Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Клинико-эпидемиологические особенности и лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза 10
1.1. Клинико-эпидемиологические особенности урогенитального трихомониаза 10
1.2. Микробиология и ультраструктура T.vaginalis на современном этапе 12
1.3. Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза 17
Глава 2. Материалы и методы исследования 24
2.1. Характеристика обследованных больных 24
2.2. Особенности преаналитического этапа при инфекции, вызванной T.vaginalis 26
2.3. Характеристика методов, использованных для специфической детекции T.vaginalis 26
2.4. Методы статистической обработки полученных данных 30
Глава 3. Клинико - эпидемиологическое и социально - гигиеническое обоснование выделения группы обследуемых пациентов с урогенитальным трихо-мониазом для оценки эффективности диагностических тестов 33
3.1. Эпидемиологические особенности заболеваемости урогениталь-ным трихомониазом 33
3.2. Социально-гигиеническая характеристика больных 35
3.3. Клинические особенности урогенитального трихомониаза 45
Глава 4. Оценка информативности методов лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза 57
4.1. Ультраструктурные особенности T.vaginalis 57
4.2. Сравнительная оценка информативности лабораторных методов, применяемых для обнаружения T.vaginalis 67
4.3. Модифицированная питательная среда для выделения T.vaginalis 84
4.4. Детекция T.vaginalis методом полимеразной цепной реакцией 90
4.4.1. Подбор праймеров и их сравнительная оценка 91
4.4.2. Лабораторная оценка информативности ПЦР с использованием праймеров к различным мишеням 93
4.4.3. Оценка информативности ПЦР в реальном времени с праймерами к различным фрагментам ДНК T.vaginalis 98
Заключение 108
Выводы 122
Практические рекомендации 123
Список литературы 124
Приложение 144
- Микробиология и ультраструктура T.vaginalis на современном этапе
- Характеристика методов, использованных для специфической детекции T.vaginalis
- Социально-гигиеническая характеристика больных
- Сравнительная оценка информативности лабораторных методов, применяемых для обнаружения T.vaginalis
Введение к работе
Актуальность проблемы
Урогенитальный трихомониаз широко распространен в мире и повсеместно занимает одно из первых мест в структуре инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) [Дмитриев Г.А., 2005, Теличко И.Н., 2007, Schwebke J.R. et al., 2006, Shafir S.C. et al., 2009]. В последние годы отмечаются определенные позитивные тенденции в динамике заболеваемости манифестными формами трихомониаза. Указанное, однако, сопровождается увеличением количества своевременно не выявленных субманифестных и, в особенности, бессимптомных вариантов этой патологии. По некоторым данным их удельный вес достигает 40-50% от общего числа больных трихомониазом [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. В этой связи, очевидно, что истинная ситуация, учитывающая все формы урогенитального трихомониаза, может характеризоваться и негативной направленностью.
Социальным последствием указанного является существенное ухудшение репродуктивного здоровья населения, что в последние годы рассматривается в качестве угрозы национальной безопасности России и послужило в соответствии с Постановлением Правительства РФ №715 от 01.12.2004г. основанием для отнесения трихомониаза к разряду социально значимых заболеваний. Всемирная организация здравоохранения 18 мая 2006г. на 59-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения в отношении ИППП утвердила глобальную стратегию на 2005-2015гг. «Предотвращение и контроль инфекций, передаваемых половым путем», в связи с чем совершенствование диагностики урогенитального трихомониаза было обозначено в качестве одной из первостепенных задач дерматовенерологии. Вместе с тем клиническая дифференцировка указанного заболевания достаточно проблематична, поскольку симптоматика лишена специфики и может иметь место и при других инфекций передаваемых половым путем [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи распространенностью атипичных вариантов Trichomonas vaginalis [Дмитриев Г.А., 2003, Schwebke J.R. et al., 2006], наиболее часто выявляемых у мужчин [Иванов АМ., 2005 и др.], учет которых в соответствии с приказом МЗ СССР №1570 от 04.12.1986г. не осуществляется должным образом.
Все вышеперечисленное в значительной степени снижает информативность, особенно у мужчин, традиционно применяемых методов микроскопии и культурального исследования [Марданлы С.Г. и др., 2007] и предполагает разработку новых, более совершенных методов лабораторной диагностики трихомониаза. Среди последних в качестве наиболее перспективных, как было показано на модели других инфекций урогенитального тракта, рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Caliendo A.M. et al., 2005]. Однако имеющиеся литературные данные относительно диагностики урогенитального трихомониаза этим методом крайне противоречивы [Дмитриев Г.А., 2003, Теличко И.Н. и др., 2006, Марданлы С.Г. и др., 2007, Caliendo A.M. et al., 2005, Mckechnie M.L. et al., 2009]. Указанное предопределило необходимость систематизации имеющихся данных и разработку четких клинико-лабораторных критериев для применения ПЦР в диагностике трихомониаза с учетом специфики преаналитического, аналитического и, безусловно, постаналитического этапов.
Цель исследования
Провести сравнительную оценку эффективности методов лабораторной диагностики трихомониаза у мужчин, установить информативность современных молекулярно-генетических диагностических технологий и обосновать показания к их практическому применению.
Задачи исследования
-
На основе клинико-эпидемиологических и социально-гигиенических признаков обосновать выделение группы обследуемых пациентов с урогенитальным трихомониазом, адекватной для оценки эффективности диагностических лабораторных тестов.
-
Провести сравнительный анализ информативности используемых в настоящее время методов лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.
-
Оптимизировать культуральный метод для сокращения сроков идентификации Trichomonas vaginalis.
-
На основе анализа банка генов подобрать и апробировать праймеры для детекции Trichomonas vaginalis методом классической полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени.
-
Обосновать применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при диагностике урогенитального трихомониаза.
Научная новизна исследования
В результате проведенных исследований создана модификация питательной среды, позволяющая сократить сроки детекции Trichomonas vaginalis культуральным методом до 2 суток. Впервые в отечественных тест-системах подобраны и апробированы праймеры к гену 18S рРНК T.vaginalis. Данные праймеры могут быть использованы как для ПЦР в классическом варианте, так и ПЦР в реальном времени. Праймеры к гену 18S рРНК позволили повысить вероятность обнаружения Trichomonas vaginalis методом полимеразной цепной реакции. Показаны преимущества применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики урогенитального трихомониаза, обусловленные высокой чувствительностью, возможностью количественного определения специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis в исследуемом материале.
Научно-практическая значимость работы
Разработан алгоритм лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза, включающий полимеразную цепную реакцию у мужчин. Предложена модификация состава питательной среды для культурального исследования клинического материала и сконструированы праймеры для полимеразной цепной реакции, что позволило повысить эффективность лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у больных.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям адекватной является группа больных с урогенитальным трихомониазом являются мужского пола в возрасте 20-29 лет, имеющих высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющих алкоголем (82,7%), часто пользующихся практикой незащищенного секса (55,5%).
-
Включение комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в состав питательной среды для культивирования Trichomonas vaginalis позволяет сократить сроки диагностики урогенитального трихомониаза культуральным методом.
-
Преимуществом классической полимеразной цепной реакции в сравнении с микроскопическим и культуальным методами диагностики урогенитального трихомониаза является выявление различных форм заболевания вне зависимости от выраженности у обследуемых пациентов воспалительного процесса, характера течения и длительности заболевания.
-
Использование полимеразной цепной реакции по конечной точке с праймерами TrVa 22 (5TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3), TrVa 11 (5TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis является высокоспецифичным тестом в диагностике урогенитального трихомониаза. Применение количественного варианта ПЦР в реальном времени с праймерами TrVa 22 (5TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3), TrVa 11 (5TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале.
Апробация
Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Полевые и экспериментальные исследования биологических систем» (Ишим, 2009); IV международном конгрессе, посвященном современным аспектам вспомогательных репродуктивных технологий «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)» (Москва, 2007); I региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); IX всероссийской конференции дерматовенерологов (Екатеринбург, 2006).
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-микробиологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Внедрение результатов исследования в практику
Полученные в настоящем исследовании результаты внедрены и используются в научно-педагогической и лечебно-диагностической работе кафедры дерматовенерологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО и лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», ГУЗ «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 – в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 25 рисунков, 1 приложение. Список литературы включает 177 источников (64 отечественных и 113 зарубежных авторов).
Микробиология и ультраструктура T.vaginalis на современном этапе
Трихомонады - жгутиковые эукариоты царства простейших - Protozoa, подцарства Archezoa, типа Parabasalia, класса Trichomonadea порядка Trichomonadida. В организме человека могут обитать 4 вида трихомонад, отличающиеся определенным тропизмом. Dientamoeba fragilis обнаруживаются в ободочной кишке, Pentatrichomonas hominis - в слепой кишке, Trichomonas tenax — в полости рта, Trichomonas vaginalis — в урогениталь-ном тракте [29].
T.vaginalis может существовать одновременно в трех морфологических формах: грушевидной (жгутиковой), амебовидной и круглой (шаровидной). При прикреплении к клетке хозяина T.vaginalis приобретает амебовидную форму с многочисленными псевдоподиями, повторяющими контур эпителиальной клетки [152]. Круглые формы T.vaginalis чаще имеют атипичное строение [15, 57, 58, 74, 75]. Округлый морфотип T.vaginalis чаще встречается у мужчин с хронической формой трихомониаза, чем у женщин [58]. Изменение фенотипа T.vaginalis зависит от фазы роста, физико-химических факторов среды и сопровождается коррелятивной изменчивостью внутреннего строения [15, 152]. Согласно данным литературы, структурные изменения, наблюдаемые в клетке атипичных форм, указывают на снижение физиологической активности простейшего, а появление их свидетельствует о неблагоприятных условиях [18].
T.vaginalis имеет пять жгутиков, которые являются органами движения и адгезии [58, 152]. Жгутиковый аппарат T.vaginalis организован достаточно сложно. У типичных T.vaginalis 4 кинетосомы располагаются параллельно на переднем конце клетки [58, 152]. Кинетосома возвратного жгутика располагается под углом [18, 57, 152]. У атипичных форм все кинетосомы (базальные тела) располагаются параллельно друг другу, при этом происходит редукция фибриллярных связок между кинетосомами [18].
В передней части тела паразита располагается ядро продолговато -овальной, круглой или грушевидной формы, содержащее 5-6 ядрышек, окруженное двухслойной ядерной мембраной, пронизанной многочисленными порами [58, 152]. Согласно данным литературы, форма ядра используется для дифференцировки видов трихомонад [18, 58]. Однако данный признак нельзя считать надежным, поскольку наблюдается варьирование ядерной морфологии у разных морфотипов одного вида [18, 58]. У типичных и у атипичных форм ядро содержит постоянно конденсированные хромосомы и единственное ядрышко, но его трудно различить среди конденсированного хроматина, не связанного с хромосомами [18, 58]. Нук-леоплазма у обычных форм T.vaginalis гомогенная, у атипичных гетерогенная по плотности [18].
У типичных форм в околоядерной области наблюдается система дополнительных эндоплазматических мембран [58, 152]. Цистерны шерохо ватого эндоплазматического ретикулума (ЭР) огибают ядро на расстоянии от оболочки [18, 58, 152]. У атипичных форм ЭР в околоядерной области отсутствует [18]. Рибосомы типичных форм Т.vaginalis многочисленны, локализуются во всех областях клетки. В области ядра, ЭР, вблизи параба-зального аппарата, базальных тел жгутиков, аксостилярного комплекса и различных включений они организуются в полисомы, преимущественно на мембранах ЭПС [18, 58, 152]. Упорядоченность в расположении рибосом совершенно не свойственна атипичным формам [18]. В цитоплазме атипичных T.vaginalis полисомы отсутствуют, рибосомы распределены неравномерно, в отдельных областях они собираются в агрегированные кластеры, а некоторые зоны цитоплазмы свободные от рибосом [18]. Согласно данным литературы отсутствие полисом и перераспределение рибосом может быть связано с редукцией ЭПС [18].
У T.vaginalis обнаружены внутриклеточные опорные структуры: кос-та, к которой прикрепляются ундулирующая мембрана и аксостиль [15, 152]. У атипичных округлых форм происходит редукция аксостиля, унду-лирующей мембраны [18].
В цитоплазме живых T.vaginalis визуализированы гранулы и гидро-геносомы, являющиеся аналогами митохондрий и обладающие ферментами, участвующие в метаболизме клетки [57, 152]. В цитоплазме обычных T.vaginalis эти органеллы с плотным гомогенным содержимым достаточно однородны и расположены в средней и задней части клетки возле пельта -аксостилярного комплекса [18, 57, 152]. У атипичных форм T.vaginalis гидрогеносомы значительно варьируют по размерам, форме и плотности содержимого, расположены хаотично по всему объему клетки [18].
Согласно данным литературы, аппарат Гольджи T.vaginalis занимает значительный объем в клетке, состоит из двух диктиосом с сильно уплощенными цистернами, дифференцированных на четыре классических суб-компартмента (цис, промежуточный, транс и сеть транс-Гольджи) [18, 57,
152]. Цис-цистерна соединена с парабазальным филаментом и находится возле ядра в непосредственной близости от эндоплазматического ретику-лума [160]. Диктиосомы соединены с базальными телами жгутиков фибриллярным парабазальным тяжем, который не сохраняется при химической фиксации препаратов, а косвенным признаком транс-области аппарата Гольджи могут служить многочисленные округлые везикулы [160]. В накопительной культуре вирулентных форм трихомонад типичные диктиосомы присутствуют достаточно редко. В цитоплазме типичных Т.vaginalis имеются стопки уплощенных мембранных цистерн. Аппарат Гольджи вместе с парабазальным филаментом образует так называемое парабазальное тело — органеллу, наличие которой определяет принадлежность жгутиконосца к Parabasalia [53]. У трихомонад аппарат Гольджи проходит сложный цикл деления - "гольджикинезис", включающий слияние цистерн и редукцию диктиосом [77, ПО]. Этот процесс происходит в интерфазе. Очевидно, кажущееся отсутствие диктиосом у грушевидных форм связано с этапом "гольджикинезиса". Согласно данным литературы, у атипичных форм T.vaginalis отсутствуют типичные диктиосомы и уплощенные цистерны, а в околоядерной области наблюдается скопление различных по форме и по плотности везикул [18]. Основной функцией аппарат Гольджи является гликозилирование адгезинов — поверхностных белков, определяющих адгезию паразитов к поверхности клеток эпителия и соответственно патогенность T.vaginalis [53, 160].
Характеристика методов, использованных для специфической детекции T.vaginalis
Для лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза использовали микроскопию нативного препарата, окрашенного мазка (по Граму), культуральный метод (KM), полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
Ультраструктурные особенности T.vaginalis исследовали с использованием электронной микроскопии (на базе ЦНИКВИ, г.Москва). Изучение ультраструктуры T.vaginalis проводили методом ультратонких срезов с последующим изучением на электронном микроскопе (JEM100S, Япония) [Абдумаликов Р.А., 1995].
Для электронно-микроскопического исследования использовались препараты T.vaginalis, выделенные от больных с хронической формой заболевания. Для их накопления проводилось предварительное культивирование в жидкой питательной среде при температуре 37С в течение 3-х суток. Затем в пробирку с T.vaginalis добавляли несколько капель фиксатора - 4% раствора глютаральдегида на ОД М кокадилатном буфере (рН 7,2 -7,4) с последующим центрифугированием содержимого пробирки в течение 15 минут со скоростью 1,5 оборота в минуту. Осадок помещали в пробирку типа Eppendorf, куда доливали фиксатор (2 мл). С закрытой пробкой пробирку с фиксированным биоматериалом хранили при температуре +4С до отправки в лабораторию.
Префиксацию осуществляли в течение 1-3 часов. Далее производилось отмывание материала в 0,2-молярной сахарозе на 0,1 -М кокадилатном буфере. Сахарозу добавляли для получения изотонического раствора. Для фиксации материал переносили на 2-3 часа в забуференный 1% раствор тетраоксида осмия на веронал - ацетатном буфере с 0,02% раствором хлористого кальция. После фиксации материал промывали в 0,1-М кокадилатном буфере с добавлением 0,2-молярной сахарозы.
Дегидратация материала производилась спиртами в порядке возрастающей концентрации: в 50% - в течение 15 минут; в 70, 96 и 100% спиртах - в течение 1 часа в каждом. Затем материал из абсолютного спирта переносили в окись пропилена или обезвоженного ацетона сроком на 1 час.
Заливка материала производилась рабочей смесью эпоксидных смол с окисью пропилена. Спустя 1- 2 часа после окончания пропитывания материала его переносили в полиэтиленовые капсулы на поверхность рабочей смеси эпоксидных смол и выдерживали при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем капсулы помещали в термостат, производилась окончательная полимеризация в течение 48 часов при температуре 40 С.
Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «Ultracut-5 Rei-chert» с помощью стеклянных ножей; срезы переносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой. Контрастирование осуществлялось при помощи спиртового раствора уранилацетата (10—15 минут) и гидроокиси свинца при комнатной температуре. Изготовленные срезы изучали на электронном микроскопе.
Для бактериоскопического исследования микропрепараты отделяемого из уретры окрашивали (ОМ) по Граму. Оценивали состояние эпителия уретры и влагалища, наличие и количество лейкоцитов, T.vaginalis.
Нативные препараты готовились и исследовались сразу после взятия материала. Для приготовления препарата на предметное стекло наносили каплю теплого изотонического раствора хлорида натрия 0,9%, с которой смешивали исследуемый материал. Взвесь накрывали покровным стеклом и микроскопировали. В нативном препарате оценивали - наличие T.vaginalis, размеры и форму простейших, характер их движения, ультраструктурные особенности.
Взятие отделяемого из уретры осуществляли стерильным урогени-тальным зондом. Материал помещался в стерильную пробирку со средой и доставлялся в лабораторию не позднее чем через 1-2 часа после забора. Для исследования на T.vaginalis применялась жидкая питательная среда (ООО НПФ «Диагност-мед», г.Омск). Инкубацию посевов проводили при температуре 37 С в течение 3-6 дней. T.vaginalis давали придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой брали материал для исследования в нативном препарате. Подсчет клеток
T.vaginalis проводили с использованием камеры Горяева. Реагенты и основное лабораторное оборудование для ПЦР. Использовался комплект реагентов для ПЦР-анализа с детекцией методом электрофореза T.vaginalis («ДНК-Технология», г.Москва). ПЦР использовали для верификации результатов микроскопии и культурального исследования при выявлении T.vaginalis. Материал собирали в пробирки с буферным раствором. Хранили в морозильной камере при температуре минус 20С.
При постановке ПЦР на один анализ использовалось 40 мкл реакционной смеси и 10 мкл ДНК из анализируемого образца. Состав реакционной смеси для ПЦР на одну пробу: деионизованная Н20; 10х буфер (0,67 М Трис - HCL рН 8,8; 20 мМ MgCL2; 0,15 М (NH4)2 S04); 0,25 мМ каждого дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дУТФ; по 10 пкМ праймеров TrVal и TrVa2; 2,5 U Taq ДНК полимеразы. В качестве положительного контроля ПЦР использовали лизированный прогреванием образец ДНК T.vaginalis.
В работе использовались следующие химические реагенты: натрия гидроокись (NaOH) чда (МХК «ЛАВЕРНА», Россия); ТРИС (гидроксиме-тил) аминометан осч («PROMEGA», США); Triton X - 100, чда («HELICON», Россия); соляная кислота (HCL) 37% (концентр.) («MERCK», Германия); агароза для электрофореза тип 1 (универс.) («PANREAC», Испания); этидиум бромид («ICN», Россия); бромфеноло-вый синий («ICN», Россия); феноловый красный чда («МАРЕЛАБ», Россия); дезоксинуклеозидтрифосфаты для ПЦР («SYNTOL», Россия); эти-лендиаминтетраацетат натрия (Ка2ЭДТА) («FLUKA», Швейцария); уксусная ледяная кислота хч («МАРЕЛАБ», Россия). Буферные растворы: 10-х буфер для ПЦР («SYNTOL», Россия); 30-х трисацетатный буфер для электрофореза («HELICON», Россия). Приготовление: трис-основание 14,5 г, ледяная уксусная кислота 3,47мл, №2ЭДТА 0,5 М 6 мл довести до 100 мл дистиллированной воды. Ферменты: термостабильная Tag - ДНК полиме-раза («SYNTOL», Россия). Использовался стандартный набор реактивов
для проведения ПЦР в режиме реального времени в присутствии интерка лирующего красителя SYBR Green I («SYNTOL», Россия). При приготовлении реакционной смеси использовались следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку: 2,5х реакционная смесь 10 мкл, смесь праймеров, 10 пкмоль/мкл каждого 0,5 мкл; MgCl2 25 мМ 0,15; деонизиро-ванная вода 25,5мкл; образец ДНК 1-5 мкл.
Социально-гигиеническая характеристика больных
В настоящее время идентификация T.vaginalis традиционными методами сталкивается с некоторыми трудностями. При микроскопии возможно принятие за T.vaginalis эпителиальных клеток, макрофагов, реже лейкоцитов, присутствующих в мазке, возможно обнаружение в урогенитальном тракте больных других видов трихомонад в связи с изменением в последнее время стереотипов сексуального поведения [58]. Согласно данным литературы, в нативных препаратах за T.vaginalis можно принять жгутиковые семейства бозонидов, для которых характерны быстрые прямолинейные движения, а также подвижные бактерии, фиксирующиеся на лейкоцитах и создающие впечатление малоподвижных трихомонад [18, 25]. По данным Козлюка А.С. (2001), при микроскопической диагностики урогениталыюго трихомониаза возможна неверная интерпритация цитоморфологических результатов исследования в сторону гипердиагностики за счет сходства атипичных T.vaginalis с функционально-активными макрофагами. Под воздействием неблагоприятных факторов T.vaginalis подвержены феноти-пической изменчивости, что затрудняет обнаружение атипичных T.vaginalis в виде округлых, слабоподвижных и неподвижных форм, иногда без жгутиков и ундулирующей мембраны [18]. Округлый морфотип T.vaginalis чаще встречается у мужчин с хронической формой трихомониаза, чем у женщин [58]. Согласно данным литературы, частота выявления в нативном препарате атипичных форм T.vaginalis составляет 5- 17% [66, 70, 151]. Учитывая данные обстоятельства, в целях определения цитоморфологических признаков Т. vaginalis атипичной формы, позволяющих проводить диагностику при отсутствии типичных грушевидных форм, нами проведено их электронно-микроскопическое исследование. Электроно-граммы, представленные в работе, выполненные с помощью современного электронного микроскопа (в ЦНИКВИ г.Москва), отображали информацию о структурной организации T.vaginalis. В качестве материала для исследования нами был взят соскоб из уретры 10 мужчин с хроническим трихомониазом, неоднократно леченых противотрихомонадными препаратами. Для электронно-микроскопического исследования использовали трехсуточную накопительную культуру, содержащую малоподвижные округлой формы T.vaginalis.
Согласно данным литературы, типичные T.vaginalis могут быть грушевидной (жгутиковой), амебовидной формы. При прикреплении к клетке хозяина приобретают амебовидную форму с многочисленными псевдоподиями, повторяющими контур эпителиальной клетки [152]. Круглые формы T.vaginalis чаще имеют атипичное строение [15, 57, 58, 74, 75]. Учитывая данное обстоятельство, при ультраструктурном исследовании первоначально обращалось внимание на форму T.vaginalis. На препаратах они были представлены различной формой: округлой, амебовидной, грушевидной или вытянутой (рис.10, 11). Хотя для электронного микроскопического исследования были предварительно отобраны культуры клеток - малоподвижные округлой формы T.vaginalis. Согласно данным литературы как типичные, так и атипичные формы окружены цитоплазматической мембраной без дополнительной оболочки [18]. При дальнейшем ультраструктурном изучении дополнительная оболочка T.vaginalis нами не была обнаружена. Согласно данным литературы, морфологической особенностью типичных T.vaginalis является наличие пяти жгутиков, четыре из которых располагаются в передней части тела в виде свободных жгутов, прикрепленных внутри цитоплазмы к базальному тельцу жгутика - кинетосоме. При этом 4 кинетосомы должны быть расположены параллельно на переднем конце, а кинетосома пятого жгутика (возвратный жгутик) - под углом внутри ундулирующей мембраны, совершающей волнообразные движения [18,57, 152]. Согласно данным литературы, дальнейшее ультраструктурное изучение T.vaginalis показало, что у атипичных округлых форм отсутствует ун-дулирующая мембрана, а все 5 кинетосом (базальные тела) располагаются параллельно друг другу [18]. Проводимое нами ультраструктурное исследование материала показало наличие у T.vaginalis 4 кинетосом, расположенных параллельно на переднем конце, и пятой кинетосомы - под углом внутри ундулирующей мембраны, а характерных особенностей строения кинетосом обнаружено не было (рис.11, 12). Согласно данным литературы, у типичных T.vaginalis вокруг кинето-сом наблюдается воронкообразное образование из микротрубочек - опорное образование - пельта [18, 57, 152]. Дальнейшее ультраструктурное изучение морфологии T.vaginalis показало, что у атипичных округлых форм трихомонад происходит редукция фибриллярных связок между ки-нетосомами, а пельта сохраняется лишь частично [18]. В наших исследованиях у T.vaginalis наблюдалось типичное строение пельты (рис.10). По литературе, у типичных форм T.vaginalis от пельты по средней линии тела просматривается сократимый тяж - аксостиль - трубкообразное опорное образование из микротрубочек. Аксостиль огибает ядро и пересекает вдоль всю клетку, а в задней части паразита заканчивается острым концом, механически укрепляя его [39]. Согласно данным литературы, в более поздние сроки ультраструктурное изучение T.vaginalis показало, что аксостиль у атипичных форм редуцирован [18]. При проведении нами ультраструктурного исследования T.vaginalis отсутствие аксостиля не наблюдалось (рис.13).
Сравнительная оценка информативности лабораторных методов, применяемых для обнаружения T.vaginalis
Клинические штаммы T.vaginalis от больных характеризовались наличием выраженой вакуолизации, преобладали электронно-прозрачные, лишенные содержимого везикулы неправильной формы, гидрогеносомы T.vaginalis значительно варьировали по размерам, форме и плотности содержимого, располагались хаотично по всему объему клетки. Данные морфологические изменения частично совпадали с изменениями округлых атипичных форм T.vaginalis, согласно данным литературы [18]. В ходе исследования проводились срезы материала с последующей ультраструктурной идентификацией, поэтому на срезе мы не всегда могли увидеть всю структуру клетки, а лишь отдельные ее компоненты. Электронно-микроскопическое исследование T.vaginalis достаточно трудоемкий и сложный метод в исполнении.
Согласно данным литературы, клинические проявления не всегда достаточно надежны для диагностики урогенитального трихомониаза, а для окончательного диагноза необходимы тщательные лабораторные исследования [15]. В литературе представлено множество исследовательских работ о фенотипической изменчивости T.vaginalis [14, 18, 28]. В мазках и культуре наряду с типичными идентифицируются атипичные формы Т.vaginalis [14, 18, 28]. Учитывая данные обстоятельства, нами проводился повторный просмотр препаратов и дополнительные исследования, при которых любая атипия без наличия типичных форм принималась за диагностическую ошибку, что не противоречило литературным данным [28]. Такой подход хотя и снизил чувствительность культурального и микроскопического методов, однако позволил увеличить достоверность их заключений. Нами проводилось сравнение информативности используемых прямых методов лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у 107 мужчин возрасте 20-29 лет. Для проведения сравнительного анализа информативности используемых в настоящее время методов лабораторной диагностики, установления их значения при детекции T.vaginalis нами использовались микроскопия окрашенного мазка, культуральный метод (модифицированная среда) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) (ДНК-Технология, Россия). Для увеличения достоверности лабораторных методов исследований проводилась двукратная оценка результатов первично и повторно взятых образцов. Данные оценки информативности использованных методов лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза представлены в таблице 29.
По полученным данным, наибольшей диагностической эффективностью в отношении T.vaginalis у мужчин обладала ПЦР, характеризующаяся достаточно высокой чувствительностью (81,9%) и специфичностью (88,6%), прогностической ценностью положительного (93,6%) и отрицательного результатов (70,5%), что подтверждается данными зарубежной литературы [93, 95, 136, 137, 174]. Однако статистически достоверно отличалась ПЦР чувствительностью, специфичностью, прогностической ценностью положительного и отрицательного результатов при урогениталь-ном трихомониазе только с микроскопическим методом (р 0,01).
Высокий показатель «разности риска» (64,1%) ПЦР свидетельствовал о высокой прогностической значимости ее результата. Высокий коэффициент асимметрии (35) подтверждал высокую связь между прогнозом и исходом исследования ПЦР.
Микроскопический метод характеризовался сравнительно низкой диагностической эффективностью (41,1%) (р 0,001), чувствительностью (38,9%) (р 0,001), специфичностью (45,7%) (р 0,01), прогностической ценностью положительного (59,6%) и отрицательного результатов (26,7%) (р 0,001). Низкий показатель «разности риска» (13,7%) микроскопического метода свидетельствовал о низкой прогностической значимости его результата, а низкий коэффициент асимметрии (0,5) подтверждал слабую связь между прогнозом и исходом исследования (табл.29).
Культуральный метод в отношении T.vaginalis у мужчин превосходил микроскопический по рассматриваемым критериям лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза - диагностическая эффективность (76,6%) (р 0,001), чувствительность (77,8%) (р 0,001), специфичность (80%) (р 0,01), прогностическая ценность положительного (88,5%) и отрицательного результатов (60,9%) (р 0,001) (табл.29). Высокий показатель «разности риска» (49,4%) культурального метода свидетельствовал о высокой прогностической значимости его результата по сравнению с микроскопическим методом. Однако данный показатель был ниже, чем у ПЦР. Коэффициент асимметрии (12) культурального метода был ниже, чем у ПЦР (35), поэтому связь между прогнозом и исходом исследования слабее, чем у ПЦР (табл.29).
