Введение к работе
Актуальность проблемы. Чума - острое инфекционное заболевание, относящееся к группе особо опасных карантинных инфекций. Возбудитель чумы, Yersinia pestis, - самый опасный из бактериальных патогенов. Чума была причиной трех пандемий и привела к гибели более 200 миллионов человек. Эта природно-очаговая инфекция передается укусами кровососущих насекомых - блох и циркулирует в популяциях диких грызунов, но при легочной форме может передаваться непосредственно от человека к человеку [Perry, Fetherston, 1997]. Помимо чумного микроба, род Yersinia включает в себя еще 14 видов [Souza et al, 2010], два из которых - Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, вызывают у человека заболевания желудочно-кишечного тракта [Brubaker, 1991]. Данные молекулярно-биологических исследований указывают на то, что вид Y. pestis произошел от Y. pseudotuberculosis 0:1b серотипа [Skurnik et al, 2000] в последние 1500-20000 лет [Achtman et al, 2004]. Природные очаги чумы имеются на всех материках, кроме Австралии и Антарктиды, занимая 6-7 % территории земного шара [Perry, Fetherston, 1997]. На территории бывшего Советского Союза насчитывается 42 природных очага чумы, 11 из них - в Российской Федерации [Онищенко, Кутырев, 2004]. Следствием географической и физической разобщенности природных очагов, влияния различных биотических и абиотических факторов, явилась адаптация, в результате которой чумной микроб приспособился к циркуляции в популяциях более 200 видов диких грызунов и лагоморфов, используя около 120 видов блох в качестве переносчиков [Онищенко, Кутырев, 2004]. В процессе аллопатрического видообразования сформировались подвиды, различающиеся по своим питательным потребностям, способности ферментировать различные субстраты и вирулентности для чувствительных к ним млекопитающих. До недавнего времени вид Y. pestis подразделяли на шесть подвидов: pestis, altaica, caucasica, hissarica, talassica и ulegeica [Anisimov et al, 2004]. По биохимической активности внутривидовые группы Y. pestis делили на три биовара: antiqua, mediaevalis, orientalis [Devignat, 1951].
Для типирования Y. pestis применяют как фенотипические, так и генетические методы. В основу фенотипических методов положены питательные потребности, способность ферментировать различные субстраты, и вирулентность для различных видов животных. Хотя фенотипические методы и позволяют различать подвиды и биовары Y. pestis, с их помощью невозможно проводить дифференциацию на уровне штаммов. К тому же нестабильность проявления фенотипических признаков, их зависимость от условий эксперимента, а также наличие атипичных штаммов, существенно затрудняют интерпретацию результатов [Апарин, Голубинский, 1989; Anisimov et al, 2004].
В связи с этим, решающую роль в типировании чумного микроба, играют молекулярно-биологические методы. В разное время с этой целью использовали плазмидный скрининг [Ба-
4 лахонов, 1989; Filippov et al, 1990], определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов - RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) [Picard, 2000], риботипирование [Guiyoule et al, 1994], IS-типирование [Бобров, 1995; Motin et al, 2002; Torrea et al, 2006], и PCR-фингерпринт. К методам PCR-фингерпринта относятся случайно амплифицированные полиморфные ДНК - RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA) [Huang et al, 2000], повторяющиеся экстрагенны палиндромы - REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic sequences) [Kim et al, 2003] и повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности эн-теробактерий ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequences) [Kingston J.J., et al, 2009]. Общими недостатками этих методов являются: низкая межлабораторная воспроизводимость, необходимость в большом количестве материала для исследования, сложность использования полученных результатов для создания совместимых баз данных.
Доступность полной нуклеотидной последовательности геномов микроорганизмов [Parkhill et al, 2001] послужила толчком для развития новых современных молекулярно-генетических методов. В настоящее время для генотипирования Y. pestis широко используют многолокусный анализ вариабельных тандемных повторов - MLVA (Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) [Klevytska et al, 2001; Le Fleche et al, 2001], DFR-типирование - анализ отличающихся участков ДНК (Different Region), CRISPR-типирование (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - кластеризованные короткие па-линдромные повторы, разделенные спейсерами) [Pourcel et al, 2005]. SNP-типирование -анализ полиморфизма единичных нуклеотидов (Single-Nucleotide Polymorphism) [Schork et al, 2000], полно геномный сиквенс [Eppinger et al, 2010]. Данные методы лишены перечисленных выше недостатков и обладают высокой разрешающей способностью.
Активизация в конце XX века ряда природных очагов чумы Африки, Азии и Америки послужила причиной увеличения заболеваемости людей бубонной и легочной формами данной инфекции, что указывает на нестабильность эпидемиологической обстановки [Онищен-ко и др., 1998]. Не меняется эта тенденция и в начале XXI века [Онищенко, Кутырев, 2004]. Возрастание числа эпидемических проявлений чумы, наряду с возможностью перемещения авиатранспортом инфицированных Y. pestis людей в течение нескольких часов с одного континента на другой, а также возрастающая опасность международного терроризма свидетельствуют об актуальности совершенствования молекулярно-эпидемиологических методов, направленных на генетическую паспортизацию штаммов Y. pestis из различных природных очагов, необходимую для выявления источников заражения и проведения адекватных лечебных и санитарно-эпидемиологических мероприятий. В условиях сложившейся эпидемической ситуации развитие и использование новых методов в клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях приобретает особое значение. В качестве наиболее перепек-
5 тивных, следует выделить молекулярно-биологические методы, особенно комплексное сочетание нескольких методов [Shangkuan et al, 1997; Sander et al, 1998], что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевременно локализовать очаги чумы.
Изучение разнообразия и микроэволюции Y. pestis важно как для решения фундаментальных задач медицинской микробиологии, таких как выявление механизмов происхождения и эволюции инфекционных болезней человека и животных, так и для разработки новых высокоспецифичных методов молекулярной эпидемиологии, а именно идентификации, гено-и геномотипирования Y. pestis. Генотипирование - один из наиболее эффективных и относительно недорогих методов, применяемых для целей паспортизации природных очагов, эпидемиологического расследования случаев заболеваний и экспертизы актов биотерроризма.
Цель исследования - изучение генетического разнообразия и микроэволюции чумного микроба из природных очагов Российской Федерации и сопредельных государств методами DFR- и MLVA-типирования.
Задачи исследования:
1. Создать пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (DFR- и
МЦУА25-профилей) представительного набора штаммов Y. pestis, включающий данные, по
лученные в нашей лаборатории, лабораториях коллабораторов: Gilles Vergnaud (Universite
Paris-Sud, Institut de Genetique et Microbiologie, Orsay, France) и Ruifu Yang (Laboratory of
Analytical Microbiology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of
Microbiology and Epidemiology, Beijing, China), а также информацию о штаммах с доступны
ми в Интернете полными последовательностями геномов.
Провести DFR-типирование штаммов Y. pestis; оценить дискриминирующую способность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возможность использования для оценки микроэволюции.
Провести многолокусный VNTR анализ штаммов Y. pestis; оценить дискриминирующую способность метода, корректность кластеризации внутривидовых групп и возможность использования для оценки микроэволюции; сравнить эффективность MLVA25- и DFR-типирования.
Подготовить предложения по дополнению внутривидовой таксономии Y. pestis и привидению ее в соответствие с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий.
Научная новизна. Обнаружено 60 новых DFR-генотипов и 352 новых MLVA25-генотипов штаммов чумного микроба. Установлено, что на территории одного природного очага чумы может циркулировать несколько DFR-, MLVA25- и DFR/MLVA25-reHOTnnoB, входящих в единый генетический кластер. В то же время одинаковые DFR-типы могут вхо-
дить в состав разных MLVA25- и DFR/MLVA25-^acrepoB, что свидетельствует о возможности гомоплазии по DFR-профилям. Циркуляция филогенетически близких MLVA25- и DFR/MLVA25 -генотипов на территориях смежных природных очагов свидетельствует о целесообразности их объединения. Так, Присеванский горный (5) и Зангезуро-Карабахский горный (6) очаги должны быть объединены в Нагорно-Закавказский (5/6), Бозчельский равнинно-предгорный (8) и Джейранчельский равнинно-предгорный (11) - в Бозчельско-Джейранчельский равнинно-предгорный (8/11), а к Горно-алтайскому очагу (36) - присоединены соответствующие территории Монголии. Кластеризация на основе DFR- и MLVA-профилей соответствует таковой при SNP-типировании, а сочетанный анализ результатов DFR- и MLVA-методов повышает их разрешающую способность и позволяет получать фи-лограммы, свидетельствующие о следующем порядке дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы: Y. pseudotuberculosis Т Y. pestis bv. antiqua (африканская ветвь) TY. pestis subsp. angola TY. pestis subsp. caucasica TY. pestis bv. intermedium TY. pestis bv. antiqua (азиатская ветвь) T Y. pestis bv. medievalis T Y. pestis bv. orientalis T Y. pestis subsp. ulegeica T Y. pestis subspp. qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.
Практическая значимость и внедрение результатов работы. В GeneBank депонировано 8 последовательностей VNTR-локусов (международный уровень внедрения).
В коллекции микроорганизмов ГГЩ ГГМБ депонирован набор из 10 штаммов Y. pestis - типовых для многолокусного VNTR анализа (федеральный уровень внедрения).
Создан постоянно пополняемый электронный каталог "геномных портретов" (DFR- и MLVA25, включающий на момент написания диссертации информацию о 601 штамме Y. pestis.
Установлено, что выделенные на территории Монголии штаммы подвида altaica входят в состав двух разных ветвей кластера talassicalqinghaiensislxilingolensislhissaricalaltaica, один из которых представлен штаммами близкими штаммам подвида altaica, циркулирующим на территории Горного Алтая в России. Второй кластер представлен штаммами подобными штаммам подвида xilingolensis, циркулирующим в L очаге на территории Китая. Необходима проверка штаммов подвида altaica в коллекциях учреждений, проводящих работы с возбудителем чумы для определения их действительного таксономического положения.
Изучение штаммов Y. pestis методами DFR- и MLVA-типирования рекомендовано нами в качестве одного из дополнительных критериев внутривидовой классификации возбудителя чумы.
Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении методических рекомендаций "Генотипирование штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного VNTR-анализа". Оболенск, 2009 (учрежденческий уровень внедрения). Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов Пущинского государст-
7 венного университета и аспирантов ГНЦ ПМБ, а также при обучении современным методам генотипирования специалистов противочумных учреждений. Положения, выносимые на защиту:
Разработанный комплекс методических приемов (электронный каталог, включающий информацию о DFR- и МЬУА25-генотипах 601 штамма Y. pestis, а также методические рекомендации по проведению молекулярного типирования методом MLVA25) позволяет определять принадлежность штаммов чумного микроба к конкретным подвидам и биоварам, а также к природным очагам чумы: 1, 4, 5-7, 8/11, 9, 10, 31/33, 34, 36, 37, 38, 39, 40/М, 43, расположенным на территории стран СНГ.
Сочетание универсальной вирулентности со способностью ферментировать рамнозу, а также ВГК/МЬУА25-профиль, занимающий промежуточное положение между таковыми у представителей азиатской ветви bv. antiqua и кавказской группой штаммов bv. microtus, позволяет выделить штаммы, циркулирующие в очаге В Китая в новый внутривидовой таксон - биовар intermedium.
Сочетанное использование ВГК/МЬУА25-типирования позволяет предложить следующий порядок дивергенции в ходе микроэволюции возбудителя чумы: Y. pseudotuberculosis Т Y. pestis bv. antiqua (африканская ветвь) Т Y. pestis subsp. angola Т Y. pestis subsp. caucasica T Y. pestis bv. intermedium T Y. pestis bv. antiqua (азиатская ветвь) T Y. pestis bv. medievalis T Y. pestis bv. orientalis T Y. pestis subsp. ulegeica T Y. pestis subspp. qinghaiensis, talassica, xilingolensis, hissarica и altaica.
Несоответствие правилам Международного кодекса номенклатуры бактерий внутривидовой таксономии чумного микроба требует переименования биовара microtus в подвид microtus, а входящих в него в настоящее время филогенетических групп, а именно подвидов altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis - в биовары altaica, angola, caucasica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis.
Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций (ЛМЧ) ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руководитель - к.м.н. СВ. Дентовская); проекта РФФИ № 08-04-00405-а (научный руководитель -д.м.н., проф. А.П. Анисимов) и Госконтрактов № П9-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01890017743) и № 53-Д от 29.06.2010 г. с Роспотребнадзором (научный руководитель -д.м.н., проф. А.П. Анисимов).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с В.В. Евсеевой (ЛМЧ ГНЦ ПМБ). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали
8 участие сотрудники ЛМЧ ГНЦ ПМБ Е.В. Чиркова и Т.В. Гапельченкова. Всем им автор выражает глубокую благодарность. Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы к.м.н. СВ. Дентовской (ЛМЧ ГНЦ ПМБ) и д.м.н., проф. А.П. Анисимова (ГНЦ ПМБ) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на: NIAID Research Conference (Opatija, Croatia, 2006); VTI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Оболенск, 2006 г.); 9 International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, 2006); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Инфекции, обусловленные иерсиния-ми" (Санкт-Петербург, 2006); научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 2007); 9th Symposium of Analytical Microbiology (Beijing, People's Republic of China, 2007); NATO Science for Peace and Security Programme Advanced Research Workshop "Emerging and Endemic Pathogens: Advances in Surveillance, Detection, and Identification" (Тбилиси, Грузия, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" (Оболенск, 2009); научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней", посвященной 75-летию Иркутского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, 2009); научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора "Современные технологии обеспечения биологической безопасности" (Оболенск, 2010); 101 International Symposium on Yersinia (Recife, Brazil, 2010); International Symposium on Bacterial Evolution and Pathogenesis (Zhenjiang, Jiangsu province, China, 2010).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях (три статьи в международных рецензируемых журналах, реферируемых ISI).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 49 работ отечественных и 112 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 10 таблицами.
