Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы -12-
1.1 Резидентная микрофлора и ее роль в сохранении колонизационной резистентности -12-
1.2 Механизмы колонизационной резистентности вагинального биотопа -16-
1.3 Дисбиотические нарушения микрофлоры влагалища -20-
1.4 Традиционные принципы коррекции дисбиозов
влагалища у беременных -28-
1.5 Споровые и кисломолочные пробиотики в коррекции дис- -29-
биозов влагалища
Глава 2. Материалы и методы исследования -37-
2.1 Материалы -37-
2.2 Методы обследования беременных -43-
2.2.1 Аминный тест -43-
2.2.2 рН-метрия влагалищного отделяемого -43-
2.2.3 Микроскопическое исследование вагинальных мазков -43-
2.2.4 Микробиологическое исследование вагинального биотопа беременных -44-
2.3 Определение уровня адгезивной активности штаммов пробиотиков и штаммов УПМ на различных моделях -45-
2.4 Определение антагонистической активности пробиотиков по отношению к клиническим штаммам УПМ -48-
2.5 Схемы лечения беременных с дисбиозами влагалища -49-
2.6 Критерии оценки эффективности лечения беременных -50-
2.7 Методы статистической обработки результатов -51
Глава 3. Собственные исследования -52-
3.1 Выбор наполнителя для новой лекарственной формы пробиотика «Биоспорин суппозитории» -52
3.2 Клинико-диагностическое обследование беременных -58-
3.2.1 Гинекологическое обследование беременных -59-
3.2.2 рН-метрия влагалищного отделяемого -60-
3.2.3 Аминный тест -61-
3.2.4 Микроскопическое исследование вагинальных мазков -62-
3.3 Микробиологическое исследование влагалищного отделяемого беременных -65-
3.4 Изучение специфической активности различных лекарственных форм пробиотиков -71-
3.4.1 Адгезивная активность пробиотиков различных лекарст венных форм на модели формалинизированных эритроцитов человека -72-
3.4.2 Адгезивная активность пробиотиков различных лекарственных форм на модели эпителиоцитов влагалища -75-
3.4.3 Адгезивная активность УПМ влагалища на модели формалинизированных эритроцитов человека
3.4.4 Антагонистическая активность пробиотиков различных лекарственных форм по отношению к УПМ влагалища
3.4.5 Антагонистическая активность пробиотиков по отношению к уропатогенным E.coli
3.5 Обоснование включения пробиотиков различных лекарственных форм в клинические схемы коррекции нарушений влагалищного микробиоценоза
3.6 Клинико-диагностическое обследование беременных после окончания лечения
3.6.1 Гинекологическое обследование беременных после окончания лечения
3.6.2 Аминный тест
3.6.3 рН-метрия влагалищного отделяемого
3.6.4 Микроскопическое исследование вагинальных мазков
3.7 Микробиологическое исследование влагалищного отделяемого
3.8 Характеристика инфекционно-воспалительных осложнений родов и послеродового периода у беременных с различными формами дисбиозов влагалища после лечения
Заключение
Выводы
Список литературы
- Резидентная микрофлора и ее роль в сохранении колонизационной резистентности
- Методы обследования беременных
- Выбор наполнителя для новой лекарственной формы пробиотика «Биоспорин суппозитории»
- Изучение специфической активности различных лекарственных форм пробиотиков
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема послеродовых инфекционных осложнений, вызванных условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), имеет огромное значение в акушерско-гинекологическои практике настоящего времени (1,2,133).
Данные литературы свидетельствуют о том, что различные инфекционные осложнения могут возникать как в послеродовом периоде, так и во время беременности, и также развиваться у новорожденных, а после различных внутриматочных манипуляций и операций создается реальная угроза возникновения острых воспалительных заболеваний матки и придатков (42,45, 337).
Во время беременности на фоне гормональной перестройки организма происходит качественное и количественное изменение микрофлоры влагалища: увеличивается число УПМ, индуцируется рост грибов рода Candida (14).
Вследствие снижения защитных функций влагалищного биотопа создаются условия для восходящей инфекции половых путей женщины и инфицирования плода, при нарушении иммунобиологических барьеров происходит транслокация УПМ в кровеносное русло, бактериемия с инфицированием внутренних органов (13,19).
Одним из основных этиологических факторов возникновения подобных осложнений являются дисбиозы влагалища. Во время беременности дис-биозы влагалища могут вызвать задержку внутриутробного развития в связи с нарушением маточно-плацентарного кровообращения, возникновение хо-риоамнионита, привести к несвоевременному излитию околоплодных вод, преждевременным родам. В послеродовом периоде опасность развития инфекционных заболеваний у родильниц и новорожденных возрастает во много раз. Дисбиозы влагалища являются значительным фактором риска развития послеродовых гнойно-воспалительных осложнений. Так, частота послеродового эндометрита у родильниц с дисбиозами влагалища увеличивается в 2,2-5,8 раза (16,122,135).
В настоящее время в акушерстве и гинекологии для коррекции дис-биотических состояний влагалища используются различные схемы лечения, направленные на восстановление нормальной микрофлоры (7,128,163). Применяются антибактериальные препараты имидазольного ряда (ПИР) и мо-лочно-кислые пробиотики (бифидумбактерин, лактобактерин, ацилакт). Однако назначение ПИР не устраняет саму причину заболевания, и в результате рецидивы дисбиозов влагалища встречаются довольно часто (10-15%). Также недостатком этих схем является большое количество побочных явлений или осложнений при применении ПИР, ограничение возможности их использования в первом триместре беременности. Пробиотики применяются местно в виде аппликаций, при этом их действие часто оказывается неэффективным, т.к. изменения качественного и количественного состава микрофлоры влагалища являются следствием снижения колонизационной резистентности микробиоценоза организма человека в целом. Также исследования показали, что бактерии, входящие в данные пробиотики, вырабатывают молочную кислоту, которая индуцирует рост грибов рода Candida. Увеличение количественного содержания грибов рода Candida в микробиоценозе влагалища по данным исследований может приводить к серьезным, в том числе диссеминирован-ным, поражениям плода и новорожденного, вплоть до кандидозного сепсиса. В связи с тем, что при беременности увеличивается частота выделения грибов рода Candida, эти препараты неэффективны или оказывают отрицательное действие (51,111).
В последние годы в медицинской практике применяется споровый пробиотик биоспорин. Препарат используется для коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах, в гинекологической практике при лечении бактериального вагиноза и вульвовагинального кандидоза, в хирургии для профилактики развития гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде. Препарат не токсичен, не обладает тератогенными свойствами, разрешен к применению у беременных (87).
Биоспорин выпускается в форме лиофилизата и таблеток, применяется
per os и вагинально в виде аппликаций. В настоящее время Екатеринбургским Центром военно-промышленных проблем разрабатывается новая лекарственная форма биоспорина - вагинальные суппозитории. Однако эффективность лечебного действия этой лекарственной формы при различных нарушениях микроэкологии влагалища у беременных не выяснена, также не отработаны схемы применения вагинальных суппозиториев биоспорина в акушерстве и гинекологии.
В связи с этим, все вышеизложенное обусловило актуальность исследования, целью которого явилось экспериментальное обоснование применения пробиотиков в различных лекарственных формах (лиофилизат, суппозитории) для коррекции дисбиозов влагалища.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Экспериментальное обоснование применения пробиотиков в различных лекарственных формах (лиофилизат, таблетки, суппозитории) для коррекции дисбиозов влагалища.
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Изучить микробиоценоз влагалища беременных.
Выбрать оптимальный наполнитель для новой лекарственной формы «Биоспорин суппозитории».
3. Провести сравнительное изучение основных показателей качества (адге
зивная, антагонистическая активность) пробиотиков различных лекарст
венных форм.
4. Разработать схемы коррекции дисбиозов влагалища у беременных.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
Обоснован способ оценки специфической активности препаратов пробиотиков различных лекарственных форм по уровню их адгезивной активности.
Подана заявка на патент РФ № 108-419 от 27 марта 2003 года: "Способ оценки специфической активности препаратов пробиотиков различных лекарственных форм и производственных штаммов по уровню их адгезивной
активности" (МПК7: А61К 35/74).
Подобран оптимальный вариант наполнителя (гидрированный жир с эмульгатором Т-2) для новой лекарственной формы «Биоспорин суппозитории».
Обоснованы оптимальные схемы коррекции дисбиозов влагалища «ими-дазольный препарат+биоспорин» и «биоспорин+бифидумбактерин» с использованием пробиотиков биоспорина и бифидумбактерина в двух лекарственных формах (лиофилизат, суппозитории).
Изучены основные показатели качества (адгезивная, антагонистическая активность) пробиотиков различных лекарственных форм (лиофилизат, суппозитории). Сравнительное изучение специфической активности споровых пробиотиков и пробиотиков нормофлоры показало, что различные формы пробиотиков не различаются по антагонистическим свойствам, тогда как уровень адгезивной активности препаратов в свечевых формах снижается вследствие экранирования рецепторов эритроцитов (эпителиоцитов) и адге-зинов микробных клеток.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:
Наполнитель гидрированный жир с эмульгатором Т-2, обеспечивающий стабильность препарата на протяжении всего срока годности, включен в регламент производства новой лекарственной формы «Биоспорин суппозитории».
Разработанные схемы коррекции бактериального вагиноза, вульвовоги-нального кандидоза и неспецифического вагинита у беременных, включающие применение различных лекарственных форм пробиотиков биоспорина и бифидумбактерина, включены в методические рекомендации кафедры акушерства и гинекологии РМАПО.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. У беременных женщин, находящихся на стационарном лечении в отделении патологии беременности, в 91,4 % случаев выявлены различные нарушения микрофлоры влагалища (бактериальный вагиноз, вульвоваги-
нальный кандидоз и неспецифический вагинит).
Разработанные схемы лечения бактериального вагиноза, вульвовагиналь-ного кандидоза и неспецифического вагинита у беременных, включающие применение различных лекарственных форм пробиотиков обеспечивают коррекцию дисбиозов влагалища и приводят к стойкому снижению гнойно-воспалительных осложнений в послеродовом периоде.
Оптимальный вариант наполнителя (гидрированный жир и эмульгатор Т-2), обеспечивает сохранение основных показателей качества (антагонистическая активность, адгезивные свойства, количество живых бактерий в дозе препарата) новой лекарственной формы «Биоспорин суппозитории» на протяжении 15 месяцев.
4. Способ оценки специфической активности пробиотиков и производст
венных штаммов по уровню их адгезивной активности, позволяет оце
нить эффективность и качество препаратов пробиотиков в разных лекар
ственных формах.
5. При сравнении адгезивной активности споровых пробиотиков и пробио
тиков нормофлоры в лразличных лекарственных форм (лиофилизат, суп
позитории) выявлено снижение адгезивной активности у пробиотиков в
свечевой форме, при неизменяющемся уровне антагонистических
свойств.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научно-практической конференции НПО "Биомедицинские технологии" (Москва, 2003), на международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), на заседаниях кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2000, 2001, 2002, 2003). Работа апробирована на заседании кафедры медицинской микробиологии 16 марта 2004 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Золотарева О.В., Саркисов С.Э. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике. // "Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования" Тезисы международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой. М., 2002 г., С. 24.
Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Золотарева О.В., Саркисов С.Э. Изучение адгезивной активности пробиотиков различных лекарственных форм, применяемых в гинекологической практике. // СБ.тр. Биомедицинские технологии. Вып. 18. М. -2002. -С. 15-18.
Осипова И.Г., Созаева Л.Г., Евлашкина В.Ф., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Чумаева Т.В., Лукьянова О.Ю. Адгезивная активность пробиотиков, применяемых в гинекологической практике. // СБ.тр. Биомедицинские технологии. Вып. 16. М. -2001. -С. 19-23.
Колганова Т.В., Джарадат Т., Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Лукьянова О.Ю., Буданова Е.В., Золотарева О.В., Кульчицкая М.А. К вопросу о воздействии лазерного излучения и пробиотиков на штаммы E.coli, выделенные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы. // "Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования" Тезисы международной научно-практич. конференции памяти Г.И.Гончаровой. М., 2002 г., С. 25.
Горбунов С.Г., Осипова И.Г., Созаева Л.Г., Васильева Е.А., Чумаева Т.В. Биоспорин - новый пробиотик для профилактики послеоперационных гнойно-септических осложнений в гинекологической практике. В кн. «Инфекционные болезни. Диагностика, лечение, профилактика». Труды VI Росс- итальян. научной конференции. С-Пб., 2000, С. 14-16.
Чумаева Т.В., Осипова И.Г., Васильева Е.А., Колганова Т.В., Золотарева О.В., Евлашкина В.Ф. Сопоставление эффективности различных лекарственных форм пробиотиков, используемых в акушерско-
11 гинекологической практике, по степени антагонистической и адгезивной активности// "Биопрепараты" №1(9), март, 2003; С. 17-20.
7. Осипова И.Г., Колганова Т.В., Васильева Е.А., Чумаева Т.В., Евлаш-
кина В.Ф. К вопросу о комплексном воздействии импульсного инфракрас
ного лазерного излучения и пробиотиков на штаммы Escherichia coli, вы
деленные от людей с заболеваниями мочевыделительной системы// Акту
альные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XX веке: Материалы
Всероссийской конференции. - Пермь, 2003. - С.293-297
8. Подана заявка на патент РФ № 108-419 от 27 марта 2003 года: «Спо
соб оценки специфической активности препаратов пробиотиков различ
ных лекарственных форм и производственных штаммов по уровню их ад
гезивной активности» (МПК7: А61К 35/74).
Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 142 стр. текста компьютерной верстки и иллюстрирована 27 таблицами, и 11 рисунками. Список литературы представлен 231 источником (131 отечественным и 100 зарубежным).
Резидентная микрофлора и ее роль в сохранении колонизационной резистентности
Организм человека и населяющая его микрофлора является составными частями единой экологической системы, находящейся в динамическом равновесии, на которое оказывают влияние экзогенные факторы внешней среды.
Микрофлора оказывает как положительное, так и отрицательное влияние на жизнедеятельность и состояние организма человека. К положительным функциям микрофлоры следует отнести: 1) колонизационную резистентность, основным механизмом которой является активация иммунной системы; 2) синтез необходимых организму биологически активных веществ (витамины, гормоны, антибиотики); 3) детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов; 4) участие бактерий в обмене белков, углеводов, жиров, нуклеиновых кислот (22;31;63;66).
К отрицательной деятельности нормофлоры следует отнести ее способность при определенных условиях вызывать гнойно-воспалительные заболевания; вызывать сенсибилизацию организма продуктами жизнедеятельности; проявлять мутагенную активность (3;5). Так, представители рода Lactobacillus могут обусловить развитие кариеса, эндокардита, септицемии, пневмонии, менингита и других серьезных патологических процессов (125).
До рождения во внутриутробном периоде плод стерилен. Заселение микроорганизмами кожи, полостей и слизистых начинается при прохождении по родовым путям. Таким образом, первым донором микробной флоры для ребенка является его мать, но, очевидно, что контакт с матерью не является единственным источником колонизации новорожденных (20; 127).
Считается, что микрофлора матери родственна в антигенном отношении организму ребенка и поэтому обладает максимальной способностью приживления (58;64). Грудное молоко играет важную роль в становлении нормальной колонизации ребенка. Она осуществляется за счет неспецифических (лактофер-рин, лизоцим, макрофаги), специфических (В-лимфоциты) и гуморальных факторов (иммуноглобулин А). Еще одним фактором, способствующим расселению и приживлению нормальной микробной флоры ребенка на начальном периоде ее становления, является совместное пребывание матери и ребенка в палате родильного дома (27).
Микрофлора матери имеет больше шансов к приживлению и определяет высокую колонизационную резистентность формирующихся биотопов ребенка. Этот термин впервые ввел в научную литературу D. van der Waaij в 1971 году. Под колонизационной резистентностью подразумевается совокупность механизмов, придающих индивидуальную анатомическую стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения хозяина посторонними микроорганизмами или распространение нормальной микрофлоры на поверхности кожи и слизистых вне их естественных мест обитания (17;18;255).
Механизмы колонизационной резистентности нормофлоры можно разделить на прямые и непрямые. К первым следует отнести продукцию бактериями ингибиторов, нарушение метаболизма патогенных и условно патогенных бактерий; конкурентные взаимоотношения с патогенными бактериями за питательные субстраты, за места адгезии. К непрямым эффектам относятся активация иммунной системы, стимуляция ретикулоэндотелиальной системы и мононуклеаров, интерферона, деконъюгация желчных кислот и др. (25;28;130;129).
Одним из важнейших механизмов КР является иммунный гомеостаз: иммуноглобулины (в первую очередь IgA), лизоцим, комплемент, лактофе-рин, пропердин. Их количество меняется в соответствии с менструальным циклом и во время беременности (45).
Механическим и функциональным барьером, препятствующим проникновению в организм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, служит слизистая оболочка половых путей. Лимфоидный аппарат подслизи-стого слоя, а также циркулирующие в кровотоке лимфоциты и макрофаги обеспечивают развитие самостоятельных иммунных реакций на локальное и системное воспаление, вызванное бактериальными и другими антигенами.
В комплексе механизмов КР важную роль играет цитадгезия микробов к рецепторам клеток слизистой влагалища, конкуренция за сайты адгезии, блокада адгезии патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при помощи иммуноглобулинов и факторов неспецифической защиты.
Микроорганизмы, прикрепляющиеся к участкам слизистой половых путей, где подвижность содержимого просвета и слизи более интенсивная, имеют специальные структуры (адгезины), с помощью которых они связываются с компонентами гликогена или мембранами эпителиальных клеток. При помощи адгезинов осуществляется фиксация микроорганизмов на поверхности места обитания. Большинство бактериальных адгезинов ведут себя как лектины, связываясь с полисахаридными рецепторными участками на гликопротеиновых и гликолипидных структурах (10;11).
Адгезины представляют собой широко распространенные соединения белковой или гликопротеиновой природы, проявляющие специфическую обратимую углевод-связывающую активность. Будучи медиаторами адгезии, адгезины могут быть локализованы в мембранах бактерий, на их поверхности, а также на специфических фимбриях, которые, проходя сквозь толщу эк-зополисахаридно-муцинового комплекса, фиксируют бактерии к соответствующим рецепторам эпителиальных клеток (80).
Число рецепторов на эпителиоцитах, к которым могут прилипать микробные клетки, ограничено. Установлено, что элементами, ответственными за адгезию, являются поверхностные структуры бактерий, содержащие адгезины, комплиментарные соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпителиальных клеток (10;11).
Методы обследования беременных
Водородный показатель вагинального отделяемого определялся с помощью бумажных полосок для рН-метрии с десятичной шкалой.
Ряд измерений рН проводили с помощью специального индикатора фирмы Merck, позволяющего получать результаты с точностью до 0,5.
Для этого использовали смывы вагинального отделяемого. Забор материала проводился пипеткой, снабженной резиновой грушей, после введения во влагалище до 3-5 мл физиологического раствора.
Материал наносился непосредственно на индикаторные бумажные полоски и по десятичной шкале, по окрашиванию индикатора определялся уровень рН. У здоровых женщин рН вагинального отделяемого находится в пределах 3,8-4,5.
При исследовании состояния вагинального микробиоценоза использовали методику окрашивания вагинальных мазков по Граму, с последующей микроскопией с иммерсией х 900 (54). Оценивали мазки по следующим критериям: 1. количество вагинального эпителия; 2. наличие лейкоцитарной реакции (число лейкоцитов в поле зрения); 3. состав вагинальной микрофлоры; 4. наличие "ключевых клеток" (клеток поверхностных слоев влагалищного эпителия с адгезированными на них в большом количестве бактериями).
2.2.4 Микробиологическое исследование вагинального биотопа Микробиологическое исследование проводили на базе ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Проведение микробиологического анализа предусматривало изучение биоценоза влагалища с определением качественного и количественного состава микрофлоры (72,76,143).
1) Забор клинического материала Забор клинического материала проводился в родильном доме на базе ГКБ № 72, в отделении патологии беременных.
Материалом для микробиологического исследования служили отделяемое влагалища и цервикального канала. После обнажения шейки матки влагалищными зеркалами, визуального осмотра шейки матки и стенок влагалища выполнялись следующие манипуляции:
Стерильным зондом для забора материала из заднего свода влагалища отбирали пробу секрета и помещали в транспортную среду.
2) Посев на диагностические среды
В редуцированном в атмосфере СОг фосфатном буфере готовили ряд 10-кратных разведений (с 10"1 до 10"9). Из различных разведений, позволяющих получить изолированные колонии, делали высев в количестве 0,1 мл на дифференциально-диагностические среды.
Грибы выращивали на агаре Сабуро, энтеробактерии на среде Эндо, стафилококки, энтерококки на солевом агаре, бифидобактерии на среде Блаурокка с азидом натрия. Лактобактерии выращивали на среде МРС-4. P.vulgaris выращивали на агаре с мочевиной.
Посевы на средах МРС-4, Блаурокка с NaN3 инкубировали в термостате при 37 С в течение 72 ч, при этом микроаэрофилы (лактобактерии) культивировали в условиях пониженного содержания кислорода в эксикаторе, бифидобактерии выращивали в атмосфере ССЬ с использованием анаэростата OXOID (Англия) и газ-пакетов.
Посевы на среде Эндо и солевом агаре инкубировали в термостате при 24 С в течение 24 часов, посевы на среде Сабуро 48-72 ч.
Для выделения стрептококков использовали элективную жидкую среду (г. Махачкала), инкубировали 24-48 часов при 37 С, затем делали пересевы на среду МПА и инкубировали 24-48 часов.
По окончанию инкубации производили подсчет колоний выросших на чашках. Степень микробной обсемененности определяли в колониеобразую-щих единицах в пересчете на один мл вагинального отделяемого (КОЕ/мл).
Видовую идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по общепринятым методикам, используя номенклатуру Берджи и Руководства по клинической микробиологии (94,143).
Для постановки методики адгезии на моделях формалинизированных эритроцитов человека и эпителиальных клетках влагалища коммерческие серии пробиотиков (лактобактерин, бифидумбактерин, биоспорин, ацилакт) в виде лиофилизированной биомассы растворяли из лиофильного состояния 1 мл ЗФР на 1 дозу. Затем взвесь штаммов дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин 10 минут от сред культивирования и высушивания, доводили до концентрации 1x109 КОЕ/мл. Суппозитории расплавляли согласно методике, применяемой при контроле специфической активности суппозиториев, представленной в ФСП на суппозиториальные формы пробиотиков
Выбор наполнителя для новой лекарственной формы пробиотика «Биоспорин суппозитории»
Пробиотик биоспорин выпускается в виде лиофилизированной биомассы во флаконах и в таблетках, что не полностью отвечают современным требованиям рынка лекарственных средств.
Были изготовлены варианты суппозиториев на различных гидрофобных основах с использованием культуры штамма B.subtilis 3 и B.licheniformis 31. В качестве наполнителя суппозиториев были апробированы следующие вещества - Витепсол Н-15, масло какао, гидрированный жир с эмульгатором Т-2 (пропись №1).
Лиофилизат биоспорина измельчали. В навеске 0,1 г. содержалось не менее 1х109 КОЕ/мл B.subtilis 3 и 0,1 х 109 КОЕ/мл B.licheniformis 31. Наполнители (гидрированный жир с эмульгатором Т-2; Витепсол Н-15; масло какао) расплавляли на водяной бане при температуре (65±0,5)С, после чего перемешивали в течение 20 минут.
Затем к каждому из наполнителей добавляли расчетное количество биокомпонентов B.subtilis 3 и B.licheniformis 31, перемешивали в течение 20 минут до получения однородной массы, и разливали массу в формы. После розлива формы помещали в низкотемпературный шкаф и выдерживали при температуре (5±0,2) в течение 20 минут до полного застывания суппозиториев.
Приготовленные серии суппозиториев были испытаны по всем показателям, заложенным в НД на аналогичные препараты (внешнему виду, расплавляемости, контаминации посторонними микроорганизмами, антагонистическим свойствам) (табл 3-5).
Определяли антагонистическую активность производственных штаммов B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 в отношении тест-штаммов для контроля антагонистической активности (S.aureus 209, E.coli 157, P.vulgarisl77, P.mirabilis 24a, S.sonnei 2802, S.flexneri 337, S.flexneri 170, C.albicans 140).
При исследовании антагонистической активности экспериментальных серий с различными наполнителями в отношении тест-штаммов, выявлено, что основа суппозиториев не влияет на показатели антагонизма, т.к. разница в антагонистической активности штаммов, входящих в суппозитории с различными наполнителями, была статистически недостоверной.
Для решения поставленных задач обследовано 197 пациенток в возрасте от 18 до 38 лет во 2-ом и 3-ем триместре беременности.
Все беременные достоверно не отличались по следующим параметрам: возрасту, росто-весовому коэффициенту, семейному, акушерско-гинекологическому анамнезу.
Обязательным условием включения в группы являлось отсутствие незащищенных половых контактов во время лечения и последующего наблюдения за женщинами.
Обследование беременных, проводимое клиницистами, включало: подробный анамнез (особенности соматического статуса, менструальной и генеративной функции; наличие гинекологических и сексуально-трансмиссивных заболеваний), особенности течения настоящей беременности в каждом триместре и проводимой терапии.
Диагностика нарушений микрофлоры влагалища у беременных основывалась на выявлении совокупности ряда клинических признаков и применении необходимых лабораторных методов. Обследование включало в себя рН-метрию вагинального отделяемого, аминный тест, микроскопию вагинальных мазков.
рН-метрия вагинального отделяемого, аминный тест были проведены совместно с сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии РМАПО на базе роддома № 72 (отделение патологии беременности).
У 180 беременных были диагностированы различные нарушения микрофлоры влагалища. При обследовании были выявлены следующие нарушения влагалищного микробиоценоза, такие как бактериальный вагиноз (БВ) и вульвовагинальный кандидоз (ВВК), а также воспалительное заболевание слизистой влагалища - неспецифический вагинит (НВ).
На основании этих данных клиницистами все беременные с патологией влагалищного биотопа были разделены на три группы в соответствии с выявленными нарушениями биоценоза.
Для подтверждения диагнозов было проведено микробиологическое исследование влагалищного отделяемого беременных. Микробиологические посевы проводились на базе лаборатории диагностических бактерийных препаратов с коллекцией микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича. 3.2.1 Гинекологическое обследование беременных
При сборе гинекологического анамнеза клиницистами было установлено, что 165 (84,4%) обследованных в прошлом получали лечение по поводу воспалительных процессов влагалища, шейки матки, придатков.
Длительность заболеваний составила до момента наступления настоящей беременности от 6 месяцев до 4-х лет.
Следует отметить, что 114 (62,2%) пациенток многократно лечились по поводу неспецифического вагинита, при этом очень часто использовались самые различные антибактериальные препараты местно, перорально или па-рентрально. Большинству женщин назначались содовые спринцевания, спринцевания отваром ромашки или слабым раствором перманганата калия. Треть из них (31%) - интравагинально применяли гормональные мази (в основном кортикостероидные). Отсутствие четких клинических и дифференциально-диагностических признаков БВ, ВК и НВ способствовало неправильному выбору лечения и его низкой эффективности. Так, по нашим данным, только 42 (15,5%) пациентки отмечали кратковременное улучшение состояния, с последующим рецидивом в течение одного месяца после лечения. Во всех обследованных группах, беременные отмечали по мере про-грессирования беременности увеличение вагинального отделяемого, изменения консистенции и запаха (табл. 3).
Изучение специфической активности различных лекарственных форм пробиотиков
Таким образом, исследования адгезивной активности суппозитори-альных форм пробиотиков показали снижение уровня ИАМ и К у лактобак-терина и биоспорина, при неизменяющемся коэффициенте (К=100%), что также свидетельствует о блокировании адгезинов на микробных клетках компонентами жировой основы. У ацилакта и бифидумбактерина наблюдалось снижение уровня адгезивной активности по отношению к клеткам влагалищного эпителия и коэффициента К, что позволяет предположить, что в данном случае происходит блокирование и адгезинов пробиотиков и рецепторов клеток эпителия.
Из полученных результатов следует, что при равных показателях специфической активности активности (антагонистической активности, активности кислотообразования, количества живых микробов в дозе препарата), пробиотики в лиофилизированной форме, по сравнению с суппозиториями, обладают более высокой адгезивной активностью и имеют преимущество перед суппозиториями.
Таким образом, из нашей работы следует, что пробиотики в лиофилизированной форме имеют преимущество перед суппозиториями, т.к. обладают более высокой адгезивной активностью по отношению к клеткам влагалищного эпителия, что позволяет быстрее достигать терапевтического эффекта в лечении дисбиотических нарушений влагалищного биотопа.
Адгезивная активность УПМ влагалища на модели формалинизированных эритроцитов человека in vitro Были проведены исследования по изучению адгезивной активности условно-патогенных микроорганизмов и грибов рода Candida по отношению к формалинизированным эритроцитам человека. В исследовании использовались УПМ и грибы рода Candida, выделенные из влагалищного отделяемого беременных с различными нарушениями микроэкологии влагалища (табл. 14).
Исследования показали, что наибольшую адгезивную активность по отношению к эритроцитам человека проявляют E.coli: индекс адгезивности микроорганизма равен 22,34±0,25, при К, равном 100%.
Высокой адгезивностью обладают штаммы S.epidermidis, P.vulgaris, S.aureus и Streptococus spp. (от 6,62±0,2 до 11,47±0,63), при этом коэффициент К также равен 100 %.
Штаммы C.albicans и Enterococcus spp. обладают низкой адгезивной активностью (ИАМ-от 1,71 ±0,06 до 1,98±0,18). Коэффициент К (%) определяется в пределах от 49,33±2,22 до 66,67±3,56.
В исследованиях показано, что наибольшие показатели ИАМ и К (%) определялись у стафилококков, стрептококков, энтеробактерий и протея. Таким образом, можно сделать вывод, что данные УПМ обладают наибольшим количеством адгезинов к эритроцитам. Тогда как C.albicans и энтерококки показывают низкие значения ИАМ и К (%), что указывает на меньшее количество адгезинов у этих бактерий.
Биоспорин выпускается в лиофилизированной форме и в таблетках. В исследованиях ученых доказано, что показатели антагонистической активно 79 сти биоспорина в виде лиофилизата и у таблетированных форм статистически достоверно одинаковы (54).
В связи с тем, что суппозитории биоспорина являются новой лекарственной формой препарата, следовало изучить влияние компонентов свече-вой основы биоспорина на показатели антагонистической активности.
Была исследована антагонистическая активность коммерческих серий пробиотиков - лиофилизат, суппозитории, в отношении УПМ, выделенных из влагалищного отделяемого беременных с дисбиозами влагалища (табл 15).
В работе также использовались тест-штаммы (S.aureus, C.albicans, E.coli, P.vulgaris), применяемые для контроля антагонистической активности пробиотиков (ГИСК им. Л.А. Тарасевича).
Enterococcus и Streptococcus наблюдается у биоспорина (25,35-27,62), бифи-думбактерин также проявляет высокую антагонистическую активность (20,0-22,57 мм), лактобактерин обладает умеренной антагонистической активностью по отношению к аэробным условно-патогенным микроорганизмам (12,0-21,9 мм.).
Антагонистическая активность ацилакта по отношению к условно-патогенным микроорганизмам ниже, чем у бифидумбактерина и лактобакте-рина (11,14-19,8 мм) (рис. 8).
В результате исследований выявлено, что споровый пробиотик биоспо-рин в различных лекарственных формах (лиофилизат, суппозитории) проявляет высокую антагонистическую активность в отношении УПМ и грибов рода Candida, выделенных от беременных с дисбиозами влагалища, и, следовательно, может использоваться при лечении вульвовагинального кандидоза у беременных.
Бифидумбактерин проявляет выраженную антагонистическую активность по отношению к УПМ (17,14-24,2 мм).
Исследования показали, что молочнокислые пробиотики (лактобактерин, ацилакт) проявляют разную антагонистическую активность по отношению к УПМ влагалища.
По отношению к штаммам S.aureus, E.coli и P.vulgaris лактобактерин и ацилакт показывают высокую антагонистическую активность (от 16,0 до 21,9 мм), по отношению к штаммам Enterococcus spp. и Streptococcus spp. -от умеренной до низкой (от 9,5 до 17,57 мм).
Антагонистическая активность лактобактерина, ацилакта и бифидумбактерина по отношению к грибам рода Candida низкая или близка к нулевой и составляет в среднем 4-6 мм.
В работе показано, что форма выпуска пробиотиков ( лиофильно высушенная биомасса, суппозитории), применяемых в акушерско-гинекологической практике, не влияет на показатель антагонистической активности.
