Ol серотипа. Впервые установлено, что концевая часть области пигментации штаммов псевдотуберкулезного микроба ОЗ серотипа не содержит последовательности гена порина и гена сукцинилглютаматдесукцинилазы агиЕ аргининового оперона.
Впервые выявлены четыре области перспективные для разработки системы типирования методом мультилокусного секвенировапия вариабельные для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Три из них расположены в межгенных пространствах и одна - в области гена порина (YP01967). Впервые выявлена область, проявляющая для чумного микроба вариабельность на видовом и подвидовом уровнях. Эта область локализована между генами hutG и YP01967.
Получены новые сведения о высокой консервативности нуклеотидных последовательностей hms оперонов у штаммов чумного микроба пяти подвидов и таласской группы, что свидетельствует о важной биологической роли этой структуры.
Впервые на молекулярно-генетическом уровне получены доказательства делетирования области пигментации у вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов, а, следовательно, невозможности спонтанной реверсии вирулентных свойств.
Положения, выносимые на защиту
Создана коллекция штаммов чумного ипсевдотуберкулезного микробов, пригодная для проведения сравнительного анализа их hms областей.
Возбудители чумы и псевдотуберкулеза имеют выраженные отличия по частоте наследования основных признаков/ связанных с вирулентностью. Частота- потери этих признаков в 100 — 1000 раз выше у штаммов псевдотуберкулезного микроба, чем у штаммов чумного микроба.
Структурная организация сегмента пигментации (hutG - YPO1950 регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов/имеет существенные видовые и- внутривидовые различия. Выявлены четыре вариабельные области, которые могут быть использованы для усовершенствования, методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.
Области пигментации у штаммов псевдотуберкулезнопу микроба ОЗ серотипа- содержат полноценный ybt регион. Psn" мутанты у штаммов псевдотуберкулезного микроба образуются в результате трех типов мутаций.
Разработанные экспериментальные ПЦР системы пригодны для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба и для выявления авирулентных штаммов, утративших область пигментации.
Вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, что исключает у него спонтанную реверсию вирулентности.
Практическая значимость работы
По результатам работы получены патенты на изобретения зарегистрированные в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации- чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой
12 дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464. Составлены методические рекомендации: «Способ дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и потенциально вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба», «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов», «Мультиплексная ПЦР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis разного происхождения», одобренные Учёным советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол №1 от 16.03.2007г., протокол №2 от 17.04.2007г., протокол №5 от 22.06.2007г. - соответственно) и утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» по учрежденческому уровню внедрения.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и доложены на ежегодных
итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006 и 2007
гг.), а так же на конференции «Молодые учёные в медицине», (IX
Всероссийская научно-практическая конференции Молодые учёные в
медицине посвященная 190-летию Казанского государственного медицинского
университета, Казань 2004г.) и симпозиуме «Генетика в XXI веке:
современное состояние и перспективы развития», Москва 2004г. Выступления
на конференциях (Казань, 2004 и Москва, 2004) были высоко оценены
оргкомитетами с присуждением дипломов за лучший доклад. Так же
результаты исследования были представлены на следующих конференциях: II
Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием,
«Инфекции, обусловленные иерсиниями» Санкт-Петербург 2006; IX съезд
Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов,
микробиологов и паразитологов Москва 2007; VI Всероссийского научно-практическая, конференция Москва 2007; X Всероссийская медико-
13 биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" Санкт-Петербург, 2007; VIII Межгосударственная научно-практическая конференции государств участников СНГ Саратов 2007; Экофорум Санкт-Петербург 2008, IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств участников СНГ Волгоград, 2008.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, одна - в изданиях рекомендованных ВАК и две оформлены в виде патентов на изобретения «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464.
Структура и объём диссертации
Диссертация представлена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель содержит 208 отечественных и зарубежных источников.
''':'..'.' : 14 .* . ^ : '
