Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Значение устойчивости к антибиотикам у возбудителей внутрибольничных инфекций семейства Enterobacteriaceae 14
1.2 Распространенность клинически значимых штаммов Enterobacteriaceae, возбудителей нозокомиальных инфекций 18
1.3 Механизмы формирования устойчивости к антибактериальным средствам 21
1.4 Генетические детерминанты устойчивости к бета-лактамам 26
1.4.1 Бета-лактамазы 26
1.4.2 Хромосомные и плазмидные гены бета-лактамаз 28
1.5 Генетические детерминанты ассоциативной устойчивости и их локализация в геноме бактерий 36
1.5.1 Гены, кодирующие устойчивость к аминогликозидам 36
1.5.2 Гены, кодирующие устойчивость к фторхинолонам 38
1.5.3 Гены, кодирующие устойчивость к сульфаниламидам 39
1.6 Роль мобильных генетических элементов в быстром распространении генов устойчивости к антибактериальным препаратам 40
1.6.1 Геномные острова 40
1.6.2 Плазмиды 42
1.6.3 Транспозоны и IS-элементы 43
1.6.4 Интегроны 47
1.6.5 Рекомбинация 50
1.7 Методы изучения устойчивости к антибактериальным препаратам 51
1.7.1 Микробиологические методы 51
1.7.2 Биохимические методы 54
1.7.3 Биофизические методы 55
1.7.4 Генетические методы 56
1.7.5 Молекулярно-генетические методы 59
1.7.6 Методы биоинформатики 69
1.8 Заключение по обзору литературы 73
Собственные исследования 76
Глава 2 Материалы и методы 76
2.1 Микробиологические методы 76
2.1.1 Изоляты бактерий 76 2.1.2 Выращивание микроорганизмов 77
2.1.3 Определение чувствительности к антибиотикам 77
2.1.4 Тест на наличие БЛРС 77
2.2 Молекулярно-генетические методы 78
2.2.1 Специфические праймеры для ПЦР-детекции генов 78 антибиотикоустойчивости 2.2.2 Подготовка матрицы ДНК 78
2.2.3 Амплификация ДНК 78
2.2.4 Электрофорез в агарозном геле 79
2.2.5 Рестрикционный анализ ПЦР-продуктов 79
2.2.6 Определение размеров фрагментов ДНК 80
2.2.7 Секвенирование ДНК 80
2.2.8 Конъюгативный перенос плазмид 80
2.2.9 Выделение плазмидной ДНК 81
2.2.10 Изучение плазмидных профилей изолятов и 81 штаммов 2.2.11 Рестрикционный анализ плазмид 81
2.2.12 Гибридизация ДНК-ДНК 82
2.2.13 Определение групп несовместимости (Inc) плазмид 82
2.3 Биоинформатические методы 82
2.3.1 Анализ последовательностей ДНК с помощью 82 программы Vector NTI9 2.3.2 Выравнивание последовательностей ДНК 82
2.3.3 Размещение последовательностей ДНК в базе данных GenBank 82
Глава 3 Результаты и обсуждение 85
3.1 Сравнение коллекций нозокомиальных изолятов
семейства Enterobacteriaceae, выделенных в РФ в 2003 2004 гг. и в 2005-2007 гг 85
3.1.1 Анализ видового состава и источников выделения нозокомиальных изолятов энтеробактерий 85
3.1.2 Фенотипы устойчивости изолятов к цефалоспоринам III-IV 87
3.1.3 Фенотипы устойчивости изолятов к антибактериальным препаратам других функциональных классов 89
3.2 Детекция генетических детерминант антибиотикоустойчивости 91
3.2.1 ПЦР-скрининг на наличие генов бета-лактамаз 91
3.2.2 Разработка алгоритма идентификации генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М-типа, методом ПЦР-ПДРФ 93
3.2.3 Идентификация генов ЫаСтх-м в нозокомиальных изолятах энтеробактерий 101
3.2.4 Идентификация нового гена 6/астх-м-пб 104 3.2.5 Изучение генетического окружения генов Ыастх-м-- Мб
3.2.6 Анализ генов ассоциативной устойчивости, локализованных в вариабельных участках интегронов 1 класса 113
3.2.7 Обнаружение генов qnr - плазмидных детерминант устойчивости к хинолонам 117
3.2.8 Изучение конъюгативных плазмид, несущих гены антибиотикоустойчивости 119
3.2.9 Локализация генов резистентности и интегронных структур на конъюгативных плазмидах 123
3.2.10 Определение групп несовместимости конъюгативных плазмид 124
3.2.11 Создание перечня специфичных маркеров для характеристики множественно устойчивых госпитальных штаммов энтеробактерий 128
Заключение 129
Выводы 130
Список литературы
- Хромосомные и плазмидные гены бета-лактамаз
- Роль мобильных генетических элементов в быстром распространении генов устойчивости к антибактериальным препаратам
- Специфические праймеры для ПЦР-детекции генов 78 антибиотикоустойчивости 2.2.2 Подготовка матрицы ДНК
- Анализ генов ассоциативной устойчивости, локализованных в вариабельных участках интегронов 1 класса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины является стремительный рост числа возбудителей инфекционных заболеваний, как внутрибольничных, так и внебольничных, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Неудачи клинического лечения, подъем заболеваемости и смертности, увеличение продолжительности пребывания в стационаре зачастую связаны с инфекциями, вызываемыми такими микроорганизмами (Livermore, 2009). Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием широкого клинического применения антибиотиков. В различные периоды времени, в зависимости от перечня антибиотиков разных функциональных групп, интенсивно используемых в лечебных учреждениях, в популяциях бактериальных патогенов развиваются разные механизмы резистентности к антибактериальбным препаратам и способы распространения генов МЛУ (Wright, 2010). Терапия инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, наиболее часто основывается на использовании бета-лактамных антибиотиков, фторхинолонов и аминогликозидов. Общее потребление антибиотиков за последние годы значительно возросло, а расширенное их использование привело к повышению резистентности к данным классам лекарств. Распространение генов устойчивости к антибактериальным средствам среди возбудителей инфекционных болезней человека и, прежде всего, возбудителей госпитальных инфекций, приняло угрожающий характер (Warren et al, 2008; Козлов, 2000).
Горизонтальный перенос генов посредством плазмид, имеющих мозаичную генетическую структуру, формируемую в результате процессов рекомбинации и транспозиции, является причиной наблюдаемого повсеместно быстрого распространения генов устойчивости к разным классам антибиотиков (Hawkey&Jones, 2009). Фенотип МЛУ у бактерий формируется в результате аккумуляции внутри плазмид или транспозонов генов, обеспечивающих устойчивость к отдельным антибиотикам и/или кодирующих эффлюксные насосы, которые могут удалять из клетки несколько видов лекарств одновременно (Nikaido, 2009).
Быстрое определение видовой принадлежности возбудителей инфекций и их чувствительности к антибактериальным препаратам зачастую является вопросом жизни и смерти пациентов. Методы, используемые для этого в рутинной практике, варьируют в зависимости от оснащенности клинических лабораторий и подготовленности персонала - от микробиологических, в разной степени автоматизированных, до молекулярно-биологических. Наиболее перспективными с точки зрения быстроты и точности получаемого ответа являются разные варианты скрининга, основанного на амплификации ДНК с помощью специфичных праймеров, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), в стандартном режиме и в режиме реального времени (Fluit et al, 2001). Преимуществами данного метода являются быстрота, надежность и специфичность; недостатком – то, что выявлению подлежат только уже описанные ранее последовательности ДНК, гены или мутации. Поэтому исследования, направленные на увеличение списка генетических детерминант, доступных тестированию, проводятся постоянно и основываются на изучении генотипов бактерий, циркулирующих в настоящее время в конкретном регионе. При этом большое значение приобретают не только детекция генов резистентности как таковых, но также выявление и характеристика молекулярных механизмов их эволюции и распространения (кассеты МЛУ, мобильные генетические элементы, плазмиды). Такой подход позволяет оценить современную эпидемиологическую ситуацию по распространению антибиотикорезистентности среди популяций бактериальных патогенов, определить молекулярные механизмы природы этой резистентности, прогнозировать ее развитие на будущее и представить клиницистам рекомендации по оптимизации схем лечения определенных типов инфекционных заболеваний (Aminov, 2010).
Цель исследования - выявление и молекулярно-генетическая характеристика маркеров резистентности к антибактериальным препаратам у бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2003-2007 гг.
Задачи исследования:
-
Создание коллекции антибиотикорезистентных госпитальных (нозокомиальных) штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных в разных регионах РФ в 2003-2007 гг.
-
ПЦР-скрининг нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae на наличие генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов. Анализ распространенности генов устойчивости.
-
Разработка алгоритма идентификации генов blaCTX-M, детерминирующих синтез наиболее распространенного типа бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).
-
Изучение генетического окружения генов blaCTX-M и определение мобильных генетических элементов, обеспечивающих эпидемическое распространение данных генов.
-
Детекция конъюгативных плазмид и интегронных структур в госпитальных штаммах семейства Enterobacteriaceae.
-
Создание перечня генетических маркеров антибиотикорезистентности для ПЦР-детекции у возбудителей госпитальных инфекций семейства Enterobacteriaceae.
Научная новизна. Проанализирована коллекция МЛУ бактерий семейства Enterobacteriaceae - возбудителей госпитальных инфекций, выделенных в РФ в течение 2003-2007 гг., на наличие генов устойчивости к антибиотикам разных функциональных классов. Выявлено, что в подавляющем большинстве случаев (75%) устойчивость к этому классу антибиотиков обусловлена продукцией БЛРС СТХ-М типа. Разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ анализа для идентификации генов blaCTX-M, позволяющий определить 49 генов из 96, а остальные 47 - в составе небольших групп. Изучено генетическое окружение генов blaCTX-M подтипов (кластеров) 1, 2 и 9, выявлено и размещено в базе данных GenBank 46 последовательностей, аналогичных ранее описанным и 15 новых вариантов последовательностей. Идентифицирован новый ген blaCTX-M-116 и размещен в базах данных GenBank и Lahey. Показано, что гены blaCTX-M локализованы преимущественно на высокомолекулярных конъюгативных плазмидах (>80 т.п.н.), принадлежащих к различным группам несовместимости, в зависимости от кластера фермента. Показано, что гены, обеспечивающие устойчивость к другим классам антимикробных веществ (аминогликозидам, сульфаниламидам, хлорамфениколу), часто располагаются на тех же плазмидах, что и гены blaCTX-M, внутри вариабельных участков интегронов классов 1 и 2. Размещены в базе данных GenBank 43 последовательности интегронных вставок, в том числе новых – 3.
Практическая значимость. Собрана и охарактеризована коллекция штаммов энтеробактерий – возбудителей нозокомиальных инфекций (n=923). Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (Федеральный уровень внедрения) штаммы (n=141), охарактеризованные по уровням и спектрам устойчивости к антибактериальным средствам разных функциональных классов, в том числе штаммы, депонированные в качестве референсных для детекции генов антибиотикоустойчивости (n=33). Созданы электронные каталоги «Нозокомиальные штаммы энтеробактерий, выделенные в России в 2003-2007 гг.» и «Генетические маркеры для изучения антибиотикоустойчивости у энтеробактерий», доступные для использования в научной библиотеке ФБУН ГНЦ ПМБ. Разработаны методические рекомендации «Идентификация генов blaCTX-M, детерминирующих устойчивость к цефалоспоринам III-IV поколений, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.) и «Молекулярно-генетические методы выявления генов лекарственной устойчивости в популяциях возбудителей бактериальных инфекций» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.). Материалы диссертации используются Пущинским государственным университетом в процессе подготовки магистрантов по специальности 03.02.03 – «микробиология» в курсах «Генетика и молекулярная микробиология микроорганизмов» и «Лекарственная устойчивость микроорганизмов». Размещены в базе данных GenBank 136 последовательностей ДНК генов антибиотикоустойчивости и их генетического окружения, доступные для использования исследователям во всем мире.
Положения, выносимые на защиту:
-
Госпитальные штаммы энтеробактерий, выделенные в различных регионах РФ в 2003-2007 гг., в большом проценте случаев являются носителями генов резистентности к антимикробным препаратам различных функциональных групп одновременно, что определяет их множественную устойчивость.
-
Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам определяется наличием генов бета-лактамаз TEM, SHV, OXA, AmpC и CTX-M типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49 % изолятов) или три (18 % изолятов) гена в разных сочетаниях.
-
Гены blaCTX-M – превалирующие детерминанты устойчивости к бета-лактамам (77 % штаммов) - локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M. Генетическое окружение данных генов включает мобильные генетические элементы ISEcp1, IS26, IS903, orf513 и др., в зависимости от кластера гена и вида микроорганизма.
-
Разработанный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа позволяет идентифицировать описанные к настоящему времени гены blaCTX-M до индивидуального гена (51 %) или в составе небольших подгрупп (49 %).
-
В геноме нозокомиального штамма Proteus mirabilis, выделенного в Москве в 2005 г., идентифицирован ген blaCTX-M-116 (учетный номер в международной базе данных GenBank JF966749; учетный номер в специализированной базе данных Lahey – «CTX-M-116»), кодирующий ранее не описанный фермент CTX-M-типа, имеющий гибридную природу.
-
Интегроны классов 1 и 2 играют важную роль в формирование антибиотикоустойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и др. препаратам у значительной части (38 %) госпитальных штаммов энтеробактерий, выделенных в РФ в 2003-2007 гг.
-
Устойчивости к хинолонам у 23 % штаммов Enterobacter spp. определяется наличием плазмидных генов qnr, сравнительно новым молекулярным механизмом устойчивости к данному классу препаратов.
-
Перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности, включающий в себя детерминанты устойчивости к бета-лактамам (13), к аминогликозидам (7), к сульфаниламидам (5), к хинолонам (3), к другим антибактериальным препаратам (4), может обеспечить информативную генетическую характеристику госпитальных штаммов Enterobacteriaceae, циркулирующих в клиниках РФ.
Работа выполнена в лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках темы НИР «Исследование генетических структур, ответственных за устойчивость к расширенному спектру антибактериальных средств у возбудителей внутрибольничных и пищевых инфекций» (2006-2010 гг.) и международного проекта ISTC#2913/BTEP#61
«Изучение распространенности и молекулярно-генетических механизмов устойчивости грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций к бета-лактамным антибиотикам» (2005-2007).
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Фурсовой Н.К., к.м.н. Абаевым И.В., к.б.н. Кругловым А.Н., н.с. Печерских Э.И., к.б.н. Коробовой О.В., к.б.н. Шишковой Н.А., к.м.н. Анисимовой В.Н., к.б.н. Ковалёвым Ю.Н., к.м.н. Асташкиным Е.И., к.б.н. Пачкуновым Д.М., д.в.н., проф. Светочем Э.А., д.м.н., проф. Сидоренко С.В. и д.м.н., проф. Дятловым И.А.
Апробация работы. Основные материалы по теме диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на 18 российских и международных конференциях: The 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, France, April 1-4, 2006; VII Международный Конгресс МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии. 30 мая – 1 июня 2006 г., Москва; The 2006 NIAID Research Conference, Opatija, Croatia, June 24-30, 2006; The 46th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, USA, September 27-30, 2006; VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ, 3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл., Россия; The 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4, 2007; IX Международный конгресс МАКМАХ/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая – 1 июня 2007 г.; The 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20, 2007; «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28-30 ноября 2007 г.; Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18–19 апреля 2008; The 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19-22, 2008; I Оболенская школа-конференция молодых ученых. 22-23 апреля 2008 г.; X Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21-23 мая 2008; The 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16-19, 2009; The 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21-25, 2009. Международная научная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.; Первая международная научная-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17-19 ноября 2010 г.; XIII Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 18-20 мая 2011.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 22 публикациях, в том числе в трех научных работах, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, выводы и указатель литературы, включающий 145 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 46 рисунками и 20 таблицами.
Хромосомные и плазмидные гены бета-лактамаз
Эра антибиотиков, начавшаяся в 40-е годы прошлого столетия, стала эрой бурной эволюции бактерий в сторону повышения их устойчивости к антибактериальным препаратам, высшим достижением которой стали множественно-устойчивые организмы. Для изучения антибиотикоустойчивости бактерий используются разнообразные методологические подходы, в том числе: 1) генетический — изучение отличий дочерней бактериальной клетки от родительской на уровне генетической информации; 2) биохимический — оценка наличия или отсутствия молекулярных механизмов резистентности; 3) микробиологический - определение минимальных подавляющих концентраций антибиотиков для каждого изучаемого патогена; 4) клинический — оценка успешности антибиотикотерапии. Сравнение данных, полученных с помощью разных подходов, показало, что только генетический подход позволяет выявить основной источник манифестируемой резистентности [34].
Нозокомиальные инфекции (НИ) - это инфекции, приобретаемые пациентам во время нахождения в стационарах, в процессе амбулаторного лечения, после диагностических исследований. НИ - важнейшая проблема здравоохранения во всем мире. Они поражают более 7 миллионов человек в год: 1,7 миллиона - в США и 5 миллионов в Европе. Каждый год от последствий НИ в Европе умирают - 50 000, а в США около 100 000 человек (четвертая по частоте причина летальности в этой стране после сердечно-сосудистых, злокачественных заболеваний и инсультов) [114].
Грамнегативные бактерии на протяжении многих лет являются важными госпитальными патогенами, особенно для тяжелых пациентов стационаров. Выбор адекватной антибиотикотерапии зачастую является критическим фактором для снижения показателей заболеваемости и смертности у пациентов [141]. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам является следствием широкого использования этих лекарств в клинической практике. Механизмы устойчивости, а также межвидовая распространенность генов резистентности изменяются при изменении схем лечения [85]. В настоящее время лекарственная устойчивость микроорганизмов - возбудителей различных заболеваний - не только чисто микробиологическая, но и огромная государственная проблема. Так, среди микроорганизмов-возбудителей острых кишечных инфекций до 80 % выделяемых возбудителей дизентерии устойчивы ко многим используемым антибиотикам [73].
На основании данных, опубликованных в отчете Европейского комитета по наблюдению за антибиотикоустойчивостью [44], эпидемиология резистентности различается в зависимости от типа патогена, вида антибактериального средства и географического региона. Ситуация, связанная с инфекциями, вызванными возбудителями, относящимися к грамотрицательным бактериям семейства Enter obacteriaceae, расценивается как тяжелая во многих регионах. В первую очередь это связано с кишечными палочками и клебсиеллами, проявляющими одновременную устойчивость к двум наиболее часто используемым классам антимикробных препаратов - бе-та-лактамам и фторхинолонам (рис. 1).
Примечательно, что эпидемиологическая ситуация достаточно быстро меняется в сторону ухудшения, т.е. нарастания резистентности. Это объясняется появлением новых, более эффективных для защиты бактериальной клетки, механизмов резистентности, а также широким их распространением среди патогенов. Так, если до 2000 г. большинство резистентных к бета-лактамам энтеробактерий составляли нозокомиальные штаммы Klebsiella spp., продуцирующие мутантные бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) ТЕМ- и SHV-типов, то в настоящее время доминирующим механизмом этого типа устойчивости является наличие ферментов СТХ-М-типа. Данный тип БЛРС стал превалирующим во многих странах, но особенно активно распространился в Европе и Азии. Наиболее опасным является то, что он пролиферировал не только в нозокомиальные штаммы клебсиелл и кишечных палочек, но уже вышел за пределы госпитальных микробных сообществ и выявляется у негоспитализированных больных (например, при «осложненных» инфекциях мочевыводящих путей), зачастую имеющих в анамнезе недавнюю госпитализацию или антибиотикотерапию. Важную роль в распространении резистентности сыграли «успешные» в эпидемиологическом плане штаммы и клоны патогенных бактерий. Так, по всему миру распространился клон кишечной палочки секвенс-типа ST131, серотипа 025:Н4, несущий фермент СТХ-М-15 [79].
Роль мобильных генетических элементов в быстром распространении генов устойчивости к антибактериальным препаратам
Высокоразрешающее плавление или HRM-анализ. Данный метод эффективен для обнаружения мутаций, полиморфизмов и эпигенетических различий в двухцепочечной ДНК. Обычно перед HRM-анализом осуществляют ПНР в реальном времени участка ДНК, в котором предполагается наличие мутации, которую нужно определить. Процесс HRM-анализа сводится просто к аккуратному прогреву ПЦР-продуктов от -50 С до 95 С В ходе этого процесса определяется точка, когда двухцепочечные амгашконы переходят в расплавленное (денатурированное) состояние.
Секрет HRM-анализа состоит в отслеживании данного процесса в реальном времени, что достигается применением флуоресцентного окрашивания интеркалирующими красителями, которые имеют уникальные свойства: связываются специфично с двухцепочечной ДНК и ярко флуоресцируют в связанном состоянии. При плавлении ДНК флуоресценция уменьшается. Анализ кривых плавления позволяет различать «дикий тип», «гетерозиготу» и «гомозиготу» по мутации.
Секвенирование ДНК. Секвенирование последовательностей ДНК объединяет все методы типирования и в настоящее время является золотым стандартом молекулярно-генетических исследований. Практически одновременно были разработаны несколько подходов к секвенированию ДНК: "плюс-минус" метод по Сэнгеру [123], метод "терминаторов" по Сэнгеру [124], метод химической деградации по Максаму и Гилберту [86]. В настоящее время названные трудозатратные методы вытеснены автоматическим се-квенированием ДНК, в основе которого лежит уже упоминавшийся выше метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP. Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченых фрагментов ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ), получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое се-квенирование идеологически отличается от предшествовавшего ему ручного секвенирования только типом используемой метки (флуоресцентной вместо радиоактивной).
Пиросеквенирование. Наиболее распространённые методы секвенирования нуклеиновых кислот основаны на электрофоретическом разделении терминированных фрагментов ДНК в полиакриламидном геле. До недавнего времени этот подход был вне конкуренции, но сейчас у него- появился достойный соперник — пиросеквенирование. Оно основано на определении пи-рофосфата, образующегося при синтезе ДНК. Принцип метода довольно прост и основан на (+/-)-секвенировании, предложенном ещё в 1960-х годах. При последовательном добавлении к ДНК-полимеразному комплексу дезок-синуклеозидтрифосфатов их включение в синтезируемую нить зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Полимеразный синтез ДНК сопровождается выделением пирофосфата. Этот пирофосфат в присутствии сульфурилазы и аденозинфосфосульфата преобразуется в АТФ и запускает окисление люциферина люциферазой, сопровождающееся биолюминесценцией. Люминесценция регистрируется фотоумножителем или цифровой камерой.
Мультиплексное секвенирование ДНК (MultiGEN). Данная технология позволяет одновременно секвенировать множество ампликонов, полученных либо из одного генома, либо из разных геномов. Процесс включает в себя приготовление препарата тотальной нуклеиновой кислоты и амплификацию с помощью специфических праймеров генов-мишеней, которые одновременно секвенируются с 3 конца. Данный метод был использован для изучения трех существенных участков SCC-кассеты в геноме associated gene 5 . aureus: Pb2\ mecRl и тесі, а также региона гена spa с помощью набора реагентов Multi-GEN-MRSA. Неиспользованные терминирующие красители удаляют с помощью раствора Cleanseq. Затем образцы анализируют с помощью капил лярного электрофореза. Вся процедура от выделения ДНК до получения нук-леотидных последовательностей занимает менее 8 ч.
Микрочиповая технология (микроэррей). Данный метод привлек большое внимание исследователей в последние годы, так как он позволяет проводить параллельно множество высокоразрешающих анализов ДНК. По сути, это миниатюризированный тест, проводимый на твердом субстрате, что позволяет проводить множество тестов одновременно, в идентичных условиях и быстро. Биочипы создают на основе четырех типов технологий: гибридизации, ПЦР, олигонуклеотидном лигировании (OLA) и методе MutS. Мик-рочип «считывают» в ридере, состоящем из лазера, проточной ячейки и CCD камеры. Примером микрочипа для изучения антибиотикоустойчивости может служить «TB-BIOCHIP», позволяющий проводить анализ образцов мокроты на присутствие возбудителя туберкулеза и наличие в ДНК данного возбудителя последовательностей, отвечающих за устойчивость к противотуберкулезным препаратам. Микрочип работает на основе гибридизации фрагментов ДНК, выделенной из микобактерий, и зондов, иммобилизованных на биочипе. Данный метод позволяет определять наличие не менее 500 геномо-эквивалентов микобактерий (100-300 КОЕ в 1 мл мокроты), а также наличие/отсутствие резистентности к рифампицину и изониазиду с 95% специфичности.
Luminex хМАР технология. Данный метод основан на сочетании нескольких разных технологий — проточной цитометрии, микросфер, лазеров, обработки цифрового сигнала и традиционной химии — которые объединены уникальным образом. Данная технология включат в себя использование 100 отдельных наборов очень маленьких микросфер, специфически помеченных окрашиванием. Каждая микросфера может быть нагружена специфическим зондом, что позволяет проводить детекцию соответствующих специфичных мишеней. Технология позволяет быстро и точно проводить до 500 аналитов в каждой ячейке. Преимущества технологии Luminex Multiplex: значительное снижение стоимости и трудозатрат на один анализ по сравнению с традиционными методами; требования к образцу минимальны по сравнению с таковыми для мультиплексной реакцией ПЦР; на проведение реакции требуется меньше времени, чем для аналогичных тестов, основанных на твердых носителях; анализ проводится в режиме реального времени; полученные результаты подвергаются тщательной математической обработке.
Применение технологии: тестирование новых лекарств, проверка препаратов на аллергенность, идентификация биомаркеров канцерогенеза, SNP ге-нотипирование, анализ экспрессии генов, изотипирование и типирование тканей, анализ генетических заболеваний, молекулярные механизмы инфекционных болезней и др.
Специфические праймеры для ПЦР-детекции генов 78 антибиотикоустойчивости 2.2.2 Подготовка матрицы ДНК
Для идентификации генов, принадлежащих кластеру 2, гидролизовали ПЦР-продукты следующими рестриктазами: Hinfl, SimI, Ksp632I, Mwol, BsrBI, BsrDI, Hpyl88III, Ddel и Bspl286I (рис. 22). Следуя данному алгоритму, идентифицировали 11 генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М-4, СТХ-М-5, СТХ-М-б, СТХ-М-7, СТХ-М-31, СТХ-М-35, СТХ-М-59, СТХ-М-74, СТХ-М-75, СТХ-М-76 и СТХ-М-92. Остальные гены определяли в составе двух подгрупп: одной, состоящей из двух генов - Ыастх-м-п и Ыастх-м-95, и одной, состоящей из шести генов - Ыастх-м-2, Ь1астх-м-20, Ь1аСтх-м-43, ЬІастх-м-44, & стх-м-5бИ ЬІастх-м-97 в) Идентификация генов кластера 25
Для идентификации генов, принадлежащих кластеру 25, последовательно гидролизовали ПЦР-продукты рестриктазами MspAlI и Sthl32I (рис. 23). Используя данный алгоритм, идентифицировали один ген, кодирующий бета-лактамазу СТХ-М-26. Остальные гены определяли в составе двух подгрупп -одной, состоящей из двух генов - Ь1астх-м-з9 и Ь1астх-м-94, и одной, состоящей из трех генов - ЫаСТХ.м-25, blaCTx-M-s9 и ЫаСтх-м-9\ г) идентификация генов кластера 8
Для идентификации генов, принадлежащих кластеру 8, ПЦР-продукты последовательно гидролизовали рестриктазами Avail и MspAlI (рис. 24). Используя данный алгоритм, идентифицировали все гены данного кластера: bhcYx-M-s, blacTx-M-4o, blaCTX-M-4i и 6/ястх-
Для идентификации генов, принадлежащих кластеру 9, последовательно гидролизовали ПЦР-продукты рестриктазами: Mcrl, Hinfl, EcoRII, HphI, Mwol, MspAlI, Hpyl88I, BstXI, Sfcl и BsaHI (рис.25). Следуя данному алгоритму, идентифицировали 9 генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М-13, СТХ-М-38, СТХ-М-45, СТХ-М-64, СТХ-М-67, СТХ-М-81, СТХ-М-84, СТХ-М-85 и СТХ-М-86. Среди перечисленных генов находится ген Ь/ яСтх-м-б4 имеющий гибридную природу - между кластерами 1 и 9. Остальные гены определяли в составе четырех подгрупп генов: подгруппы, состоящей из двух генов - Ыастх-м-19 и Ыастх-м-9% подгруппы, состоящей из трех генов - ЫаСтх-м-9, ЫаСтх-м-\б и Ь1аСтх-м-5\- подгруппы, состоящей из четырех генов - WOCTX-M-65» «стх-м-87, Ыастх-м-90 и ЫаСтх-м-9&, и подгруппы, состоящей из 13 генов, кодирующих ферменты СТХ-М-14, СТХ-М-17, СТХ-М-18, СТХ-М-21, СТХ-М-24, СТХ-М-27, СТХ-М-46, СТХ-М-47, СТХ-М-48, СТХ-М-49, СТХ-М-50, СТХ-М-55 и СТХ-М-83. К сожалению, большинство генов, входящих в данную подгруппу, невозможно дифференцировать с использованием описанного метода, поскольку различия между ними находятся за пределами анализируемого ПЦР-продукта.
Схема второго этапа алгоритма ПЦР-ПДРФ анализа генов Ыастх-м кластера 9: 9 идентифицируемых генов и четыре подгруппы, включающих два, три, четыре и 13 генов; 45 - размер ПЦР-продукта равен 538 п.н.; 64 - гибридный ген между кластерами 1 и 9 Таким образом, описанный метод ПЦР-ПДРФ-анализа достаточно эффективно позволяет провести быструю идентификацию генов, кодирующих БЛРС СТХ М-типа, эпидемически значимых ферментов цефалоспориназ у возбудителей нозокомиальных инфекций. К настоящему времени гены Ыастх-м обнаружены не только у бактерий семейства Enterobacteriaceae, но и у неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ), таких как Pseudomonas aeruginosa, Acine tobacter baumannii и Stenotrophomonas maltophilia [108], поэтому описанный алгоритм может быть применен также для анализа механизмов устойчивости у данной группы микроорганизмов.
Стоит отметить, что данный алгоритм ПЦР-ПДРФ анализа не лишен недостатков, присущих методу ГШР в целом. Во-первых, ограничением разработанного алгоритма является то, что он может быть применен только к уже известным на данный момент времени генам данного типа. Во-вторых, некоторые гены Ыастх-м не могут быть дифференцированы друг от друга по той причине, что их различия лежат за пределами амплифицируемого ПЦР-продукта, который несколько меньше полноразмерной копии гена, а именно: семь генов в кластере 1; пять генов в кластере 2 и 16 генов - в кластере 9. Однако, поскольку в каждом конкретном географическом регионе только небольшое количество разных генов являются широко распространенными, а другие встречаются крайне редко, успешная и быстрая, идентификация большинства циркулирующих генов представляется вполне разрешимой задачей. В-третьих, невозможно использовать данный подход для исследования некоторых видов клинических патогенов вследствие выраженной гомологии СТХ-М-праймеров и участков ряда видоспецифических генов, таких как kluA и kluC у Kluyvera spp., Ыа мш-\ у Rahnella aqaatilis, sedl у Citrobacter sedlakii и oxy-2 у Klebsiella oxytoca [43].
Таким образом, нами разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов, кодирующих гены бета-лактамаз СТХ-М-типа, который может быть использован специалистами для- быстрой идентификации генов, обусловливающих устойчивость к цефалоспоринам. Этот метод позволяет не только изучать природу лекарственной и проследить закономерности распространения генов резистентности на различных географических территориях и в отдельных стационарах, что чрезвычайно важно для прогноза эпидемиологической ситуации и выбора путей адекватной антимикробной терапии. Учитывая современный уровень оснащенности исследовательских лабораторий, затраты на стоимость материалов, потребность во временных и трудозатратах, представленный алгоритм имеет определенные преимущества при проведении мониторинговых исследований перед методом тотального секвенирования генов 6/ясгх-м во всех выделяемых клинических изолятах, и может быть рекомендован для использования в тех лабораториях, где секвенирование ДІЖ не является рутинным методом.
Описанный выше алгоритм идентификации генов использован нами в ходе молекулярно-эпидемиологического мониторинга генов Ыастх-м в нозокомиальных изолятах, выделенных в. РФ в 2003-2007 гг. Показано, что гены Ыастх-м (п=585) вносят решающий вклад в формирование бактериальных фенотипов устойчивости к цефалоспоринам, они присутствовали в геномах 66 % изолятов энтеробактерий, которые предварительно были отобраны как «подозрительные» на наличие БИРС (проявляли устойчивость хотя бы к одному из цефалос-поринов III-IV поколений и/или давали позитивный ответ в встречались гены кластера 9 (п=37) и кластера 2 (п=5), генов из кластеров 8 и 25 не выявлено. Внутри кластера 1 самым распространенным геном был Ыастх-м-15 (п=515), который наиболее часто встречался в клетках клебсиелл (п=235) и кишечных палочек (п=204); реже встречался ген ЫаСтх-ы-ъ (п=25) - в основном, в клетках энтеробактеров (п=15) и клебсиелл (п=7); идентифицированы также три уникальных гена - Ыастх-и-и в Е. liquefaciens, Ьіастх-м-із в P. mirabilis (рис. 8Б) и 6/дСтх-м-34 в Р- stuartii. Внутри кластера 2 выявлены гены Ыастх-м-2 (п=1) в Е. coli, Ыастх-м-5 в Enterobacter cloacae (п=1) и S. enterica (n=3). Среди генов кластера 9 наиболее представленным был ген Ыастх-м-и (п=35), преимущественно в Е. coli (п=29); также выявлен ген ЫаСтх-м-9 (п=2) в Е. coli. Стоит отметить, что в некоторых изолятах присутствовали одновременно два разных гена ЫаСтх-м - (ЬІаСтх-м-и+ЬІаСтх-м-і5) - в четырех изолятах Е. coli и одном изоляте Klebsiella spp. (рис. 27, 28)
Анализ генов ассоциативной устойчивости, локализованных в вариабельных участках интегронов 1 класса
Определение Inc групп конъюгативных плазмид выявило, что эти группы различаются для штаммов Е. coli и К. pneumoniae, и что штаммы Е. coli демонстрируют большее разнообразие их. В донорных штаммах присутствуют плазмиды различных (от одной до пяти) Inc групп. При конъюгации реципиенту передавались плазмиды от одной до четырех различных Inc групп. По-видимому, некоторые из конъюгативных плазмид способствовали переносу дополнительных низкокопийных плазмид, либо сами имели гибридную природу.
Представленность конъюгативных плазмид различных Inc групп различалась для штаммов, несущих гены бета-лактамаз различных подтипов СТХ-М, у штаммов Е. coli выявлено большее разнообразие, чем у штаммов К. pneumoniae. Показано, что гены бета-лактамаз подтипа СТХ-М-1 локализуются на плазмидах, принадлежащих к группам несовместимости IncF (64% у Е. coli и 14% у К. pneumoniae); IncL/M (14% и 50% соответственно); Inc А/С (25% и 14% соответственно); IncN (18% у Е. coli) и Incll (4% у Е. coli и 5% у К. pneumoniae). При этом значительную часть конъюгативных плазмид у К. pneumoniae (27%) не удалось типировать данным методом. Гены бета-лактамаз подтипа СТХ-М-9 располагались на плазмидах групп несовместимости IncF (69% у Е. coli); ІпсА/С (31% у Е. coli); IncN (100% у К. pneumoniae); Incll (50% у Е. coli); IncK, IncB/O, IncFIA и IncFIB - по 6% у штаммов Е. coli. На описанных конъюгативных плазмидах локализованы также гены, кодирующие бета-лактамазы ТЕМ-типа (13 % изолятов), что подтверждено с помощью конъюгации и трансформации.
Конъюгативные плазмиды, присутствующие в клинических изолятах Е. coli, преимущественно принадлежали к группам несовместимости IncF, Inc А/С и Incll-ly; в то время как в клинических изолятах Klebsiella spp. - к группам несовместимости ІпсА/С и IncL/M, а в клинических изолятах Епerobacter spp. - к группам несовместимости IncFIB, IncFIA, ІпсА/С и IncL/M (рис. 45).
Многие конъюгативные плазмиды (38 %) имели гибридную природу, т.е. показывали принадлежность к двум-четырем разным группам несовместимости. Кроме того, 23 конъюгативные плазмиды (20 %) не удалось типи-ровать с помощью использованного набора праймеров. Результаты типиро-вания плазмид по группам несовместимости коррелируют с результатами ре-стрикционного типирования, представленными в разделе 3.2.7. Так, в группу А вошли плазмиды, относящиеся к группе несовместимости IncF, а также гибридные плазмиды Inc(F+FIB+A/C), Inc(F+FIB+FIA) Inc(F+L/M) и др. (табл. 2). Выявленное разнообразие плазмид указывает на высокий уровень рекомбинационных процессов в популяциях российских нозокомиальных штаммов.
Показано, что группы несовместимости плазмид достаточно специфичны для разных аллотипов гена Ыастх-м- ген 6/ Ястх-м-15 чаще ассоциирован с плазмидами групп несовместимости IncF, IncL/M и ІпсА/С; ген 6/ястх-м-з - с плазмидами IncL/M; а ген Ыастх-м-\4 - с плазмидами IncF, IncL/M и Incll-ly. (рис. 46, табл. 20).
Таким образом, полученные нами данные показывают, что гены резистентности к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов в нозокомиальных штаммах энтеробактерий локализованы на конъюгативных плазмидах, что обеспечивает их горизонтальное распространение между бактериями. Нами подтверждается отмеченная ранее другими авторами важная роль конъюгативных плазмид в распространении генов лекарственной устойчивости.
Представители семейства Enterobacteriaceae играют важнейшую роль в этиологии госпитальных инфекций - они составляют около 20 % среди общего количества возбудителей. В данном исследовании проведено сравнительное изучение изолятов, выделенных в 2003-2004 гг. из крупных городов РФ, и в 2005-2007 гг. - из клиник ММА им. И.М. Сеченова. Показано, что штаммы обеих коллекций устойчивы к бета-лактамам, аминогликозидам, фторхинолонам и сульфаниламидам. Большая часть коллекции (89 %) представлена штаммами, одновременно устойчивыми к трем и более классам антибактериальных препаратов. Показано, что геномы штаммов, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам, содержат от одного до трех генов различных бета-лактамаз. Наиболее распространенным геном является ген ЫаСтх-м-\5, принадлежащий к кластеру 6/ яСтх-м-і- Генетическое окружение генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М типа, включает в себя мобильные генетические элементы, набор которых характерен для индивидуальных генов и вида микроорганизма. Показана значительная вариабельность данных последовательностей, что указывает на бурные эволюционные процессы, проходящие в данных участках генома. Подтверждением данного тезиса явилось открытие нового гена Ыастх-м-ив, который представляет собой гибрид между генами 6/астх-м-2з и Ыастх-м-22, и содержит в середине последовательности core-сайт, в области которого, предположительно, произошла рекомбинация. Показано, что гены Ыастх-м локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах, имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M, и др., специфичным для вида микроорганизма и кластера гена. В ходе работы разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов Ыастх-м, позволяющий идентифицировать около половины генов до индивидуального гена, а остальные - в составе небольших подгрупп.
Установлено, что устойчивость штаммов к антибиотикам других функциональных классов (не бета-лактамам) в большой степени определяется наличием интегронов классов 1 и 2, которые присутствуют в геномах 38 % изученных штаммов. Интегроны несут генные кассеты устойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и стрептотрицину. Кроме того, в геномах 23 % энтеробактеров обнаружены детерминанты нового механизма устойчивости к хинолонам - плазмидно-кодируемых генов qnr.
На основании проведенных исследований создан перечень генетических маркеров для ГЩР-детекции генов резистентности в штаммах энтеробактерий, включающий 48 позиций: 13 - к бета-лактамам, 7 - к аминогликозидам, 3 - к хинолонам, 5 - к сульфаниламидам, 4 - к другим антибактериальным препаратам.
