Введение к работе
Актуальность темы. Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa вызывают заболевание «псевдомоноз» к которому восприимчивы: крупный рогатый скот, свиньи, овцы, птица, пушные звери, пчёлы, рыбы, из лабораторных животных чувствительны белые мыши, морские свинки и кролики (Lipej et al., 1993; Прунтова и др., 1995; Покровский 2002). Диагноз ставят на основании лабораторных исследований на P. aeruginosa. Источник возбудителя, больные животные, выделяющие его с различными выделениями, калом, мочой, молоком, со спермой. Факторы передачи возбудителя – инфицированные корма, пищевое сырьё, вода, почва, окружающая среда (Сидоров, 1995; Красильников, 1999). По существующим данным в окружающей среде P. aeruginosa паразитирует в простейших (Ряпис, 1994; Бухарин, Розенберг, 2007). На особом месте стоит водный ареал распространения P. aeruginosa (Смирнов, Киприанова, 1990; Афонин, 1999).
Отмечена высокая резистентность бактерии к антибиотикам и антимикробным веществам (Nikaido, 1978; Илюхин, 1985). P. aeruginosa вызывает порчу белковых пищевых продуктов (в первую очередь мясомолочных) (Стефанов, 1997). Сообщается, что P. aeruginosa вызывает деструкцию нефтепродуктов и углеродсодержащих веществ (Al-Hadhrami, Lapin-Scott, Ficher, 1995). Несмотря на то, что потребность в диагностике синегнойной инфекции очевидна, существующие бактериологические параметры схем, методов выделения, идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах не совершенны. Трудности диагностики P. aeruginosa связаны с беспигментными штаммами и ассоциативной микрофлорой (Шуляк, 2003). В связи с этим исследования, посвященные методам быстрого и точного обнаружения P. aeruginosa в объектах окружающей среды, пищевом сырье и пищевых продуктах являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.
Цель работы - совершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий вида P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.
Задачи работы:
1. Изучить основные биологические свойства штаммов P. aeruginosa, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.
2.Усовершенствовать среды для выделения и идентификации атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa.
3. Усовершенствовать схему бактериологической идентификации и дифференциации P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и тестов.
4. Выделить из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов специфические бактериофаги бактерий P. aeruginosa и изучить их основные биологические свойства; отобрать наиболее оптимальный специфический бактериофаг для конструирования биопрепарата.
5. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат и технологию его изготовления для индикации и идентификации бактерий вида P. aeruginosa.
6. Усовершенствовать схему индикации бактерий P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4, методом реакции нарастания титра фага.
Научная новизна. Проведены комплексные исследования по выделению и из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов штаммов P. aeruginosa. Получены новые данные о биологических свойствах атипичных и беспигментных штаммах, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструирована новая специфическая среда накопления. Усовершенствована селективная среда с цетримидом для выделения атипичных и беспигментных штаммов P. aeruginosa. Отобран ряд наиболее информативных тестов и разработаны дополнительные тесты, позволяющие проводить видовую дифференциацию бактерий рода Pseudomonas с учётом существующих беспигментных штаммов.
Усовершенствована схема выделения и бактериологической идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.
Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги P. aeruginosa, и отобран наиболее оптимальный специфический бактериофаг УГСХА-Р.а.№4 для создания диагностического биопрепарата.
Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического биопрепарата и усовершенствована схема индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов c применением специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4.
Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема бактериологической идентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать атипичные, беспигментные штаммы P. aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Использование сконструированной нами среды накопления, усовершенствованной селективной среды и подобранных тестов бактериологической идентификации, позволяет выделять и типировать бактерии P. aeruginosa до вида в течение 75 часов. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичного бактериофага и усовершенствована схема индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 19-20 часов.
Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, а также возможность использования диагностического биопрепарата специфичного бактериофага УГСХА-P.a.4 в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 22 января 2010г.
По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 феврвля 2010г) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий P. aeruginosa методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага УГСХА-P.a.№4», а так же «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида P. aeruginosa в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации разработаны для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Среда накопления (УГСХА-Р.а.1) способствует избирательному росту и размножению P. aeruginosa, при первичном посеве исследуемого материала. Плотная селективная среда (УГСХА-Р.а.2) является специфичной и обеспечивает преимущественный рост P. aeruginosa, угнетая рост возможных ассоциантов.
2. Использованные среды УГСХА-Р.а.1 и УГСХА-Р.а.2, а также подобранные тесты в усовершенствованной схеме бактериологической дифференциации дают возможность за 75 ч идентифицировать P. aeruginosa.
3. Отобран штамм специфического бактериофага для целей идентификации и индикации P. aeruginosa в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах.
4. Разработаны биотехнологические параметры по созданию диагностического биопрепарата специфического бактериофага УГСХА-Р.а.№4.
5. Усовершенствованная схема идентификации бактерий вида P.aeruginosa с применением диагностического биопрепарата бактериофага УГСХА-Р.а.№4 ускоряет определение видовой принадлежности P. aeruginosa.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».
Апробация работы:
Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2005; 2008; 2009), Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения и двух глав: обзора литературы; собственных исследований, состоящих из объектов, материалов и методов исследований; результатов исследований и их обсуждения; заключения; выводов; списка использованных литературных источников; приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 33 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 203 наименования, в том числе 111 зарубежных.
