Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений Макарова, Марина Витальевна

Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений
<
Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Макарова, Марина Витальевна. Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений : диссертация ... доктора биологических наук : 03.02.03 / Макарова Марина Витальевна; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН].- Москва, 2010.- 237 с.: ил. РГБ ОД, 71 10-3/115

Введение к работе

з

Актуальность проблемы

Нетуберкулезные микобактерии - это микроорганизмы, про которые в начале второй половины XX века хорошо знали микробиологи, а в некоторых странах и клиницисты (вызываемую ими патологию называют микобактерио-зами). Но затем эта проблема была в значительной степени забыта и вновь приобрела актуальность с распространением ВИЧ-инфекции, поскольку у ВИЧ-инфицированных (особенно на стадии СПИД) часто развиваются микобакте-риозы, которые в большом числе случаев приводят к летальному исходу [Ка-toch V., 2004; Khatter S., 2008].

В настоящее время род Mycobacterium включает более 100 видов, и их число продолжает увеличиваться [Euzeby J., 2002; Katoch V., 2004]. Из них наиболее распространены М. tuberculosis и М. leprae, вызывающие у людей хорошо известные заболевания. Несколько видов микобактерии входят в так называемый М. tuberculosis complex: М. tuberculosis, М. bovis, М. afticanum, М. microti, М. canetti, М. caprae, М. pinnipedii. Остальные широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, однако в некоторых случаях они могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии, чаще у людей, имеющих нарушения иммунитета различной природы [Модель Л.М., 1958; Зыков М.П., 1984; Лазовская А.Л., 1991; Оттен Т.Ф., 1994, 1999; Новожилова И.А., 2004; Wolinsky Е., 1979, 1992; Tells С, Putnam J., 1980; Grange J., Yaters M., 1986; Wallace R. et al., 1990, 1997; Olivier K., 1998; Dawson D., 2000; Euzeby J., 2003; Heifets L., 2004; Jarzembowski X, Young M., 2008].

He входящие в M. tuberculosis complex микобактерии долгие годы называли микобактериями окружающей среды (enviromental mycobacteria), возбудителями микобактериозов, атипичными микобактериями. Однако, в последние десятилетия большинство микробиологов использует термин «нетуберкулезные микобактерии» (HTM) [Wallace R. et al., 1990,1997; Dawson D., 2000; Katoch V.,

Значительный вклад в изучение нетуберкулезных микобактерий и вызываемой ими патологии внесли отечественные исследователи, работавшие в 50-70 годы XX века: Л.М. Модель, М.М. Дыхно, Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Я.А. Благодарный, Т.Б.Яблокова, Т.Б. Ильина, Р.О.Драбкина, Ю.К. Вейсфейлер и др. Затем, в течение многих лет исследования в этой области продолжались лишь в некоторых регионах России, в первую очередь, в Санкт-Петербурге [Огтен Т.Ф., Васильев А.В., 2005].

За это время ситуация в мире резко изменилась, число больных мико-бактериозами во многих странах возросло в десятки раз. Это явилось следствием увеличения числа лиц с серьезными нарушениями иммунитета (в первую очередь ВИЧ-инфицированных) [Marras Т., Daley С.,2002; Cole Т. et al.,2005], а также применения новых чувствительных и специфичных методов выделения и идентификации микобактерий (культивирование в автоматизированных системах с использованием жидких питательных сред, молекулярно-генетические методы и высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ), которые позволили существенно ускорить диагностику микобактериозов и повысить ее эффективность [Butler W., Guthertz L., 2001; Fukushima M. et al., 2003; Heifets L., 2004; Shin J. etal., 2009].

Заболевания, вызываемые разными видами HTM, характеризуются сходной с туберкулезом клинико-рентгенологической картиной, но требуют применения схем лечения, отличных от химиотерапии туберкулеза, из-за высокой их резистентности к противотуберкулезным препаратам [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Cole T.et al., 2005]. Перед микобактериологическими лабораториями стоят важные задачи по раннему выявлению и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) и нетуберкулезных микобактерий. Это необходимо для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения инфекции и назначения адекватной терапии.

В зарубежной литературе по данной проблеме в последние годы опубликовано много работ, исследования по изучению НТМ и микобактериозов про-

5 грессируют стремительно [Wallace R. et al., 1990, 1997; Katoch V., 2004; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Young M., 2008].

К сожалению, в нашей стране понимание того, насколько важна эта проблема, еще не достигнуто, в абсолютном большинстве регионов отсутствуют также методические возможности, которые позволили бы реально идентифицировать вид нетуберкулезных микобактерий, установить диагноз микобактерио-за и назначить своевременное лечение.

Кроме того, в России микобактериозы не считаются самостоятельными заболеваниями, несмотря на то, что они включены в Международную классификацию болезней. В связи с такой ситуацией, врачи не знают особенностей течения и лечения этой патологии, нет специальных курсов обучения, не используются современные методы диагностики микобактериозов. Сегодня даже не ясно, в каких учреждениях следует лечить таких больных. Часто пациенты, страдающие микобактериозами, находятся в одних палатах с больными туберкулезом и могут инфицироваться от них, а возможно и заражать их.

Все вышеизложенное определяет актуальность и необходимость разработки комплекса методов выделения и идентификации НТМ с применением всех имеющихся в настоящее время технических возможностей.

Цель исследования

Создание оптимального комплекса выделения и идентификации нетуберкулезных микобактерий (НТМ) с использованием разработанных и модифицированных методов, и на этой основе изучение видового состава выделенных НТМ и их чувствительности к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

1. Изучить эффективность использования наиболее широко применяющихся в мировой практике питательных сред: плотной яичной Левенштейна-Йенсена, плотной агаровой Миддлбрука 7Н11 и модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) для выделения НТМ.

  1. Провести сравнительный анализ результатов применения для видовой идентификации микобактерий методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и микробиологических методов.

  2. Разработать для видовой идентификации НТМ новый молекулярно-генетический метод - биологические микрочипы, сопоставить эффективность его использования с результатами, полученными микробиологическими методами, ПДРФ и ВЭЖХ.

  3. На основании результатов сравнительных исследований эффективности различных методов выделения и идентификации НТМ разработать оптимальный диагностический комплекс (алгоритм), с его помощью охарактеризовать видовой спектр штаммов НТМ, циркулирующих в городе Москве.

  4. Проанализировать частоту повторного обнаружения у больных одного и того же вида НТМ, как критерия (при наличии клинико-рентгенологических признаков заболевания) развития микобактериоза.

  5. Выявить особенности чувствительности к противотуберкулезным и другим антибактериальным препаратам НТМ, выделенных из диагностического материала, поступившего в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных учреждений города Москвы.

Научная новизна исследования

В результате сравнительного изучения эффективности выделения НТМ с помощью модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и плотных - агаровой (Миддлбрука 7Н11) и яичной (Левенштейна-Йенсена) питательных сред, установлено, что наибольшее число микобактерий из клинического материала удается выделить при использовании жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9. При этом срок детекции роста микобактерий в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде. Поскольку на плотных питательных средах дополнительно удается получить до 10% изолятов, оптималь-

7 ным для выделения НТМ является комплексное применение жидкой и одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред.

Выявлено (при субкультивировании на чашках с агаровой средой Мидц-лбрука 7Н11), что клинические изоляты, выделенные как в жидкой, так и на плотных питательных средах, могут содержать несколько видов микобактерий.

Впервые для идентификации видов НТМ разработан и применен метод биологических микрочипов: поэтапно испытаны несколько модификаций биочипов с последовательным увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов. В итоге полученный «БИО-ЧИП MS» позволяет идентифицировать 9 видов НТМ: М. avium, М. intracellu-lare, М. scrojulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, М. fortui-tum, М. chelonae и дифференцировать их отМ tuberculosis complex.

При сравнительном изучении эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью разработанных биочипов, методов ПДРФ и ВЭЖХ на большом объеме клинического материала показано, что все эти методы дают сопоставимые результаты с данными микробиологических исследований (не зависящие от того в жидкой или на плотных питательных средах выделены культуры микобактерий), но в значительно более короткие сроки. Дополнительным преимуществом биочипов является автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.

Впервые разработан и обоснован оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации НТМ, который включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах - плотной и жидкой, и идентификацию полученной культуры микобактерий методами ВЭЖХ и/или ПДРФ, либо биологических микрочипов (использование последнего - предпочтительнее).

Впервые с помощью разработанного алгоритма охарактеризован видовой состав НТМ, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве. С наибольшей частотой среди медленнорастущих

8 HTM из клинического материала выделяли МАС, М. xenopi и М. kansasii а быстрорастущих - М. fortuitum. Клинические изоляты НТМ отличались высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Впервые создана коллекция клинических изолятов (548 штаммов) нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику

Предложено для эффективного выделения НТМ из биологического материала производить его посев на 2 питательные среды: жидкую Миддбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную). Субкультивирование на чашках с агаровой средой Мидд-лбрука 7Н11, выделенных в жидкой и на плотной яичной питательных средах культур, позволяет обнаружить несколько видов микобактерий и изучить их культурально-морфологические свойства.

Высокая степень совпадения результатов идентификации микобактерий методом ВЭЖХ с данными микробиологических исследований, а также возможность идентификации большего числа видов, по сравнению с традиционными микробиологическими методами, определяет целесообразность применения этого метода в бактериологических референс-лабораториях. Важное практическое значение имеет сокращение времени такого исследования до 24-х часов, вместо 3-4-х недель при использовании микробиологических методов.

Результаты видовой идентификации культур НТМ с помощью молекулярно-генетических методов (ПДРФ и биологических микрочипов) аналогичным образом в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований, при существенном сокращении времени их получения. В связи с этим, указанные методы могут быть использованы в лабораторной практике. Преимуществом применения биочипов является простота метода,

9 возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале и автоматизированный учет результатов.

При неоднократном обнаружении в материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ, при отсутствии М. tuberculosis и наличии клинико-рентгенологических проявлений заболевания, лечащим врачам в диагностическом ряду следует рассматривать микобактериоз.

При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать, что НТМ в большинстве случаев устойчивы к основным и резервным противотуберкулезным препаратам и чувствительны к таким фторхинолонам, как ци-профлоксацин и моксифлоксацин.

Создана коллекция, состоящая из 548 клинических изолятов нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ, которая может быть использована в качестве контрольной при разработке и испытании новых диагностических тест-систем.

Результаты настоящей работы внедрены в практическую деятельность Централизованной микробиологической лаборатории Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), обслуживающей Центр и противотуберкулезные диспансеры города Москвы. Они вошли в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиопульмонологии РМАПО Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

На основании результатов проведенных исследований составлены и изданы методические рекомендации:

«Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 07.02.2007;

«Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009;

«Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Использование модифицированной жидкой питательной среды Мидд-лбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) в сочетании с одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред является оптимальным для выделения НТМ из клинического материала.

  2. Разработанный, путем поэтапного анализа различных модификаций с увеличением количества специфических олигонуклеотидов, иммобилизирован-ных в лунках с гелем, метод биологических микрочипов (БИОЧИП «IMS») является достоверным, простым и быстрым методом идентификации микобактерий видов: М. avium, М. intracellulare, М. scrojulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, M.fortuitum, М. chelonae и дифференциации их отМ tuberculosis complex.

  3. Анализ сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью биочипов, оценки ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологических методов, показал, что все они дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические тесты характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.

  4. Разработан алгоритм выделения и идентификации НТМ, применение которого в лабораторной практике позволит улучшить диагностику микобакте-риозов. Он включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах (жидкой и плотной); идентификацию выделенной культуры микобактерий методом ВЭЖХ и/или одним из молекулярно-генетических методов (ПДРФ и БИОЧИП-IMS); субкультивирование на чашках с агаровой ере-

и дой 7Н11 для обнаружения смешанных культур микобактерий и проведения (в случаях необходимости) идентификации вида микробиологическими методами.

  1. При использовании предложенного алгоритма выделения и идентификации НТМ охарактеризован их видовой состав в городе Москве: с наибольшей частотой из медленнорастущих НТМ в клиническом материале обнаружены MAC, М. kansasii и М. xenopi, а из быстрорастущих - М. fortuitum. Неоднократное обнаружение в диагностическом материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ (при отсутствии М. tuberculosis и наличии соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики) дает основание для рассмотрения в диагностическом ряду микобактериоза.

  2. НТМ, выделенные от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве, отличаются высоким уровнем устойчивости как к основным, так и резервным противотуберкулезным препаратам, и в большинстве случаев чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и мок-сифлоксацин.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на научных форумах всероссийского и международного уровней, включая научно-практические конференции и заседания Ученого совета МНПЦБТ, 8-й Российский съезд фтизиатров (Москва, 2007 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию «Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций» (Санкт-Петербург, 2008 г.), 4-й конгресс Евро-Азиатского респираторного общества и 5-й Международный конгресс пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008 г.), 7-ю и 8-ю Московские Ассамблеи «Здоровье Столицы» в 2008 г. и 2009 г., Европейские респираторные конгрессы (Берлин 2008 г., Вена 2009 г.), 5-й конгресс Международного противотуберкулезного союза (Дубровник 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе одна книга, 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

12 Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 225 страницах машинописного текста по традиционному плану и включает введение, обзор литературы, главу «Материал и методы», четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий ссылки на 31 работу отечественных и 342 зарубежных авторов. Результаты исследования проиллюстрированы 27 рисунками, в виде графиков, схем, фотографий и 18 таблицами.

Похожие диссертации на Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений