Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Особенности хеликобактерной инфекции 11
1.1.1 . Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori 11
1.1.2. Факторы патогенности Helicobacter pylori 14
1.1.2.1. Уреаза 17
1.1.2.2. Продукт гена IceA 18
1.1.2.3. Вакуолизирующий цитотоксин 18
1.1.2.4. Остров патогенности Helicobacter pylori 21
1.1.2.5. Другие факторы патогенности 23
1.2. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori 24
1.3. Лабораторная диагностика хеликобактериоза 27
1.3.1. Бактериологический метод 30
1.3.2. Морфологическая группа методов 32
1.3.3. Быстрый уреазный тест 34
1.3.4. Уреазные дыхательные тесты 35
1.3.5. Серологический метод 36
1.3.6. Молекулярно-генетические методы 39
1.3.6.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Методики подготовки клинических проб к проведению ПЦР 48
2.1.1. Подготовка клинических проб к проведению ПНР методом кипячения 48
2.1.3. Подготовка клинических проб к проведению ПНР методом, предложенным Марковой Г.А. и соавт. (1994) - полный вариант 49
2.1.4. Способы выделения ДНК из клинического материала, основанные на неферментативном лизисе исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом 50
2.1.4.1. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб А» 51
2.1.4.2. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб Б» 52
2.1.5. Методика выделения ДНК из парафинизированных срезов 52
2.2. Проведение ПЦР-амплификации фрагмента генома Helicobacter pylori... 52
2.2.1. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter
pylori с использованием тест-системы «Helicobacter» 52
2.2.2. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter pylori с использованием тест-системы «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520» 53
2.2.3. Проведение ПЦР-амплификации гена UreC Helicobacter pylori с использованием тест-системы «Хеликопол II» 54
2.2.4. Проведение ПЦР-амплификации гена CagA Helicobacter pylori с помощью тест-системы «ДиаГен-Helicobacter» 55
2.2.5. Проведение ПЦР-амплификации гена VacA Helicobacter pylori с использованием набора «Хеликопол VA» 56
2.3. Пост-ПЦР обработка продуктов амплификации с помощью урацил-ДНК-гликозилазы 57
2.4. Метод гетеродуплексного анализа фрагмента гена CagA Helicobacter pylori 57
2.5. Методы регистрации результатов 58
2.5.1. Электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле 58
2.5.1.1. Приготовление агарозного геля 58
2.5.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле 58
2.5.1.3. Учет результатов 59
2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле 60
2.5.2.1. Приготовление 10% полиакриламидного геля 60
2.5.2.2. Проведение электрофореза в 10% полиакриламидном геле .60
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 62
3.1. Адаптация метода ПЦР для целей практической клинической диагностики хеликобактерной инфекции 62
3.1.1. Подбор оптимального приборного обеспечения амплификации...62
3.1.2. Выбор метода обработки клинического материала 65
3.1.3. Апробация экспериментальных отечественных тест-систем для ПЦР-детекции Helicobacter pylori 67
3.1.4. Антиконтаминационная защита проведения ПЦР-детекции Helicobacter pylori 74
3.1.5. Введение внутреннего контроля ПЦР 76
3.2. Выявление Helicobacter pylori в различных типах биологического материала: биоптате слизистой оболочки желудка, желудочном соке, фекалиях 79
3.3. Сопоставление результатов диагностики, полученных традиционными и молекулярно-биологическими методами 82
3.4. Выявление Helicobacter pylori у больных разных возрастных групп с различными формами гастродуоденальной патологии 87
3.5. Разработка варианта ПЦР-детекции Helicobacter pylori, позволяющего оценивать эффективность проведенной антихеликобактерной терапии 90
3.6. Исследование возможности использования метода ПЦР для выявления факторов патогенности Helicobacter pylori 95
3.7. Исследование гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA Helicobacter pylori методом гетеро дуплексного анализа 103
Заключение 108
Выводы 118
Список литературы 119
- Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori
- Подготовка клинических проб к проведению ПНР методом кипячения
- Проведение ПЦР-амплификации гена VacA Helicobacter pylori с использованием набора «Хеликопол VA»
- Адаптация метода ПЦР для целей практической клинической диагностики хеликобактерной инфекции
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Открытие этиологической и патогенетической роли бактерий рода Helicobacter при гастродуоденальных заболеваниях явилось одним из важнейших достижений современной микробиологии и гастроэнтерологии. В настоящее время не вызывает сомнения, что Helicobacter pylori является этиологическим фактором 70-80% гастритов (Аруин.Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П., 1993). Этот микроорганизм обнаруживается более чем у 95% больных, страдающих язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ДПК), у 70-80%) больных с язвенной болезнью желудка и в 60 - 70% случаев при раке желудка (Каргальцева Н.М., 1997; Pretolani S., Bonvicini F., Gasbarrini G., 1998). В развитых странах рак желудка стоит на четвертом месте среди причин смерти от злокачественных новообразований, а в развивающихся он прочно занимает первое место. Международное агентство по изучению рака Всемирной Организации Здравоохранения признало инфекцию Н. pylori канцерогенной для человека (Татаринов П.А., Грацианская А.Н., 1998; Аруин Л.И., 2001). Риск развития пептической язвы выше в 30 раз, а рака желудка — в 3-6 раз выше у хеликобактер-положительных индивидуумов по сравнению с лицами, не инфицированными этим возбудителем (Ивашкин В.Т., 1997).
В Российской Федерации по данным официальной статистики, ежегодно регистрируется более 1 млн. случаев заболеваний хроническими гастритами и язвенной болезнью, более 100 тыс. больных подвергается резекции желудка. Исключительно велика частота хеликобактериоза у детей — более 100 на 100 тыс. детского населения или более 10% всех заболеваний пищеварительного тракта (Сафонова Н.В., Жебрун А.Б., 1995).
В связи с осознанием роли Н. pylori в этиологии гастродуоденальных заболеваний, появились многочисленные работы по изучению Н. pylori, разработаны схемы для эрадикации Н. pylori, диагностические технологии. В настоящее время разработан целый ряд методов, позволяющих выявлять Н. pylori или последствия его персистирования в организме: бактериологический — основной метод лабораторной диагностики, включающий в себя выделение, идентификацию, культивирование возбудителя и определение его биологических свойств; биохимические методики - заключаются в обнаружении в исследуемой пробе (биоптате слизистой оболочки желудка) фермента уреазы, продуцируемого Н. pylori или в определении уровня аммиака в воздушной среде ротовой полости пациента (аэротест); - морфологические методики - микроскопия окрашенных мазков- отпечатков биоптатов слизистой оболочки желудка (цитологический метод) или микроскопия парафинизированных срезов, окрашенных стандартными красителями (гистологический метод) или с использованием люминесцирующей сыворотки (гистоиммунохимический метод); серологические методики - наиболее часто используется иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на выявлении специфических антител, в основном класса Ig G к Н. pylori;
Современный подход к изучению инфекции К pylori состоит в использовании молекулярно-генетических методов исследования. Данные методы представляют собой различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР). Достоинства ПЦР обусловлены практической простотой и скоростью, чувствительностью и специфичностью данного метода. В связи с этим крайне актуально освоение и активное внедрение в работу практических медицинских учреждений методов диагностики, основанных на выявлении уникальных фрагментов генома возбудителя. Указанные методы выявления инфицированности К pylori являются перспективными, высокая чувствительность, специфичность и относительная простота метода позволяет его использовать в скрининге больных. Применение метода ПЦР для диагностики хеликобактерной инфекции позволит значительно повысить эффективность антихеликобактерной терапии и сократить затраты на лечение.
Цель и задачи исследования.
Цель работы: усовершенствование комплекса молекулярно-биологических методов детекции, внутривидового типирования Н. pylori, основанных на принципе полимеразной цепной реакции, разработка полуколичественного варианта полимеразной цепной реакции для оценки эффективности антихеликобактерной терапии.
Задачи исследования:
Подобрать оптимальное материально-техническое обеспечение для детекции Н. pylori методом полимеразной цепной реакции. Адаптировать метод к практическому применению при диагностике хеликобактериоза.
Изучить особенности выявления Н. pylori методом полимеразной цепной реакции в различных биологических материалах: биоптатах слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочном соке, фекалиях.
3. Провести сравнительный анализ результатов детекции Н. pylori,полученных методом полимеразной цепной реакции и традиционными микробиологическими методами диагностики хеликобактерной инфекции.
4. Исследовать распространение Н. pylori у больных с гастродуоденальной патологией в разных возрастных группах.
Разработать полу количественный вариант полимеразной цепной реакции для детекции Н. pylori, позволяющий проводить оценку эффективности антихеликобактерной терапии.
Изучить возможность применения метода полимеразной цепной реакции для выявления факторов патогенности Н. pylori и разработать метод для типирования его изолятов.
Научная новизна работы:
На обширном контингенте больных с различными типами гастродуоденальной патологии установлена высокая степень инфицированности К pylori. Применение современных молекулярно- биологических методов диагностики позволило получить новую, объективную научную информацию о циркуляции Н. pylori.
Предложен полуколичественный вариант полимеразной цепной реакции для оценки эффективности антихеликобактерной терапии, с его использованием проведены исследования по контролю за проведенным лечением.
Разработан метод, основанный на гетеродуплексном анализе фрагмента гена CagA, позволяющий дифференцировать изоляты Н. pylori.
Практическое значение работы:
Предложенный комплекс молекулярно-генетических методов выявления Н. pylori является перспективным для внедрения в практическую медицину. Высокая чувствительность, специфичность, относительная простота и невысокая стоимость метода позволяет широко использовать его как при первичной диагностике хеликобактерной инфекции, так и для оценки эффективности лечения. Использование полимеразной цепной реакции для выявления факторов патогенности Н. pylori и гетеродуплексного анализа дает возможность получить штаммовую характеристику ПЦР-изолятов возбудителя. Полученные данные могут быть использованы в системе эпиднадзора за хеликобактерной инфекцией. Применение предложенного комплекса методов позволит значительно улучшить диагностику инфекции Н. pylori, повысить ее эффективность, проводить своевременную терапию и сократить затраты на лечение.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Алгоритм обследования пациентов с гастродуоденальной патологией, основанный на методе полимеразной цепной реакции, разработанный в данной работе, позволяет выявлять Н. pylori с минимальной инвазивностью и оценивать эффективность антихеликобактерной терапии.
2. Метод полимеразной цепной реакции дает возможность получить более объективные данные о распространении Н. pylori у больных с различными типами гастродуоденальной патологии по сравнению с наиболее распространенными в практике морфологическими методами выявления хеликобактера.
3. Использование молекулярно-генетических методов (полимеразной цепной реакции, гетеродуплексного анализа) позволяет получать информацию о присутствии генов факторов патогенности Н. pylori, о различиях в нуклеотидных последовательностях этих генов, осуществлять эпидемиологический мониторинг за хеликобактериозом.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Н. pylori» (2001); III Российском научном форуме «Гастро-2001» (Санкт-Петербург, 2001); IV Российском научном форуме с международным участием «Гастро-2002» (Санкт-Петербург, 2002); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002); V, VI Нижегородских сессиях молодых ученых. (Н. Новгород, 2000, 2001); заседании Ученого совета и межлабораторных научных конференциях Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной.
Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori
Первые сообщения о выявлении кислототолерантных спиралевидных микроорганизмов из желудка кошек и собак относятся к 70-м годам XX века (Баранская Е.К., 1999). Реальный интерес к этим бактериям был вызван публикациями австралийских ученых Уоррена и Маршалла в журнале "Lancet" (Warren J., Marshall В., 1983). Выделение Campylobacter pyloridis, так исходно был назван микроорганизм, и подтверждение для него постулатов Коха открыли новую эру в понимании гастродуоденальной патологии (Quina М., 1998). К самостоятельному роду Helicobacter был отнесен в 1989 г. на основании данных об особенностях ультраструктуры, биохимического состава, антигенных свойств и генотипических признаков (Мельникова В.А., Арзуманян Н.О., 2000). Первоначально он включал два вида - Н. mustelae и Н. pylori (Определитель бактерий Берджи, 1997). В настоящее время к роду Helicobacter относят 20 видов (Marais A., Monteiro L., Megraud F., 1999). Патогенным для человека является Н. pylori, остальные виды были выделены от целого ряда других теплокровных животных: собак, кошек, макак, хорьков, мышей, гепардов и др. Показана способность этих видов микроорганизмов вызывать хронический гастрит у своих хозяев (Eaton К.А., 1999).
Этиологическая роль Н. pylori при хронических гастритах подтверждена в опытах самозаражения добровольцев. Экспериментальный гастрит у добровольца развился через 7 дней после принятия Н. pylori (109 клеток Н. pylori в 10 мл щелочной пептонной воды) и сохранялся в течение 2 недель. На 10 день диагноз гастрит был подтвержден гистологически (Григорьев Т.Я., Яковенко Э.П., 1996).
Хеликобактер пилорический обладает рядом уникальных морфологических и физиологических свойств. Это мелкие, неспорообразующие, грамотрицательные, оксидазо-каталазоположительные, продуцирующие большое количество уреазы микроаэрофильные бактерии изогнутой, S-образной или слегка спиральной формы. Толщина клетки бактерии 0,5—1,0 мкм, длина 2,5—3,5 мкм. Клетка покрыта гладкой оболочкой, на одном из полюсов имеет 1—6 мономерных жгутиков длиной 5-10 мкм. Жгутики покрыты чехлами и заканчиваются колбовидными утолщениями. У многих штаммов обнаруживаются жгутики, лишенные чехлов. Бактерии лучше всего растут в микроаэрофильных условиях при 37С на средах с добавлением крови, "шоколадном агаре" и других богатых питательными веществами средах (Колумбия-агар, среда Мюллер-Хинтона). На плотной питательной среде через 48-72 часа хеликобактер образует прозрачные мелкие колонии диаметром 1 мм. В жидкой среде рост бактерий не заметен, для культивирования требуется постоянное перемешивание. Н. pylori резистентен к ванкомицину, цефалотину, наликсодовой кислоте (Каргальцева, 1997). Оптимальный состав газовой смеси для Н. pylori: азот -85-87%, кислород - 5%, углекислый газ - 8-10%. В строго анаэробных условиях, как и в обычных аэробных, он не растет. Многие штаммы могут расти в широком диапазоне температур: 33-35С и 40-41С, но не растут при 25-28С. Несмотря на определенную термофильность, большинство штаммов не растет при 42 С. Содержание гуанина и цитозина у Н. pylori составляет 35-37 мол%; по этому признаку он четко дифференцируется от возбудителей кампилобактериозных энтеритов, в ДНК которых содержание гуанина и цитозина обычно составляет 31,2 1,1 мол%. (Чайка Н.А. и соавт., 1988).
При неблагоприятных условиях клетки Н. pylori способны изменять форму и образовывать кокковые структуры (Catrenich СЕ. et al., 1991). Наряду с жизнеспособными и культивируемыми, часто встречаются жизнеспособные, но некультивируемые кокковые формы (Cellini L. et al., 1995).
Спиралевидные и кокковые формы в равной степени обладают инвазивностью и иммуногенностью для макроорганизма. Различия при этом касаются лишь сроков проявления симптомов инфекции. При введении спиралевидных форм манифестация инфекции наблюдалась через 4 недели, а при введении кокковых форм - через 16 недель. Различные конформационные типы неспиралевидных форм Н. pylori имеют особенности метаболизма, повышающие устойчивость микроорганизма к различным воздействиям, в том числе к терапевтическим (Хомерики С.Г., Морозов И.А., 2001).
Как правило, большая часть микробных тел Н. pylori располагается свободно в слое желудочной слизи. Некоторые из них адгезируются к желудочным эпителиоцитам. Адгезия Н. pylori к клеточной мембране вызывает повреждение эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка. Кокковые формы Н. pylori обнаруживаются в непосредственной близости к клеткам с более выраженными морфологическими изменениями, тогда как спиральные формы чаще располагаются возле неизмененных или менее поврежденных клеток (Janas В. et al., 1995). В слизистой оболочке желудка кокковые формы чаще встречаются и в большем количестве наблюдаются у больных раком желудка, нежели при язвенной болезни (Chan W.Y. et al., 1994).
Подготовка клинических проб к проведению ПНР методом кипячения
Методы исследования: Подготовка клинических проб к проведению ПЦР проводили методом кипячения проб, методом хлороформно-фенольной депротеинизации, методом неферментативного лизиса с последующей сорбцией на силикагеле с использованием коммерческих наборов для выделения ДНК из исследуемых образцов «ДНК-сорб А» и «ДНК-сорб Б», выпускаемых Центральным НИИ эпидемиологии МЗ РФ.
Для выделения ДНК из парафинизированных срезов биоптатов слизистой оболочки желудка проводили процедуру депарафинирования срезов.
Для выявления ДНК Н. pylori использовался метод полимеразной цепной реакции. Н. pylori в образцах выявляли методом ПЦР с праймерами к гену 16SpPHK (тест-система «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520», разработка Центрального НИИ эпидемиологии, г. Москва, тест-система «Helicobacter», СП «Ниармедик», г. Москва), и праймерами к гену UreC («Хеликопол II», НПФ «Литех», г. Москва).
Для выявления гена CagA-маркера острова патогенности в геноме Н. pylori использовали ПЦР тест-систему «ДиаГен-Helicobacter» производства фирмы «Лагис» (г. Москва); для выявления гена вакуолизирующего цитотоксина VacA - ПЦР тест-систему «Хеликопол VA», НПФ «Литех».
Учет результатов ПЦР проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с помощью общепринятых стандартных методик.
Для оценки вариабельности генов 16SpPHK и гена CagA Н. pylori использовался метод гетеродуплексного анализа.
Статистическая обработка результатов исследований проводилась с применением программы «STATISTICA» (критерий хи-квадрат) и статистических функций программы EXCEL по стандартным формулам.
Организация работы лаборатории, проведение ПЦР-исследований выполнялись в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР», утвержденных ГК СЭН РФ № 19,52-17, 1995 (Покровский В.В. и соавт., 1995). 1. Поместить биопсийный материал или желудочный сок в 250 мкл тканево-экстрационного буфера (ТЭБ) без протеинкиназы К следующего состава: 50 мМ трис-HCl; рН 8,0; 1 мМ ЭДТА; 0,5% SDS. 2. Нагревать пробы в водяной бане при 100 С в течение 10 мин. 3. Центрифугировать пробы при 2000 об/мин - 5 мин. 4. Перенести супернатант в чистую пробирку типа «Eppendorf» и переосадить спиртом. 5. Высушить осадок и растворить в 100 мкл бидистиллированной воды. Водный раствор используют для проведения ПЦР. 1. Поместить образцы биопсии желудка и желудочного сока в 250 мкл ТЭБ содержащего 150 мкг/мл протеинкиназы К. 2. Инкубировать обработанный биопсийный материал 2 ч при 55 С, после чего центрифугировать пробы при 2000 об/мин - 5 мин. 3. Перенести супернатант в чистую пробирку и переосадить спиртом. 4. Высушить осадок и растворить в 100 мкл бидистиллированной воды. Водный раствор используют для проведения ПЦР. 1. Растворить биоптат в ТЭБе в присутствии протеинкиназы К. 2. Инкубировать обработанный материал при 55С в течение 2-х часов. 3. Добавить к лизату равный объем насыщенного фенола и перемешивать 5 мин. 4. Центрифугировать пробу 3 мин при 5000 об/мин. 5. Отобрать из пробирки верхнюю фазу, добавить к ней равный объем смеси фенол-хлороформ, перемешать, центрифугировать 3 мин при 5000 об/мин. 6. Отобрать верхнюю фазу, добавить к ней равный объем хлороформа, перемешать, центрифугировать при том же режиме. 7. Отобрать верхнюю водную фазу, добавить к ней равный объем водо-насыщенного эфира, перемешать, центрифугировать 3 мин при 5000 об/мин. Удалить верхнюю эфирную фракцию, к нижней водной фазе добавить равный объем эфира. Повторить процедуру 2 раза. 8. Эфирную фракцию удалить. Осадок эфира испарить, выдержав пробу 5 мин при 65С. Добавить 2 объема 96% этилового спирта и 1/10 объема 4М LiCl для осаждения нуклеиновых кислот. 9. После появления тяжей ДНК центрифугировать пробу при 10000 об/мин в течение 10 мин. 10. Осадок 2 раза промыть 75% и один раз 96% спиртом. После каждой промывки центрифугировать 2 мин при 1000 об/мин. 11. Высушить пробы до полного испарения спирта и растворить в 100 мкл бидистиллированной воды. Водный раствор нуклеиновых кислот используется для проведения ПЦР.
Проведение ПЦР-амплификации гена VacA Helicobacter pylori с использованием набора «Хеликопол VA»
1. Приготовить из компонентов набора смесь реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл деионизованной воды, 2,5 мкл реакционной смеси, 0,2 мкл Taq-полимеразы.
2. Тщательно перемешать смесь пипетированием после добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь.
3. Добавить по 20 мкл амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации.
4. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.
5. Внести 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы в соответствующую пробирку под слой масла.
6. Центрифугировать в течение 3-5 сек. при 1500-3000 об/мин при комнатной температуре (+18-25С) на микроцентрифуге-вортексе.
7. Провести амплификацию по следующей программе (для амлификаторов, имеющих режим активного регулирования «Терцик»МС2, «Медимакс»): «горячий старт» - 94 С в течение 60 сек, денатурация - 94 С в течение 30 сек, отжиг праймеров - 50С в течение 30 сек, синтез фрагмента - 72С в течение 30 сек, денатурация - 92С в течение 5 сек, отжиг праймеров - 50С в течение 10 сек, синтез фрагмента - 72С в течение 15 сек. циклов 40 циклов
Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенных прослойкой из парафина. Смешение слоев и превращение их в реакционную смесь происходит только при расплавлении парафина на стадии денатурации, что исключает неспецифический отжиг праймеров на балластных ДНК при начальном прогреве пробирки.
Реакцию проводят в объеме 25 мкл, включая ДНК и без учета Taq-полимеразы.
1. Готовят нижний слой для реакции из расчета: 9 мкл буфера и 1 мкл праймеров с дНТФ. Нанести расплавленный парафин, пробы остудить (должна образоваться парафиновая перегородка). 2. Для приготовления верхнего слоя, не повреждая парафин, в каждую пробирку вносят по 9мкл ГЩР-буфера, 1 мкл раствора MgCl2 и 0,3 мкл Taq-полимеразы. Сверху наслоить 25 мкл минерального масла (1 капля).
3. Подготовленную пробу, содержащую ДНК-мишень, в объеме 5 мкл наносят на стенку пробирки и осаждают в течение 2-3 сек. при 1,5 тыс.об./мин., либо аккуратно вносят под масло в верхний слой. Готовую смесь помещают в амплификатор.
4. Провести амплификацию согласно программе: 40 циклов денатурация ДНК- 95С 10 сек. отжиг праймеров - 65С 10 сек. синтез фрагмента - 72С 10 сек.
1. Из компонентов набора приготовить смесь реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу: буфер - Змкл, дНТФ - 3 мкл, праймеры (sl/s2, ml, m2) - 2 мкл, Taq-полимеразы - 0,2 мкл, дистилированной воды - 16,8 мкл.
2. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.
3. Добавить по 25 мкл амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации, нанести по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.
4. Внести 5 мкл образца из анализируемой пробы в соответствующую пробирку под слой масла. 5. Центрифугировать пробирки в течение 3-5 сек при 1500-3000 об/мин и перенести пробирки в прогретый до температуры 94 С амплификатор.
6. Провести амплификацию по следующей программе: 0/ «горячий старт» 94 С 3 мин 0/ денатурация ДНК 94 С 1 мин 0/ отжиг праймера 52 С 1 мин, циклов 0/ синтез фрагмента 72 С 2 мин., 0/ завершение синтеза 72 С 5 мин.
Адаптация метода ПЦР для целей практической клинической диагностики хеликобактерной инфекции
Исходным этапом данной работы было освоение метода ПЦР-детекции Н. pylori и адаптация его к практическим клиническим исследованиям.
В рамках этой задачи было необходимо максимально упростить, удешевить процедуру исследования, сократить время ее проведения, избежать ложноположительных и ложноотрицательных результатов при выявлении Н. pylori. Для решения проблемы проводили: 1. Подбор оптимального приборного обеспечения, в первую очередь, амплификаторов, позволяющих проводить высокоспецифичный направленный синтез ДНК. 2. Сравнительный анализ различных вариантов подготовки образцов к исследованию (способов выделения ДНК из клинического материала). 3. Апробацию экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем, для выявления Н. pylori и подбор оптимальных температурно-временных режимов проведения амплификации. 4. Внедрение антиконтаминационной защиты ПЦР-исследования, для исключения ложноположительных результатов. 5. Разработку варианта контроля за возможным ингибированием ПЦР.
ПЦР проводится в специальных приборах - программируемых термостатах - амплификаторах (термоциклерах). На сегодняшний день ведущими фирмами, выпускающими оборудование для лабораторной диагностики («Perkin Elmer», «Techno», «Eppendorf», «BioRad») разработаны разнообразные модели этих приборов.
По принципу работы амплификаторы подразделяют на два типа: -модели, у которых процесс амплификации осуществляется по температуре нагревательного блока прибора- матричный тип («Ампли-250», «Gene-Cycler»); - модели с режимом активного регулирования ПЦР, где процесс амплификации проводится с учетом температуры реакционной смеси, которая рассчитывается через определенный алгоритм, как функция от температуры нагревательного элемента («Терцик МС2», «Медимакс»).
За время проведения исследования нами использованы для постановки ПЦР три отечественных модели ДНК-амплификаторов (экспериментальная модель института биофизики РАН, г. Пущино-на-Оке; «Ампли-250» фирмы «Biokom» г. Москва; «Терцик МС2» фирмы «ДНК-технология» г. Москва) и одна зарубежная модель - амплификатор фирмы «Biorad», США.
Наименее удачной моделью оказалась разработка института биофизики РАН. Данный прибор позволяет одновременно амплифицировать до 24 проб в пробирках по 0,5 мл или 12 проб в пробирках по 1,5 мл. Такая «универсальная» конструкция его нагревательного элемента не позволяет достичь нормального контакта любых типов микропробирок, имевшихся в нашем распоряжении с нагревающими стенками, что существенно снижает эффективность синтеза ДНК. Эта модель давала возможность проводить амплификацию чистых препаратов бактериальной ДНК при проверке специфичности тест-систем. При работе с клиническими образцами не удавалось получить интерпретируемую картину (на электрофореграмме наблюдался сплошной светящийся шлейф вместо традиционной картины с отдельными фрагментами ДНК).
Остальные модели обладали приемлемыми рабочими характеристиками и позволяли проводить амплификацию при исследовании клинического материала. Наименее удобен для практического применения амплификатор «Gene-Cycler» фирмы «Biorad», основные его недостатки: малая емкость нагревательного элемента (до 24 проб) и использование для проведения ПЦР микропробирок объемом 0,2 мл, которые существенно дороже (в 2-3 раза) традиционно используемых для проведения ПЦР пробирок объемом 0,5 мл.
«Ампли-250» и «ТерцикМС2» могут быть рекомендованы для работы в бактериологических лабораториях клиник. «ТерцикМС2» имеет ряд преимуществ по сравнению с прибором фирмы «Biokom»: - у него большая вместимость нагревательного элемента (до 40 проб против 36); - имеется возможность варьировать температурно-временные условия реакции, так как нагревательный элемент представлен 4 независимо программируемыми блоками; - «ТерцикМС2» имеет не только автономный режим работы. Он может быть подключен через интерфейс к персональному компьютеру, что позволяет надежно отслеживать процесс реакции как в графическом, так и в цифровом режимах на мониторе; - «ТерцикМС2» обеспечивает проведение ПЦР, как в условиях матричного, так и в условиях активного регулирования процесса. - «ТерцикМС2» имеет компактные размеры и работает бесшумно.
Использование режима активного регулирования позволяет сократить длительность отдельный стадий цикла ПЦР до 10-15 сек и значительно уменьшить общую продолжительность процесса (до 1,5 часов). Все перечисленное выше делает этот прибор вполне конкурентноспособным и наиболее привлекательным для российских исследователей. В нашей работе подавляющая часть экспериментов проведена с использованием амплификаторов - «Терцик МС2».
