Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
-
Эпидемиология и эпизоотология заболеваний, вызываемых бактериями E.coli 0\51 9
-
Резервуар и распространение инфекции 16
-
Патогенез 21
-
Лабораторная идентификация E.coli 0157 25
-
Устойчивость 36
-
Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 37
І.б.І.История открытия и области применения бактериофагов 37
1.6.2.Фагоидентификация бактерий и фаготипирование 40
-
Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина 47
-
Реакция нарастания титра фага (РНФ) 51
11. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 58
2.1. Материалы и методы . 58
2.2. Результаты собственных исследований 60
2.2.1. Сравнительная оценка используемых методов по изучению
специфичности дифференциально-диагностических сред 60
-
Поиск бактериофагов E.coli 0157 и селекция клонов фагов 68
-
Характеристика фагов E.coli 0157 79
2.3. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации
E.coli 0157 с использованием фагов 96
2.4. Разработка оптимальных условий постановки РНФ 99
2.4.1.Определение количественного показателя реакции, имеющего
диагностическое значение 99
2.4.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего
наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями 104
2.4.3. Использование РНФ для обнаружения E.coli 0157 в объектах
внешней среды 109
2.4.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной
Е.соП 0157 с помощью РНФ 110
2.4.3.2 Исследование комбикорма, контаминированного E.coli 0157
с помощью РНФ 113
2.4.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированныеE.coli 0157
с помощью РНФ 116
2.4.4. Использование РНФ для обнаружения E.coli 0157 в пищевых
продуктах 119
2.4.4.1. Исследование мяса, контаминированного E.coli 0157с помощью
РНФ 119
2.5. Обсуждение 123
ВЫВОДЫ 133
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 134
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ
ИСТОЧНИКОВ 135
ПРИЛОЖЕНИЯ 155
Введение к работе
Актуальность работы Escherichia coli являются распространенными возбудителями инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных и человека (Покровский и др., 1989; Cantey, 1993; Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001).
В последнее время в научной литературе появилось большое число сообщений о вспышках гастроэнтеритов у людей, протекающих в тяжелой форме, вызванных E.coli 0157, которые образуют шнгаподобный вероцито-токсин (Riley, Remis, Helgerson, 1983; Orskov, Orskov, Villar, 1987; Cryan, 1990; Bell, Goldoft, Griffin, 1994; Goldwater, Bettelheim, 1994; Whipp, Rasmus-sen, Cray, 1994; Anderson, de Jong, 1996; Armstrong, Hollingsworth, Morris, 1996; Easton, 1996; Ратинер и др., 1998). Заболевание, вызываемое этим серологическим вариантом эшерихии, может вызывать у детей и взрослых диарею, геморрагические колиты, гемолитический уремический синдром и тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (Shinoda et.al, 1997), Вспышки этой инфекции официально зарегистрированы во многих странах Северной и Южной Америки, Австралии, Европы, Азии, Африки и в нашей стране. Эшерихии серогруппы 0157 вызывают у молодняка животных диарею, геморрагический энтероколит и отечную болезнь у поросят (Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001).
Так как основным резервуаром инфекции является крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, реже лошади, олени, птица, то особенно опасны для людей пищевые продукты, полученные от этих животных (Armstrong, Hollingsworth, Morris, 1996; Easton, 1997), а также растительные продукты, выращенные на полях, куда мог вывозиться необеззараженный навоз от животных-носителей этой серогруппы эшерихии (Cieslak et al., 1993; Souichi et al., 1997). He исключается заражение обслуживающего персонала при непо-
5 средственном контакте с животными-колиносителями (Chalmers et al., 1997).
По данным J.Tuttle et al., (1999) в ноябре 1992 года - феврале 1993 года наблюдалась вспышка (более 700 случаев) на Западе США, вызванная Е. coli 0157:Н7, связанная с гамбургерами, приготавливаемыми в ресторанах.
Высокая смертность от этой инфекции, низкая инфицирующая доза и способность возбудителя передаваться несколькими путями (пищевой, водный, контактный) создают серьезную проблему для органов здравоохранения многих стран.
Эффективность профилактических мероприятий во многом зависит от своевременной диагностики болезни у сельскохозяйственных животных, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики вышеуказанной инфекции уделяется большое внимание.
Для микробиологической практики отечественными и зарубежными учеными разработаны питательные среды для выделения указанной серо-группы эшерихий (Ратинер, Бондаренко, 1998). Но метод их выделения и идентификации с использованием предлагаемых сред сравнительно трудоемок, недостаточно чувствителен и требует много времени (4-5 суток).
Современные методы иммунодиагностики (ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов для постановки этих реакций делает их пока недоступными для большинства ветеринарных лабораторий. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простых и доступных для любых лабораторий методов индикации и идентификации названных микроорганизмов.
В лабораторной практике для ускоренной индикации патогенных для животных и человека микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды, а также для их быстрого типирования, предложены индикаторные бактериофаги (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Русалиев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990).
Методы фагодиагностики просты в постановке, специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.
Цель исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации Е.соН 0157 с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ).
Задачи исследования:
1.Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов Е.соН 0157'.
2.Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.
Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикум.
Разработать оптимальную схему выделения и ускоренной идентификации бактерий Е.соН 0157 с использованием выделенных фагов.
Разработать схему ускоренной индикации бактерий Е.соН 0157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
Разработать технологические параметры получения биопрепарата для фагодиагностики.
Научная новизна
Впервые были выделены бактериофаги активные в отношении штаммов Е. соН 015 7.
Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. До- казана эффективность использования селекционированных бактериофагов для индикации и идентификации Е.соН 0157. - Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схема постановки РНФ.
Практическая значимость
Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении патогенных штаммов эшерихий 0157. Два выделенных и изученных штамма депонированы в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностического и лечебно-профилактического препарата. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов E.coli 0157 Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА»,
Для врачей бактериологов написаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) энте-рогеморрагической кишечной палочки E.coli 0157 в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды» и «Методические рекомендации по выделению и фаготипированию энтерогеморраги-ческой кишечной палочки E.coli 0157 из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», одобренны ученым советом и утверждены ректором академии 16.02.04 г.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
Схема выделения бактериофагов E.coli 0157.
Биологические свойства выделенных бактериофагов E.coli 0157.
Сконструирована из отобранных фагов нового биопрепарата — диагностикума.
Разработка схемы выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli 0157 с использованием выделенных фагов.
Разработка схемы ускоренной индикации бактерий E.coli 0157 в
8 объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата. 6. Разработка технологических параметров получения биопрепарата для фагодиагностики E.coli 0157.
Апробация работы
Результаты основных исследований, подтверждены актом комиссионных испытаний в ВГНКИМ (от 30.05.02.) и УГСХА (от 27.01.03.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях УГСХА (2000, 2001, 2002), семинарах Ульяновского областного управления ветеринарии (2001), на международной научно - практической конференции (Воронеж, 2002).
Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринар-но-санитарноЙ экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (229 источников, в том числе 110 отечественных). Работа иллюстрирована 25 таблицами, 8 рисунками, 1 схемой и дополнена приложениями.
