Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относится бордетеллёзная инфекция, возбудитель которой у животных обычно не идентифицируется (Gueirard, 1995; Mattoo, 2005; Мастиленко, 2011). Без сомнения Bordetella bronchiseptica играет одну из основных ролей в появлении вторичных инфекций, но анализ литературных данных последних лет показал, что у животных она может выступать как возбудитель самостоятельного заболевания (Jacobs et al., 1993; Coutts et al., 1996; Parton, 2005).
Бордетеллёзом болеют собаки, лошади, свиньи, обезьяны, козы, лисы, кролики, кошки, хорьки, хомяки, крысы, морские свинки, птицы и др. (Goodnow, 1980; Yuk et al., 2000).
Данный микроорганизм является инфекционным агентом, индикации и идентификации которого в нашей стране в настоящее время уделяется все большее внимание. За последние годы разработана полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя бордетеллёза (Васильев, Мастиленко, Васильева, 2010), а также бактериологическая схема с применением селективно – диагностической питательной среды УГСХА BBR 57, позволяющая поставить диагноз в течение 96 часов (Васильев, Сверкалова, Васильева, 2010).
В настоящее время установлено, что В. bronchiseptica может вызывать патологию дыхательных путей человека (Woolfrey, 1991; Bauwens, 1992; Gueirard, 1995; Bjornstad, 2005; Mattoo, 2005).
В исследованиях C.R. Helps (2005) было показано, что при исследовании сывороток 126 кошек у 70 % были обнаружены антитела к В. bronchiseptica, а возбудитель был выделен у 5 % из числа исследуемых животных. Эта инфекция чаще всего встречается в многочисленных сообществах кошек домашнего содержания, где в анамнезе животных уже присутствовали респираторные заболевания (Goodnow, 1980; Widney, 2005; Egberink, 2009).
Многие аспекты бордетеллёзной инфекции до сих пор остаются неясными. В значительной степени это обусловлено отсутствием недорогих высокоточных методов диагностики бордетеллёза, что затрудняет получение исчерпывающей эпизоотологической и эпидемиологической информации. В отечественной ветеринарной практике вопрос выделения фагов B. bronchiseptica и их применение с диагностической целью не изучался. Решение этих вопросов представляет научный и практический интерес.
Цель работы – выделить фаги B. bronchiseptica, изучить основные биологические свойства, разработать технологические параметры и создать биопрепарат для индикации и идентификации B. bronchiseptica.
Задачи работы:
-
Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении B. bronchiseptica.
-
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.
-
Подобрать оптимальный набор бактериофагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат для диагностики бордетеллёза.
-
Разработать схему идентификации B. bronchiseptica с помощью бактериофагов.
-
Разработать биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата.
-
Разработать схему ускоренной индикации B. bronchiseptica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
Научная новизна. Впервые выделены штаммы фагов, активные в отношении B. bronchiseptica. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфология негативных колоний, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа, изменение литической активности при хранении.
Впервые для целей идентификации бактерий B. bronchiseptica разработан биопрепарат B.br. – 11 УГСХА на основе отобранных фагов.
Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, патологическом материале, больных животных схема реакции нарастания титра фага для индикации бактерий B. bronchiseptica за 26 часов с использованием биопрепарата бактериофага B.br. – 11 УГСХА. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага B.br. – 11 УГСХА для индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica.
Практическая значимость работы. Выделены и селекционированы бактериофаги, активные в отношении B. bronchiseptica. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе бактериофагов и усовершенствована схема индикации B. bronchiseptica с применением РНФ в течение 26 часов. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Bordetella bronchiseptica B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА», утвержденная ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011г).
Результаты исследований биологических свойств бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА, а также возможность использования бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага подтверждены актами комиссионных испытаний в ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (12 октября 2011 г).
По материалам диссертационной работы разработаны: «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Bordetella bronchiseptica методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.), «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофагов B.br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА» (в соавторстве с Васильевым Д.А., Васильевой Ю.Б.) для студентов старших курсов факультета ветеринарной медицины и биотехнологического факультета ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», а также сотрудников медико-биологических научных учреждений и врачей бактериологов, утвержденные ректором ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» (24 октября 2011 г). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
-
Воздействие на бактерии B. bronchiseptica ультрафиолетовым излучением по разработанной схеме способствует выходу профага.
-
Данные о биологических свойствах фагов B. bronchiseptica позволяют отобрать изоляты для изготовления биопрепарата и использовать его в схеме идентификации возбудителя бордетеллеза за 66 часов.
-
Разработанная схема индикации B. bronchiseptica в объектах ветеринарного надзора при помощи РНФ с использованием диагностического биопрепарата B.br. – 11 УГСХА ускоряет определение данного возбудителя до 26 часов.
-
Разработаны технологические параметры изготовления активного и специфического биопрепарата на основе бордетеллёзных фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА.
Апробация работы:
Материалы диссертации были представлены: Всероссийской научно-практической конференции «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск, 2007); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010).
По теме диссертационной работы в 2011 году получен грант Министерства образования и науки Российской Федерации Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса».
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (№ гос. регистр. 01201161409).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, иллюстрированы 32 таблицами и 14 рисунками. Список использованных литературных источников содержит 109 отечественных и 92 зарубежных автора.
