Введение к работе
Актуальность проблемы. Эпидемиологическая обстановка по туляремии и лептоспирозу продолжает оставаться неблагополучной, что обусловлено наличием во многих субъектах Российской Федерации природных очаїхзв данных инфекций (МУ 3.1.1128—02, МУ 3.1.2007-05), а также формированием новых. Сохранение природных очагов туляремии, циркуляция возбудителя среди домашних животных, а также вероятность применения Francisella tularensis при биотеррористических актах предопределяют актуальность исследований, посвященных совершенствованию диагностики данного заболевания. Сохраняющаяся активность очагов лептоспирозов в ряде регионов России, включая Ставропольский край, требует постоянного внимания со стороны санитарно-эпидемиологических служб и лечебно-профилактических учреждений (Ковалев HP. с соавт, 2006). В связи с этим, возникает необходимость применения современных информациошых, диагностических, профилактических, производственных технологий, обеспечивающих профилактику заболеваний (Онищенко ГГ., 2007).
Существуют разнообразные методы индикации возбудителей указанных инфекций (бактериологические, биологические, иммунологические и т.д.), имеющие свои достоинства и недостатки. Перспективным направлением является разработка иммунодиагностических тестов, характеризующихся экспрессно-стыо, простотой технического исполнения и учета результатов в сочетании с высокой специфичностью и чувствительностью (Сырова Н.А., Девдариани 3_П., Голова А.Б., 2007). Среди способов индикации возбудителей инфекционных заболеваний особое место занимают иммуносорбционные, в основе которых лежит принцип аффинности, базирующийся на специфическом связывании антигенов с комплементарными антителами. Новым этапом усовершенствования общепринятых методов диагностики является разработка, освоение производства диагностических препаратов на основе магноиммуносорбешов (Саяпина ЛВ. с соавт., 2007).
Среди лептоспирозной и туляремийной инфекций имеются общие пути заражения людей и источники инфицирования объектов внешней среды. В связи с этим, особое значение приобретает индикация возбудителей лептос-пироза и туляремии в сочетанных очагах. Одним из общих путей передачи инфекции является водный. «Купальные» вспышки возникают в результате нарушений санитарно - гигиенических правил при размещении животноводческих ферм и летних лагерей вблизи различных водоисточников, водопоя из открытых водоемов сельскохозяйственных животных, выделяющих патогены, заражением воды трупами грызунов, инфицированных возбудителями туляремии и лептоспироза. Традиционными методами выявить данных возбудителей сложно, так как их концентрация в водоеме ниже порога чувствительности известных методов диагностики. В связи с этим, необходим постоянный мониторинг за наличием данных патогенов в объектах внешней среды с использованием современных экспрессных методов индикации, обладающих высокой чувствительностью.
Цель работы - совершенствование методов индикации возбудителей туляремии и лептоспироза путем создания иммобилизованных бифункциональных и бивалентных диагностических препаратов, а также моно - и бивалентных магно-иммуносорбентов для селективного концентрирования патогенов при проведении микробиологического мониторинга объектов внешней среды.
Основные задачи исследования: ' ' ' '-;
-
усовершенствовать* индикацию F. tularensis-v('L: interrogans путем постановки экспресс - анализа-с использованием высокоспецифйчных иммуноглобулинов флуоресцирующих; < полученных одновременной хроматографиЧеской очисткой конъюгатаот'несвязавшегося красителя и гетерологичных антител;
-
отработать методику выявления F. tularensis и L. interrogans в реакции суспензионной агглютинации (РСА) с использованием иммуносорбентов на основе кремнезёмно-флуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей туляремии и лептоспироза;
3) - усбвфшёнствовать и стандартизировать диагностическую тест-систему
для выявления возбудителя туляремии в иммунофермеїггном анализе (ИФА) с
использованием иммобилизованных препаратов;
4) офаоотать'методы одномоментного селективного концентрирования воз
будителей туляремии,5, лептоспироза на бивалентных магноиммуносорбентах
(МИС) с последующей постановкой ИФА при микробиологическом мониторинге
возбудителей в объектах внешней среды (всЩа^с низкой концентрацией патогенов.
Научная новизна работы. Впервые для индикации P. tularensis vi L. interrogans научно обоснованы новые способы получени'я^йммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих в результате одномоментной хроматографической их очистки от несвязавшегося флуоресцеинизотиопианата (ФИТЦ) и гетерологичных антител на иммуносорбентах, обладающих экологической чистотой, доступностью, экономичностью и обеспечивающих высокую степень очистки препаратов. Пористая структура матрицы оптимальна для сорбции ФИТЦ и образования иммунохимического комплекса «антиген-антитело», исключает внутри-диффузионное торможение при аффинной хроматографии. Полученные иммунобиологические препараты обладают высокой специфической активностью при снижении материальных и трудовых затрат.
Впервые осуществлена научная разработка и скомпонована тест - система диагностическая на основе кремнезёмнсьфлуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей лептоспироза'и туляремии для выявления F. tulctrensis и L. interrogans в РСА, обладающая высокой чувствительностью, специфичностью и увеличением срока годности. Преимущество применения разработанного препарата заключается в простоте постановки, быстроте получения результатов в РСА, увеличении срока годности до 3 лет (срок наблюдения) за счёт образования иммобилизованной системы, отработанных эффективных параметров получения препарата.
Впервые разработан метод селективного концентрирования возбудителей туляремии, лептоспироза при их низкой концентрации в исследуемых водных объектах, путем применения бивалентных магноиммуносорбентов в качестве
скрининг - теста для микробиологического мониторинга объектов внешней среды. Предлагаемое сочетание МИС с экспресс-анализами позволяет ускорить детекцию возбудителей туляремии и лептоспироза в исследуемых пробах и повысить чувствительность анализов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Определены научные аспекты получения высокоспецифических туляремийных, лептоспирозных антигенов и антител, диагностических препаратов за счет исследования эпидемической значимости штаммов туляремийного и лептоспирозного микробов, выявления перекрестных реакций с гетерологичными штаммами, физико-химических свойств матриц, способов и параметров конъюгации лигандов, фиксации красителей на матрице, разработки моно - и бифункциональных иммобилизованных компонентов, отработки микробиологических тест-систем, проведение лабораторных испытаний и оценки их чувствительности на полевом материале.
Научно-методические разработки сочетанных методов использования им-муносорбционных компонентов в экспресс-анализах дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих увеличению стабильности, чувствительности методов и проведению одновременной эффективной детекции возбудителей туляремии и лептоспироза в объектах внешней среды и биологическом материале.
При получении иммуноглобулинов флуоресцирующих для выявления возбудителей туляремии, лептоспироза разработаны методологические подходы по ковалентной фиксации гетерологичных антигенов на поверхности исследованных матриц, что позволяет получить бифункциональные аффинные сорбенты, применение которых приводит к сокращению материальных и трудовых затрат с сохранением первоначальной активности препарата.
Усовершенствованная РСА с применением полученных иммуносорбентов кремнезёмно-флуоресцентных туляремийных и лептоспирозных позволяет повысить стабильность, экспрессность (РСА длится 1- 3 мин., а РИГА (макрометод) — 24 ч.) и в три раза увеличить срок годности диагностической системы (срок наблюдения) без потери активности. Успешно проведены межлабораторные испытания совместно с сотрудниками лаборатории биологического и технологического контроля (ЛБЖ) Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СтавНИПЧИ) (акт от 09.02.09 г.).
Предлагаемое сочетание разработанных бивалентных МИС с экспресс-анализами позволяет ускорить индикацию возбудителей туляремии и лептоспироза в исследуемых пробах и повысить чувствительность иммуноферментного анализа на 2-3 порядка за счет селективного концентрирования, исключения предварительных этапов очистки проб, увеличить срок годности иммобилизованных иммуноглобулинов в 4 раза (срок наблюдения) по сравнению с традиционным ИФА. Проведены межлабораторные испытания туляремийных МИС совместно с ЛБТК (акт от 24.12.08 г.), утверждена на данный препарат нормативная документация - ТУ 9388-006-01897080-2008.
Материалы научных разработок легли в основу трех методических документов, утвержденных на учрежденческом уровне внедрения: «Лабораторная
диагностика возбудителя лептоспироза» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 11 от 30.11.06 г.); «Индикация и идентификация возбудителя туляремии» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 5 от 07.06.08 г.) и «Критерии контроля качества экспериментальных серий тест-системы диагностической магноимму-носорбентной для выявления возбудителя туляремии иммуноферментным методом» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 5 от 07.06.08 г.). Материалы методических рекомендаций по лабораторной индикации возбудителя лептоспироза вошли в методические документы по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Саратов, 2007).
Утверящена нормативная документация (пусковой регламент, инструкция по применению) на диагностикум суспензионный лептоспирозный иммуноглобули-новый (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 1 от 30.01.07 г.) и технические условия (ТУ), лабораторный регламент, инструкция по применению на тест-систему диагностическую магноиммуносорбентную для выявления возбудителя туляремии в ИФА (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 4 от 16.04.09 г.). Материалы диссертации используются на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям, в лекциях и практических занятиях по экспресс-тздикации и применению иммуносорбентных препаратов в мониторинге возбудителей туляремийной и лептоспирозной инфекций в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
выявление F. tularensis и L. interrogans в реакции иммунофлуорес-ценции (РИФ) эффективно с использованием разработанных высокоспецифичных иммуноглобулинов флуоресцирующих, полученных с применением бифункциональных иммуносорбентных препаратов с иммобилизованными гетерологичными антигенами для одновременной очистки препарата от несвязавшегося ФИТЦ и гетерологичных антител;
-
метод РСА с иммуносорбентом суспензионно-флуоресцентным позволяет выявлять F. tularensis и L. interrogans в концентрации 5*10 - 1x10 м.кУмл при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Стабильность и срок годности препарата увеличены в 3 раза (срок наблюдения) по сравнению с традиционными суспензионными препаратами за счет эффективной иммобилизации лигандов на поверхности матрицы;
3) селективное концентрирование возбудителей туляремии, лептос
пироза на разработанных моно - и бивалентных магноиммуносорбентах
позволяет использовать их в ходе эффективного микробиологического мо
ниторинга объектов внешней среды с целью индикации и изучения цирку
ляции указанных бактерий в очагах инфекций, в том числе и в сочетанных.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены: на Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 14 - 17 марта 2006 г.); IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчиникова (Пушино, 6-7 декабря 2006 г.); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России»
(Ставрополь, 21-22 марта 2007 г.); IX съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26 - 27 апреля 2007 г.); IX Международной научной конференции и II Международной научной онкологической конференции (Пермь. Нидерланды - Германия - Франция, 26 апреля - 2 мая 2007 г.); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах - участниках СНГ» (Саратов, 2007 г.); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009 г.).
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках поисковой НИР «Подбор новых лабораторных методов и препаратов для использования в мониторинге лептоспирозов в Ставропольском крае» (2006-2008 гг.), НИР «Разработка производственной технологии композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и внедрение в практику мапюиммуносор-бентных тест-систем на их основе для иммуноферментного анализа возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза» (№ Госрегистрации 01200952157) и научной школы НШ-2486.2008.7 при поддержке гранта Президента РФ в рамках темы «Создание твердофазных магаитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями бактериальных и вирусных заболеваний», отражено в 21 опубликованной научной работе, в том числе 3 работы - в изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой научной степени.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 163 страницах компьютерного текста, содержит 23 таблицы и 13 рисунков. Список использованной литературы включает 173 отечественных и 62 зарубежных источников.
