Введение к работе
Актуальность проблемы.
В последние годы резко возросла частота заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями (НТМБ). Главным образом это связано с увеличением количества людей, страдающих иммунодефицитами, в том числе СПИДом, а также с усовершенствованием методов идентификации микобактерий [Falkmham J.O. III, 1996; Bonard D. at al., 2004; Martin-Casabona N. at al., 2004]. Традиционно микобактериозы не относят в группу опасных инфекций, так как считается, что они не передаются от человека к человеку [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Falkmham J.O. Ill, 1996]. Однако эти заболевания могут протекать очень тяжело, нередко приводя к летальному исходу [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Грузевский А.А., 1999].
Заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, у больных без серьезных нарушений иммунной системы, обычно ограничиваются поражением легких, лимфы или кожи [Falkmham J.O. Ill, 1996]. Диссеминированные формы микобактериозов у них встречаются редко. Микобактерий часто поражают легкие у людей, страдающих хроническими заболеваниями - пневмокониозом, силикозом, бронхоэктазами, саркоидозом, коллагенозом и другими заболеваниями [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Marras Т.К. at al., 2002; Ergin A. at al., 2004]. Нетуберкулезные микобактерий могут быть причиной послеоперационных осложнений или травм [Falkmham J.O. Ill, 1996]. Микобактериозы по своей клинической картине и течению очень похожи на заболевания, вызываемые микобактериями туберкулеза [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Ellis S.M. at al., 2002].
Нетуберкулезными микобактериями инфицировано от 25 до 50 % больных СПИДом в США и Европе [Falkmham J.O. Ill, 1996]. Риск развития микобактериозов и бактериемии в отсутствии профилактики у ВИЧ - инфицированных больных составляет 10-20% в год [Holland SM., 2001]. У пациентов со СПИДом обычно развиваются диссеминированные формы микобактериозов, что также является следствием имммунодифицитного состояния [Falkmham J.O. Ill, 1996].
Род Mycobacterium включает около 100 охарактеризованных видов [Primm Т.Р. at al., 2004; Katoch V.M., 2004]. Описано более 20 видов нетуберкулезных микобактерий, способных вызывать заболевания человека [Ellis S.M. at al., 2002].
Различные нозологические формы заболеваний могут быть вызваны одним видом и, наоборот, причиной сходных по клиническим проявлениям заболеваний могут быть разные виды микобактерий [Ellis S.M. at al., 2002]. Следовательно, для лечения микобактериозов требуются разные схемы лечения [Heginbothom M.L, 2001]. Своевременное выявление заболевания и адекватная терапия являются необходимыми условиями успешного выздоровления пациента. Однако, к настоящему времени не существует универсальных методов для быстрой и дешевой идентификации нетуберкулезных микобактерий.
Цель работы.
Идентификация клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих в Центральном и Приволжском федеральных округах России и выбор оптимальной комбинации методов для определения видовой принадлежности.
Задачи исследования.
Охарактеризовать штаммы нетуберкулезных микобактерий с помощью культуральных и биохимических методов.
Провести видовую идентификацию штаммов НТМБ с помощью молекулярно-генетических методов.
Оценить дифференциально-диагностическую способность отдельных методов для идентификации микобактерий.
Определить лекарственную устойчивость клинических и лабораторных штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам.
Создать коллекцию клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованных культур альными, биохимическими и молекулярно-генетическими методами.
Научная новизна работы. Предложены комплексы методов для идентификации нетуберкулезных микобактерий: 1) ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, 2) рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и 3) высокопроизводительная жидкостная хроматография миколовых кислот (high performance liquid chromatography - HPLC). В случаях генетически близкородственных видов, как, например М. kansasii/M. gastri и М. ulcerans/M. marinum, имеющих сходные последовательности генов, но различающихся своими микробиологическими свойствами, рекомендуется
применять сочетание генетических и микробиологических тестов. Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий. Определена лекарственная устойчивость штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам. Впервые проведено изучение клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, полученных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, с помощью как традиционных микробиологических, так и современных молекулярно-генетических методов.
Практическое значение работы. Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам, которую можно использовать в качестве стандартной панели для определения видовой принадлежности клинических штаммов. Проведен анализ ряда основных методов, позволяющих осуществлять идентификацию НТМБ и их внутривидовую дифференциацию. Своевременная идентификация позволяет назначать больным, как туберкулезом, так и микобактериозами адекватную схему лечения или вносить в нее коррективы в течение нескольких суток.
Основные положения, выносимые на защиту.
Проведена сравнительная характеристика методов, используемых для идентификации НТМБ (ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и HPLC) для применения в повседневной практике. Применение культуральных и биохимических тестов и ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК в 99 % случаев позволяет определить видовую принадлежность НТМБ.
Обнаружена внутривидовая вариабельность вида М. fortuitum. При использовании метода рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК выявлено пять геногрупп данного вида микобактерий.
При определении лекарственной устойчивости клинических и лабораторных штаммов НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам - стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину выявлена высокая устойчивость к этим препаратам.
Выявлено, что среди НТМБ, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных
округах России, преобладают виды М. avium, М. intracellulare и М. kansasii. Создана коллекция НТМБ, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам.
Апробация работы. Результаты работы доложены на заседании Ученого Совета ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, 26 января 2007 г. Результаты работы обсуждены на VII Российском съезде фтизиатров (Россия, Москва, 2003 г.) и на VII межгосударственной научно-практической конференции (Россия, Оболенск, 3-5 октября 2006 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 11 работ отечественных и 147 работ зарубежных авторов. Работа содержит 13 рисунков и 14 таблиц.
