Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .
1.1. Бактериофаги патогенных вибрионов и их применение
1.1.1. Бактериофаги холерных вибрионов .
1.1.2. Бактериофаги Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus
1.1.3. Бактериофаги других видов вибрионов (Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio metschnikovii)
ГЛАВА 2. Материалы и методы .
2.1 Материалы
2.1.1. Бактериальные штаммы
.1.2. Бактериофаги .
2.1.3. Сыворотки
1.4. Питательные среды
2.2. Методы
2.2.1. Методы выделения фагов из культур патогенных вибрионов
2.2.2. Метод выделения фагов из проб воды поверхностных водоёмов и сточных вод
2.2.3. Метод размножения бактериофагов .
2.2.4. Метод получения антифаговой сыворотки .
2.2.5. Метод изучения серологических свойств бактериофагов .
2.2.6. Изучение морфологии негативных колоний
2.2.7.. Изучение строения корпускул фага .
2.2.8. Метод изучения диапазона литической активности и специфичности фагов .
2.2.9. Метод изучения одиночного цикла развития фага...
2.2.10. Методы определения устойчивости фагов патогенных бактерий к воздействию различных факторов
2.2.11. Метод фаготипирования холерных и парагемолитических вибрионов .
2.2.12. Методы статистической обработки результатов .
Глава 3. Сравнительное изучение биологических свойств бактериофагов, выделенных из токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов о1 серогруппы .
3.1. Поиск штаммов-продуцентов фагов среди холерных вибрионов классического биовара и характеристика продуцируемых бактериофагов 3.2. Умеренные фаги, выделенные из атоксигенных штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, изолированных от людей .
3.3. Литическая активность холерных бактериофагов эльтор в отношении холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп .
3.3.1. Сравнение свойств холерных бактериофагов с фагами Vibrio mimicus
3.4 Применение набора индикаторных штаммов для выделения бактериофагов холерных вибрионов из водных объектов города Ростова-на-Дону .
ГЛАВА 4. Бактериофаги vibrio cholerae серогруппы
4.1. Выявление спонтанной фагопродукции у штаммов V. cholerae О139 на новых индикаторных штаммах О1 и О139 серогрупп .
4.2. Внутривидовая дифференциация штаммов V. cholerae О139 серогруппы фаговыми методами .
ГЛАВА 5. Биологическая характеристика бактериофагов парагемолитических вибрионов
5.1. Изучение биологических свойств фагов парагемолитических вибрионов различного происхождения .
5.2. Способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов различных морфогрупп
5.3. Усовершенствование схемы фаготипирование V. parahaemolyticus
ГЛАВА 6. Разработка схемы идентификации и дифференциации бактериофагов холерных и парагемолитических вибрионов .
6.1. Критерии первичной характеристики бактериофагов при их идентификации
6.2. Дифференциация бактериофагов холерных и парагемолитических вибрионов
Заключение .
Выводы .
Список использованной литературы .
- Бактериофаги Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus
- Метод размножения бактериофагов
- Литическая активность холерных бактериофагов эльтор в отношении холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп
- Способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов различных морфогрупп
Введение к работе
Актуальность проблемы. Продолжающаяся седьмая пандемия холеры привлекла пристальное внимание исследователей к проблеме патогенных для человека вибрионов. Вспышка холеры, обусловленная холерными вибрионами О139 серогруппы, сходство этого возбудителя с вибрионами эльтор объясняют повышенное внимание исследователей к новому эпидемическому фактору холеры (Москвитина Э.А. с соавт. 2011; Иванова С.М. с соавт., 2011). Бактериофаги являются постоянным спутником патогенных вибрионов, а их присутствие в клетках бактерий приводит к появлению новых свойств (Остроумова Н.М. с соавт., 1971; Милютин В.Н. с соавт., 1980; Остроумова Н.М. с соавт., 1993; Смирнова Н.И. с соавт., 1999; Щелканова Е.Ю. с соавт., 2001; Ерошенко Г.А. с соавт., 2000, 2003; Ильина Т.С., 2003; Davis B.M. et al., 2003). Детальное изучение механизмов взаимоотношения бактериофагов с клеткой хозяина имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение (Сомова А.Г., 1968; Дрожевкина М.С., 1974; Остроумова Н.М. с соавт., 1986; Кудрякова Т.А. с соавт., 2003; Faruque S.M. et al., 2003, 2005). Актуальность проблемы заключается в выявлении общих закономерностей строения биологических структур бактериофагов, которые затем используют для их определения и классификации.
Наиболее важным этапом в лабораторной диагностике патогенных вибрионов является их выделение и идентификация (Ломов Ю.М. и др., 1994; Данилкина Е.Б., 1995; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»).
В настоящее время из фагов патогенных вибрионов наиболее изучены холерные бактериофаги, которые широко используются для диагностики и дифференциации возбудителя холеры (Быстрый Н.Ф., 1974; Дрожевкина М.С., Арутюнов Ю.И., 1979; Кудрякова Т.А. с соавт., 2000; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Саяпина Л.В. с соавт., 2001; Безсмертный В.Е. с соавт., 2005; Ломов Ю.М. с соавт., 2008;).
Вместе с тем, сохраняет свою актуальность фагодиагностика V. cholerae O139 серогруппы «Бенгал», так как диагностические фаги холерных вибрионов непригодны для идентификации этого вида возбудителя.
Кроме того, недостаточно разработано применение бактериофагов в лабораторной диагностике парагемолитических вибрионов. Крупные вспышки пищевых токсикоинфекций, вызванные этими вибрионами, были зарегистрированы в 1990-2000 годах в г. Владивостоке, в странах Юго-Восточной Азии, США, Канаде, Перу (Маслов Д.В., 1997; Wong H.C. et al. 2000; Williams T.L. et al., 2004; Nair G.B. et al., 2007; Boyd F., Fidelma et al., 2008).
В последние годы накопились сведения о фагах парагемолитических и альгинолитических вибрионов ( Кудрякова Т.А. и др., 2002, 2003; Chang B. et. al., 1998, 2002; Nasu H. et al., 2000; Tetsuya I. et al., 2001). Создана схема фаготипирования парагемолитических вибрионов (Кудрякова Т.А. и др., 1993; Хайтович А.Б. и др., 1997; Гальцева Г.В. и др., 1997). Однако фаготипирование парагемолитических вибрионов показало распространение вибрионов, дающих типы литических реакций, не укладывающихся в существующую схему фаготипирования, в связи с чем необходимо её совершенствование. Для первичной идентификации различных по морфологической структуре фагов необходимо иметь набор фагочувствительных штаммов.
До настоящего времени остается нерешенной проблема идентификации и дифференциации большой группы бактериофагов патогенных для человека вибрионов (V. cholerae и V. parahaemolyticus). Вместе с тем, для исследовательских целей и решения прикладных задач важно учитывать признаки бактериофагов, позволяющие выявить сходство и различия между ними.
Наличие в Центре по патогенным вибрионам ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора представителей различных видов вибрионов сделало реальным проведение среди них поиска продуцентов ранее неизвестных фагов.
Цель работы. Совершенствование идентификации бактериофагов и их применение для внутривидовой дифференциации холерных и парагемолитических вибрионов.
Задачи исследования
-
Выделение бактериофагов из лизогенных штаммов холерных и других патогенных вибрионов.
-
Расширение набора индикаторных штаммов патогенных вибрионов (холерных, парагемолитических) для обнаружения бактериофагов различных морфологических групп.
-
Характеристика биологических свойств бактериофагов патогенных видов вибрионов.
-
Дифференциация штаммов V. cholerae O139 серогруппы фаговым методом.
-
Усовершенствование схемы фаготипирования V. parahaemolyticus.
-
Разработка схемы идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов.
Научная новизна работы. Выявлены умеренные фаги у различных видов патогенных вибрионов (V. cholerae О1, О139 серогрупп, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. alginolyticus), и было проведено сравнение биологических свойств, что позволило использовать их для научных исследований и в диагностике возбудителей ОКИ.
Впервые разработана внутривидовая дифференциация штаммов холерных вибрионов О139 серогруппы путём прямого и непрямого фаготипирования. Получен патент на изобретение «Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae O139» (№ 2268942 от 27.01.2006 г.). Использование предлагаемого способа позволяет с помощью индикаторных штаммов КМ-199 и КМ-152 проводить фаготипирование V. cholerae О139 серогруппы, получая при этом дополнительные характеристики холерных вибрионов, выделяемых из клинического материала. Впервые обнаружены бактериофаги V. mimicus по биологическим свойствам сходные с холерными фагами. Фаги V. mimicus были депонированы в ФКУЗ Ростовском-на-Дону противочумном институте Роспотребнадзора под № ФК-85 и № ФК-98.
Усовершенствована схема фаготипирования парагемолитических вибрионов, что позволило определить среди них 10 фаготипов вместо 4-х известных ранее, и повысить эффективность типирования штаммов с 48,4 % до 92,6 %.
Впервые разработан способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от бактериофагов I морфогруппы (Патент №2290445 от 27.12.2006 г.).
Впервые разработана общая схема идентификации, позволяющая выявить существенные различия между фагами некоторых видов патогенных вибрионов. Дополнена коллекция охарактеризованных фагов и индикаторных штаммов патогенных вибрионов. Составлен 4 выпуск «Каталога бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов и иерсиний», который одобрен Ученым советом и утверждён директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (01.03.11 г., протокол №1) и опубликован в виде реферата в Информационном выпуске №24 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2011). Получено свидетельство о регистрации в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» №2010620549 от 24.09.2010.
Теоретическая и практическая значимость. Новые сведения о свойствах большой группы бактериофагов различных видов патогенных вибрионов расширяют наши познания о биологическом разнообразии вирусов бактерий. Анализ полученных данных позволяет установить не только их общность как представителей единого семейства бактериофагов, но и различия, отражающие дивергенцию этих видов в процессе эволюции. Способность генетических элементов бактериофагов включаться в клетки бактерий делает их хорошей моделью для изучения геномной пластичности вибрионов. Диагностические бактериофаги пригодны для идентификации вибрионов, а также для изучения физиологических свойств и поверхностных структур фагочувствительных штаммов, установления биологической эффективности любого воздействия.
Так как своевременное определение вида бактериофага крайне важно при его выделении из материала от людей больных холерой, острыми токсикоинфекциями, гастроэнтеритами или из объектов окружающей среды, проведение исследования осуществляется с соблюдением следующих этапов:
- использование специфических индикаторных штаммов холерных вибрионов, пригодных для выделения холерных бактериофагов (V. eltor KM-199, V. cholerae O139 KM-152);
- использование системы индикаторных штаммов, позволяет проводить первичную идентификацию холерных бактериофагов;
- использование депонированных тест-штаммов V. parahaemolyticus КМ-97, КМ-184 для первичной дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогруппы;
- использование единой комплексной схемы анализа биологических свойств вибриофагов.
Определён комплекс идентификационных и дифференцирующих признаков бактериофагов у следующих вибрионов – V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. metschnikovii. Отмеченные чёткие таксономические показатели, полученные при сравнительном изучении бактериофагов патогенных вибрионов, легли в разработанную нами схему идентификации и дифференциации, включающую признаки их отличия: а) характерная морфология бактериофагов в электронном микроскопе – определение морфогруппы; б) специфичность литического действия, подтверждаемая на соответствующих видах микроорганизмов, применение тест-штаммов вибрионов; в) отсутствие антигенного родства с бактериофагами других видов; г) устойчивость, либо чувствительность к хлороформу и повышенной температуре.
Предложенный набор фагочувствительных штаммов V. cholerae О1 (ctx+tcp+, ctx-tcp+), V. cholerae O139 серогруппы (ctx+tcp+) для выделения холерных фагов при мониторинге окружающей среды на вибриофлору позволяет обнаруживать бактериофаги. Морфо- и серогруппы изолированных холерных фагов коррелируют с обнаруженными фагами в лизогенных штаммах холерных вибрионов эльтор, циркулирующими в реках в эпидемический сезон.
Впервые установлена особенность взаимодействия выделенных фагов V. mimicus с гетерологичным хозяином V. cholerae, проявляющаяся в литической реакции со штаммом V. cholerae О37 серогруппы. Разработан способ дифференциации фагов V. mimicus от холерных с помощью индикаторного штамма V. cholerae 13022-69 О37 серогруппы, что используется для их отличия от холерных фагов при исследовании проб воды на вибриофаги.
Предложен способ для внутривидовой дифференциации штаммов V. cholerae O139 серогруппы с применением фаговых методов.
Депонированы в ГКПБ ФКУЗ Российский противочумный институт “Микроб” Роспотребнадзора штамм-продуцент фага V. parahaemolyticus, индикаторный штамм V. parahaemolyticus. Депонированы в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора фаги: Phagum parahaemolyticus ФК-90 (67) – I морфогруппы, использующийся для дифференциации индикаторных штаммов Vibrio parahaemolyticus КМ-184 и КМ-97; Phagum parahaemolyticus ФК-104, выделенный из штамма серогруппы О5:К15 и Phagum parahaemolyticus ФК-105, выделенный из штамма серогруппы О3:К6, которые могут использоваться в генетических исследованиях.
Полученные результаты нашли отражение в «Методических рекомендациях по идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов», одобренных Ученым советом и утвержденные директором ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (23.03.04 г., протокол № 4) и опубликованных в виде реферата в Информационном выпуске №17 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2004).
Материалы по фаговым методам лабораторной диагностики заболеваний, обусловленных V. cholerae О1 и не О1 серогрупп, V. parahaemolyticus, представлены на курсах профессиональной переподготовки врачей и биологов по специальности «бактериология» и на курсах повышения квалификации. Внедрён в лабораторную практику метод дифференциации штаммов и бактериофагов парагемолитических вибрионов (ФКУЗ «Северо-Кавказская противочумная станция» Роспотребнадзора, акт внедрения от 12.01.2011 г.). Результаты фаговых методов идентификации музейных и свежевыделенных штаммов холерных и парагемолитических вибрионов используются для паспортизации штаммов холерных и парагемолитических вибрионов, хранящихся в Музее живых культур ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора (акт внедрения от 19.10.11 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Система индикаторных штаммов (холерных и парагемолитических) позволяет осуществлять первичную идентификацию фагов патогенных вибрионов.
2. Усовершенствование схемы фаготипирования расширяет возможности фаготипирования парагемолитических вибрионов.
3. Применение бактериофагов, выделенных из штаммов V. cholerae O139 серогруппы «Бенгал», позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов V. cholerae O139 серогруппы.
4. Использование схемы идентификации для фагов патогенных вибрионов обеспечивает сравнительную оценку сходства и различий между фагами (V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. mimicus).
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 15 научных конференциях: Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы», (Ростов-на-Дону, 2003-2005, 2008, 2010, 2011, 2012); IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», (Волгоград, 2008 г.); X Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ», (Ставрополь, 2010 г.); IX и X Межвузовские конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2010, 2011 гг.); Научно-практическая школа-конференция молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010, 2011 гг.); IV Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2012); Научно-практическая конференция Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 2012).
Диссертационная работа выполнена в рамках завершенной государственной темы № 050-4-04 «Идентификация и дифференциация бактериофагов патогенных вибрионов» и темы № 103-4-08 «Фено- и генотипическая характеристика парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности».
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.
Публикации результатов исследований. По теме диссертационного исследования опубликовано 27 работ, в том числе 3 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени, получено 2 патента на изобретение, получено свидетельство о государственной регистрации базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов».
План диссертационной работы утверждён на заседании Ученого совета ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора (протокол №3 от 01.04.2005).
Структура работы. Диссертация изложена на 155 странице и состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав результатов собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения, выводов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 10 рисунками. Библиографический указатель содержит 313 источников, из которых 185 – отечественных, 128 – иностранных.
Бактериофаги Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus
Бактериофаг – вирусоподобная частица, способная инфицировать бак-териальную клетку, репродуцироваться в ней, образуя многочисленное по-томство, и вызывать ее лизис, сопровождающийся выходом фаговых частиц в среду обитания бактерий (Гольдфарб Д.М., 1961; Быстрый Н.Ф., 1972; Коро-тяев А.И., Бабичев С.А., 2002; Brashear D.A. et al., 1982; Ricci R. et al., 1999).
Бактериофаги широко распространены в природе. Везде, где имеются бактерии, удаётся обнаружить и паразитирующие в них фаги. Бактериофаги найдены для большинства бактерий, в том числе патогенных и сапрофитных, а также для актиномицетов (актинофаги) и сине-зелёных водорослей. Фаги выделены также из грибов. Встречаются фаги в кишечнике человека и жи-вотных, в растениях, почве, водоёмах, навозе, сточных водах и т.д. (Криви-ский А.С., 1960; Гольдфарб Д.М., 1961; Стент Г., 1965; Коротяев А.И., Баби-чев С.А., 2002).
Интерес к проблеме бактериофагов патогенных вибрионов вызван мно-гими причинами, из основными которых являются удобство использования этого объекта для решения таких вопросов как взаимоотношение вируса с бактериальной клеткой, действия инактивирующих факторов на фаги, измен-чивости свойств бактерий при передаче генетической информации фагами, а также разработкой эффективных методов фагодиагностики возбудителей бо-лезней.
Изучение феномена бактериофагии в истории микробиологии занимает особое место. Простота культивирования, короткий период генерации, высо-кий выход потомства и возможность его точного количественного учета спо-собствовали успешному изучению как структуры фаговых частиц, так и их применению для проведения генетических исследований.
Наиболее широкое применение бактериофаги получили в диагностике бактериальных инфекций, при проведении идентификации и дифференциа-ции выделяемых штаммов микроорганизмов (Адамс М., 1961; Гольдфарб Д.М., 1961; Дрожевкина М.С. с соавт., 1982 б; Караваева Т.Б., 1993; Аниси-мова Т.И. с соавт., 2000; Кудрякова Т.А. с соавт., 2001 а, б, 2002; Ломов Ю.М. с соавт., 2007 в).
Бактериальные вирусы имеют присущие им структурные и биологиче-ские особенности, выработанные в процессе эволюции. По мере все более де-тального изучения разных типов бактериофагов выявляется, что единствен-ное достоверно объединяющее их свойство состоит в размножении в бакте-риальных клетках, которые служат им хозяевами (Стент Г., 1965). Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам (Гольдфарб Д.М., 1961; Стент Г., 1965; Сомова А.Г., 1968; Mukerjee S. et al., 1957, 1961 а, б, в, 1963; Takeya K. et al., 1963, 1967 а, б). Их геном представ-лен либо ДНК, либо РНК и заключён в белковую оболочку (капсид), струк-турные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо куби-ческой симметрии. Крупные фаги, имеющие отросток, устроены по типу би-нарной симметрии (головка – икосаэдр, отросток – спиральная симметрия). Фаги различаются по форме – нитевидные, сферические; фаги, имеющие го-ловку и отросток; по размерам – мелкие, среднего размера и крупные (Коро-тяев А.И., Бабичев С.А., 2002).
Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой скла-дывается из нескольких стадий – адсорбции, проникновения в клетку, био-синтеза нуклеиновой кислоты и белков, сборки и выхода из клетки (Гольд-фарб Д.М., 1961; Пульчеровская Л.П., 2004). Основные механизмы биологи-ческого взаимодействия микробной клетки и бактериофага были расшифро-ваны в значительной мере благодаря исследованию вирусов бактерий, струк-тур и функций генетического материала, которые изучены в настоящее время достаточно подробно на бактериофагах кишечной группы бактерий.
В 1915 г. F.W. Twort описал остекленение стафилоккоковых колоний и попытался дать объяснение этому явлению. До этого исследователи наблю-дали феномен «исчезновения» бактериальных культур в бульоне, но не опи-сывали или не придавали этому значения. Основная заслуга выделения лити-ческого фактора бактерий, названного бактериофагом, принадлежит F. d Herelle (1917, 1926). Его чрезвычайно интересные исследования и увлека-тельные идеи о возможном значении феномена бактериофагии при инфекци-онных заболеваниях привлекли внимание многих ученых (Гольдфарб Д.М., 1961; Сомова А.Г., 1968; Mukerjee S. et al., 1957, 1961 а, б, в, 1963; Stent S., 1965; Takeya K. et al., 1963, 1967). Термин «бактериофаг» – пожиратель бак-терий – несколько устарел, так как он отражает лишь одно из многочислен-ных его свойств – лизис бактерий. Вместе с тем свойства бактериофагов мно-гообразны и далеко не все фаги характеризуются способностью вызывать ли-зис.
Источниками получения бактериофагов служат лизогенные бактерии различных видов вибрионов, вода (речная, морская, сточная), испражнения, гидробионты, мидии, креветки (Сомова А.Г., 1969, 1971; Остроумова Н.М., 1970; Дрожевкина М.С. с соавт., 1975, 1981; Остроумова Н.М. с соавт., 1972 а, 1983; Кудрякова Т.А. с соавт., 1990; Мороз В.П. с соавт., 1992; Кудрякова Т.А., 1993 а, б; Wong H.C. et al., 1999; Karen E. Cerveny et al., 2002; Robert-Pillot A. et al., 2004).
Метод размножения бактериофагов
Серологическую идентификацию осуществляли двумя методами: каче-ственной реакцией и количественной по методу М. Адамса (1961).
При постановке качественной реакции нейтрализации к 0,9 мл антифа-говой сыворотки в рабочем титре (за титр сыворотки принимали ее наиболь-шее разведение, которое в течение 5 минут нейтрализует не менее 90% гомо-логичного фага) добавляли фаг в концентрации n106 БОЕ/мл. Смесь фаг-сыворотка инкубировали при 37 С 5 минут. Параллельно инкубировали кон-трольную пробу, содержащую 0,1 мл фага и 0,9 мл бульона. Через 5 мин. ин-кубации из опытной и контрольной пробирок брали по 0,1 мл и наносили «дорожкой» на газон, засеянный индикаторной культурой. Через 18 часов инкубации учитывали результаты.
При осуществлении серологической идентификации классическим ме-тодом по Адамсу поступали аналогичным образом, но пробы из опытной и контрольной пробирок вносили в 9,9 мл охлажденной среды для прекраще-ния реакции. Полученные суспензии (разведение 10-3) разводили затем в 10 раз и 1 мл засевали методом агаровых слоев. После 18-часовой инкубации при 37 С подсчитывали количество негативных колоний фага до и после контакта с сывороткой и вычисляли процент нейтрализации.
Для изучения морфологии негативных колоний фагов производили вы-севы фага методом агаровых слоев. Для второго слоя использовали 4,5 мл 0,7 % агара с 0,2 мл 3-часовой индикаторной культуры. Изучение колоний про-изводили после выращивания при 37 С в течение суток. Отмечали форму и величину негативных колоний, характер краев, степень прозрачности, нали-чие вторичного роста и величину зоны неполного лизиса по периферии (Адамс М., 1961).
Строение корпускул фагов патогенных вибрионов изучали по методи-ке, изложенной в «Методических указаниях по применению прямого фаготи-пирования возбудителя холеры Эль-Тор» (1983).
Диапазон литической активности и специфичности фагов изучали пу-тем постановки прямой пробы с фагами (титр 106-1010 БОЕ/мл). Для этого на газон испытуемого штамма, приготовленный двухслойным методом, наноси-ли каплю фага. В тех случаях, когда испытывали чувствительность штамма к нескольким фагам, их наносили штампом-репликатором. Результат учитыва-ли через 18 часов культивирования при 37 С. Оценку степени литической активности фага проводили по четырёхкрестовой системе.
Термоустойчивость фагов определяли методом Friedman и Cowles (1953). Фаги в концентрации n106- n1010 БОЕ/мл в количестве 0,5 мл до-бавляли к 4,5 мл бульона Мартена рН 7,6, выдержанного не менее 10 мин при температуре 60 С, 65 С, 70 С. После 30 минут экспозиции брали пробы и определяли в них содержание фаговых корпускул методом агаровых слоев и сравнивали с контрольной пробой в которой содержался непрогретый фаг.
Хлороформ добавляли к фаголизату в количестве 10 % объема среды. После энергичного встряхивания до молочноподобного вида смесь выдержи-вали при 22-23 С сутки. Затем определяли содержание активных частиц фа-га при помощи двухслойного метода, о результатах судили по сопоставле-нию числа негативных колоний из опытного и контрольного высевов.
Устойчивость фагов к действию концентрированных растворов моче-вины изучали по измененной методике F. Burnet (1933). Бактериофаги в ко-личестве 0,5 мл вносили в 4,5 мл бульона Мартена (рН 7,6), содержащего 15 и 30% мочевины. Смесь выдерживали при 37 С в течение 18-20 часов и тит-ровали методом агаровых слоёв.
Действие цитрата натрия на фаги определяли по модифицированной методике F. Burnet (1933). Для этого в 4,5 бульона, содержащего 0,25; 0,5; 1 и 3% цитрата натрия добавляли 0,5 мл бактериофага. Смесь выдерживали 18-20 часов при 37 С и затем определяли количество фаговых корпускул высе-вом по методу Грациа. Контролем служил бактериофаг в бульоне Мартена без цитрата натрия, содержащийся в тех же условиях.
Для фаготипирования холерных вибрионов использовали 3-часовую бульонную культуру исследуемого штамма, выращенного при 37 С. Штамм засевали двухслойным методом. На подсушенную поверхность второго слоя наносили капли семи типирующих фагов в концентрация 10 ДРТ (Дрожевки-на М.С., Арутюнов Ю.И., 1983).
Для фаготипирования парагемолитических вибрионов ставили пробу с фагами методом агаровых слоёв. Культуру засевали в 4,5 мл бульона Марте-на с 3 % NaCl и подращивали в течение 3-4 часов при 37 С. Затем 0,3 мл её вносили в 4,5 мл 0,7 % агара Мартена с 3 % NaCl (рН 7,8-8,6), расплавленно-го и остуженного до 45 С, перемешивали и выливали на поверхность 1,5% агара в чашке Петри, после застывания верхнего слоя агара на его поверх-ность наносили капли четырёх типирующих фагов. После подсыхания капель фага чашки инкубировали при 37 С в течение 18-20 часов. За положитель-ный результат принимали наличие зоны лизиса или отдельных литических пятен.
Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам, описанным И.П. Ашмариным и А.А. Воробьевым (1962), М.Н. Во-рошиловой с соавторами (1964), П.Ф. Лакиным (1968). Все работы со штаммами V. cholerae проводили в соответствии с «Са-нитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03».
Литическая активность холерных бактериофагов эльтор в отношении холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп
В работе использовали 23 штамма V. cholerae eltor, выделенных от вибриононосителей и больных с разной степенью выраженности диарейного синдрома. Микроорганизмы холерных вибрионов эльтор были типичными по биологическим свойствам, но не содержали гена токсинообразования (ctxAB). По молекулярно-генетическим признакам используемые в работе атоксиген-ные штаммы распределились на три группы (табл. 7). В первую группу во-шли штаммы, у которых не выявлены гены вирулентности ctxAB, zot, ace, tcpA, rstA, rstC. Такие штаммы обнаруживали на многих территориях. Вторая группа отличается от первой наличием гена tcpA. Данные штаммы были вы-делены в Узбекистане. В третью группу вошел штамм из Казахстана, у кото-рого не были выявлены гены ctxAB и tcpA, но присутствовали гены zot, ace, rstA, rstC, toxR, rtxA, rtxC, hap.
В ходе работы использовали диагностические холерные фаги холерные классический (класс) и эльтор, бактериофаги диагностические холерные эль-тор ctx+ и ctx-, фаг ФБ, выделенный из штамма V. cholerae Р-16488 O139 серо-группы (ctx+tcp+), и фаги, выделенные нами из атоксигенных штаммов V. cholerae eltor.
Мы определили фагочувствительность отобранных атоксигенных хо-лерных штаммов к диагностическим холерным фагам класс и эльтор. Как видно из таблицы 7 штаммы всех трех групп были резистентны к фагу класс, а фагом эльтор лизировалось 65% штаммов V. cholerae eltor. К фагу ctx+ были чувствительны 26% культур, а к фагу ctx- – 39%. Остальные 8 штаммов V. cholerae eltor были резистентны к обоим фагам (ctx+, ctx-). Фагом ФБ лизиро-валось 78% штаммов вибрионов эльтор.
В первой группе по фаготипу культуры V. cholerae eltor распредели-лись следующим образом: у 9 штаммов фаготип не определялся, 4 штамма имели 15-ый фаготип, 3 штамма – 16-ый; 2 штамма – 14-ый и по одному штамму 10-ый и 13-ый фаготипы. Три штамма второй и третьей групп не ти-пировались фагами.
Следующим этапом наших исследований было изучение атоксигенных штаммов V. cholerae eltor на наличие лизогении. В результате исследований из 11 штаммов V. cholerae eltor были выделены умеренные фаги (табл. 7 и 8), причём 1 фаг был обнаружен лишь после индукции штамма ультрафиолето-вым облучением. Лизогенные штаммы V. cholerae eltor входили по генетиче-ским признакам в первую и в третью группы и продуцировали фаги I и V морфогрупп. Во второй группе лизогенных штаммов не обнаружено. Штам-мы третьей группы содержали только фаги I морфогруппы. Из 6 штаммов V. cholerae eltor были выделены умеренные фаги I морфогруппы XII серотипа, а из 5 штаммов – умеренные фаги V морфогруппы II серотипа. Все фаги I морфогруппы идентифицировали на индикаторном штамме V. cholerae КМ-152 O139 серогруппы. Фаги V морфогруппы отличались между собой по чувствительности к индикаторным штаммам и не лизировали холерный виб-рион О139 серогруппы.
Фаги V. cholerae eltor V морфогруппы инактивировались при темпера-туре 65 С в течение 30 мин, в то время как фаги I морфогруппы теряли ак-тивность при температуре 75 С. К действию хлороформа фаги V морфо-группы устойчивы, а фаги I морфогруппы инактивируются под его действи-ем, что использовалось нами для их дифференциации. Литическая актив-ность холерных фагов эльтор в отношении холерных вибрионов О1 серо-группы была в пределах 1-27% и не распространялась на 133 штамма бакте-рий, относящихся к семействам Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobaceriaceae. Умеренные холерные фаги эльтор имели латентный период, рав-ный 60-72 минутам. Средний урожай на одну микробную клетку составлял 8,11-10,53 корпускул. Фаги не проявили чувствительности к 3% раствору цитрата натрия, выживаемость сохранялась в пределах 92,4-100% при экспо-зиции 18-20 часов. Пребывание фагов в растворе 30% мочевины приводило к снижению активности фагов V. cholerae eltor, выживаемость сохранялась в пределах 12,8-21,6%.
Изученные нами атоксигенные холерные вибрионы эльтор, различаю-щиеся по генетическим маркерам, имели различную чувствительность к ди-агностическим холерным фагам: эльтор, ctx+, ctx-, ФБ, и лишь штамм 7930 был резистентным ко всем вышеперечисленным фагам. Изолированные на различных территориях и в различные периоды времени атоксигенные хо-лерные штаммы имели разнообразные фаготипы.
Результаты наших опытов показывают, что штаммы V. cholerae eltor относятся к пятому, шестому и седьмому вариантам схемы оценки эпидеми-ческой значимости холерных вибрионов по чувствительности к бактериофа-гам ctx+ и ctx-. Для оценки эпидемической значимости этих штаммов прово-дились дополнительные исследования на наличие генов ctxAB, tcpA и токси-генности на крольчатах-сосунках.
Таким образом, изученные нами атоксигенные холерные вибрионы, имеющие различные генетические маркеры: первая группа – ctxAB-zot-acecpA-rstA-rstCoxR+rtxA+rtxC+hap+, вторая группа – ctxAB-zot-acecpA+rstA-rstCoxR+rtxA+rtxC+hap+, третья группа – ctxAB-zot+ace+tcpA-rstA+rstC+toxR+ rtxA+rtxC+ hap+ различались по чувствительности к диагностическим холер-ным фагам эльтор, ctx+, ctx-, ФБ.
Способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов различных морфогрупп
Основными критериями при первичной характеристике бактериофагов являются морфология корпускул, морфология негативных колоний, сероло-гические свойства, специфичность фагов, устойчивость к воздействию хими-ческих и физических агентов, диапазон литической активности, данные оди-ночного цикла развития фагов (Адамс М., 1961; Быстрый Н.Ф. с соавт., 1979; Остроумова Н.М.. с соавт., 1986 а).
Для разработки схемы идентификации и дифференциации бактериофа-гов патогенных вибрионов из коллекции фагов ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института были отобраны 84 представителя разных видов вибрионов: 16 рас – V. cholerae cholera, 32 – V. cholerae eltor, 8 – V. cholerae O139 серогруппы, 19 – V. parahaemolyticus; в качестве сравнения использова-лись фаги 4 – V. alginolyticus, 3 – V. metschnikovii, 2 – V. mimicus (табл. 3). В работе применяли 7 индикаторных штаммов (табл. 1 и табл. 2). Величина и морфология негативных колоний изученных фагов V. chol-erae cholera, V. cholerae eltor, V. cholerae O139 серогруппы, V. parahaemolyti-cus, V. mimicus не отличались друг от друга, так как имели негативные коло-нии округлой формы, мутные или прозрачные, диаметром 0,3-2 мм. Данные одиночного цикла развития вышеперечисленных фагов так же не давали ка-ких-либо значительных отличий. В отношении исследуемых фагов к дейст-вию мочевины и цитрата натрия различий обнаружено не было, в отличии от действия температуры и хлороформа.
Первичную оценку морфологической принадлежности фагов осущест-вляли по чувствительности к ним специально подобранных штаммов. Ис-пользование этого приёма давало возможность отличить филаментозные фа-ги от фагов с головками и отростком (эти материалы изложены в разделе 6.2). Метод электронной микроскопии позволил выявить существенные различия в структуре корпускул бактериофагов по классификации А.С. Ти-хоненко. Определено у холерных бактериофагов 5 морфогрупп I-V, V. pa-rahaemolyticus – 4 морфогруппы (I, III, IV, V), V. alginolyticus – 3 морфогруп-пы (III, IV, V). Фаги V. cholerae O139 серогруппы имели 2 морфогруппы ви-рионов (I и V); V. mimicus – 1 морфогруппу (I), V. metschnikovii – 1 морфо-группу (IV) (табл.22).
Для изучения антигенных свойств выделенных фагов использовали сы-воротки к холерным фагам I-XII серотипов. Опыты показали, что сыворотки к фагам XII серотипа нейтрализовали исследуемые фаги I морфогруппы, в то же время фаги V морфогруппы относились ко II серотипу. Сыворотки к хо-лерным фагам XII серотипа нейтрализовали фаги V. mimicus. Бактериофаги V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. metschnikovii не имели перекрестных реакций с антисыворотками к фагам V. cholerae и V. mimicus. У фагов V. metschnikovii и V. mimicus определено по одному серотипу, у V. para-haemolyticus – 11, V. alginolyticus – 4.
Другой критерий, применявшийся нами при идентификации отдельных фагов – спектр литического действия. Специфичность фагов в отношении хо-зяина подтверждена на большом наборе представителей близкородственных микроорганизмов семейств Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteria-ceae, которые не лизировали испытуемые фаги.
Диапазон литической активности у фагов эльтор составлял от 57,8% до 76,8% штаммов V. cholerae, у парагемолитических фагов – 0,8-82% штаммов V. parahaemolyticus и 52,5% V alginolyticus. Фаги V. metschnikovii лизировали единичные штаммы своего вида. Репродукция фага V. mimicus обнаружива-лась при использовании штамма V. cholerae eltor КМ-199 (Р-13169) и сопро-вождалась появлением вирулентного мутанта фага с измененным спектром. Кроме того, свойство фага другого вида вибрионов V. metschnikovii лизиро-вать исходный штамм было утрачено после размножения на новом свежевы-деленном штамме V. metschnikovii и приобретена способность его лизиро-вать. На примере фагов двух видов вибрионов нами получены доказательства изменчивости их свойств, связанных с направляющим действием штаммов-хозяев.
6.2 Дифференциация бактериофагов холерных и парагемолити-ческих вибрионов
Выбор таксономических критериев в результате сравнительного анали-за свойств различных по происхождению фагов позволил решить вопрос о возможности их внутривидовой дифференциации (таб. 22). Материалы ис-следования показали, что бактериофаги патогенных вибрионов представляют собой неоднородную по свойствам группу.
Многолетние наблюдения за серологическими свойствами исследован-ных бактериофагов подтвердили стабильность их антигенной структуры – наиболее важного признака при типизации. Установлен факт сходства анти-генного строения у фагов, выделенных из штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп (фаги II серотипа), а также у фагов V. mimicus с холерными фагами XII серотипа. Бактериофаги V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. metschnikovii не имели перекрестных реакций с антисыворотками к фагам V. cholerae и V. mimicus. Холерные фаги представлены 12 серотипами, у фа-гов V. metschnikovii и V. mimicus определено по одному серотипу, у V. pa-rahaemolyticus – 11, V. alginolyticus – 4. Наиболее значительные различия у фагов патогенных вибрионов были подтвержены при определении серологи-ческой специфичности. В разнородной группе фагов на основании ориги-нальных антигенных свойств выделены самостоятельные группы, состоящие и не состоящие в генетическом родстве. Строение холерных фагов II, XI, XII серотипов подтвердило родство фагов внутри каждого из них. К V морфо-группе были отнесены холерные фаги II серотипа, к III – XI серотипа, к I – фаги XII серотипа.
