Введение к работе
Актуальность проблемы, В настоящее время общеизвестным является тот факт, что гены основного фактора вирулентности холерных вибрионов — холерного токсина (ctxAB) - локализованы в дистальной части коровой области умеренного филаментозного фага СТХф (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996), а ее проксимальная часть представлена генами sph (ген одного из белков кап-сида), сер (core encoded pilin), orfU (open reading frame ofunknown function), ace (accessory cholera enterotoxin) и zot (zonula occludens toxin). Продукты всех этих генов являются составляющими фагового морфогенеза, а по меньшей мере два из них - Zot и Асе - обладают и биологической активностью по отношению к клеткам кишечного эпителия. Механизм действия Zot состоит в разрушении межклеточных плотных контактов (tight junctions, tj), что обеспечивает более свободный доступ других токсинов, в том числе холерогена, к поверхности эу-кариотических клеток (Baudry В., et al., 1992; Fasano A, et al, 1991, 1995; Uzzau S., et al, 1999; Wang W., etal, 2000; Di Pierro M.D., et al, 2001)! Предполагаемый механизм действия Асе заключается в формировании ион-проницаемых пор в клеточной мембране, вследствие чего жидкость с ионами поступает в просвет кишечника, вызывая диарею (Trucksis М., et al, 1993, 1997, 2000). Однако на настоящий момент структура и функции Zot и Асе изучены далеко не достаточно.
Дальнейшие исследования Zot требуют наличия его препаратов. Получение их из штаммов Vibrio cholerae малоэффективно и сопряжено с рядом трудностей. Одним из перспективных решений данной задачи представляется создание штамма E.coli - продуцента Zot с помощью клонирования гена. В отечественной литературе сообщения о клонировании этого гена отсутствуют. Рекомбинантные клоны E.coli являются удобными объектами исследования, поскольку сами не продуцируют каких-либо токсических субстанций, что обеспечивает возможность использования полученных из них неочищенных экстрактов для изучения биологической активности Zot, которое, в свою очередь, ограничивается отсутствием доступных моделей, отражающих его действие на эукариотические клетки. Не являясь собственно диареегенным фактором, он не поддается непосредственному выявлению в опытах in vivo. Данные, опубликованные зарубежными авторами, получены в основном с использованием камер Юссинга. Поэтому другая актуальная задача состоит в подборе адекватной биологической модели для тестирования Zot in vitro.
В первые годы после обнаружения фага СТХф его коровая область считалась неделимой генетической единицей (Sears C.L., Kaper J.D., 1996). В дальнейшем было установлено существование предшественника СТХф (рге-СТХф), содержащего все гены коровой области, кроме ctxAB (Boyd E.F. et al., 2000), которые могли быть приобретены им позже вместе с активаторами их транскрипции. В пользу такой гипотезы свидетельствуют существенные отли-рос. :;л:і::опальная
r.>:::v.HOTCKA
'3
С.ИскрС)рг О» 2Гм^акт :
чия содержания ГЦ в генах ctxA и ctxB от такового всех остальных генов коровой облает» СТХф.
На сегодняшний день достоверно идентифицированы рге-СТХф, интегрированные в геном всего 4-х штаммов холерных вибрионов, относящихся к 0 1, 011, 037 и 0139 серогруппам (Boyd E.F. et al, 2000). Данные о распространении таких штаммов, наборах продуцируемых ими токсинов и возможной этиологической опасности в литературе отсутствуют. В нашем распоряжении имеется коллекция из 20 ctxAB'ace zot RS энтеропатогенных штаммов холерных вибрионов 01 и не01/не0139 групп (17 от больных ОКЗ и 3 - из внешней среды), выделенных в России, Крыму и Узбекистане (Монахова Е.В. с соавт., 2001). Вероятно, вызванный ими диарейный синдром был. обусловлен дополнительными токсинами, действие которых могло усиливаться присутствием Zot. Детальное изучение этих штаммов представляет интерес с точки зрения оценки их значимости как этиологических агентов неэпидемической холеры.
Цель работы: конструирование рекомбинантных плазмид и создание штамма E.coli - продуцента zonula occludens toxin V.cholerae для изучения свойств и биологического действия этого токсина.
Задачи исследования: 1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов zot и асе и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков.
-
Клонирование гена zot в составе рекомбинантных плазмид и создание штам-мон E.coli - продуцентов zonula occludens toxin холерных вибрионов.
-
Изучение экспрессии клонированного гена zot и подбор адекватных моделей для оценки биологического действия Zot in vitro.
-
Генотипическая и фенотипическая характеристика ctx'ace+zot+ штаммов холерных вибрионов, выделенных на территориях бывшего СССР, изучение их геномного полиморфизма и вирулентности in vivo и in vitro.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые проведен детальный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов zot и асе и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков, в том числе входящих в состав неполных профагов СТХф (рге-СТХф). Получены новые данные о свойствах Zot и Асе, которые создали теоретическую основу для выявления их наиболее вероятных функций как в морфогенезе СТХф, так и в вирулентности холерных вибрионов.
Впервые проведена подробная генетическая характеристика группы штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент. Методами молекулярной гибридизации и ПЦР определены наборы генетических детерминант дополнительных токсинов и других факторов вирулентности. С помощью блот-гибридизации впервые получена новая информация об изменчивости неполного СТХ-элемента, выявлены молекулярные типы этиологически опасных клонов, один из которых вызвал локальную вспышку ОКЗ в Узбекистане. Показано, что интегрированные в их геном ctxAB-профаги действительно являются производными рге-СТХф По результатам изучения вирулентности штаммов, содержащих
рге-СТХф, in vivo и in vitro они охарактеризованы как этиологически опасные, способные вызывать не только спорадические случаи заболеваний, но и локальные вспышки.
Научно-практическая ценность работы. Созданы штаммы кишечной палочки - продуценты рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген zot под контролем собственного промотора и lac-промотора, а также рекомби-нантный штамм E.coli, одновременно экспрессирующий клонированные гены zot и асе. Штаммы депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» под номерами КМ 171, КМ 172 и КМ 173.
Сконструированы новые праймеры и молекулярные зонды для проведения скрининга свежевыделенных культур на присутствие генов zot и асе. Полученные данные включены в методические рекомендации «Определение генов zot и асе у Vibrio cholerae с помощью полимеразной цепной реакции», одобренные Ученым советом (протокол №5 от 16 апреля 2004 года) и утвержденные директором Ростовского НИПЧИ.
Показана возможность использования культур клеток СаСо2, McCoy и L-929 для выявления биологической активности препаратов Zot in vitro, а также летальное действие Асе на культуру СаСо2.
Положения, выносимые на защиту 1. С помощью компьютерного анализа генов zot и асе и кодируемых ими продуктов получены новые данные о свойствах и функциях этих белков. Расширены представления возможных о механизмах их участия в фаговом морфогенезе и реализации биологического действия на клетки макроорганизма.
-
Клонирование ПЦР-амплификатов гена zot в E.coli позволило получить рекомбинантные плазмиды с заданными свойствами. Содержащие их штаммы кишечной палочки экспрессирровали клонированный ien под контролем собственного промотора и lac-промотора. Штамм, содержащий zot и асе, одновременно экспрессировал оба клонированных гена.
-
Препарат Zot, выделенный из рекомбинантного штамма E.coli, несмотря на отсутствие процессинга в клетках неспицифического хозяина сохранял биологическую активность по отношению к клеткам СаСо2, McCoy и L-929, которые представляли адекватную модель для тестирования токсина.
-
Генотипическая и фенотипическая характеристика 20 штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент, свидетельствует о том, что, несмотря на отсутствие генов холерного токсина, эти штаммы обладают вирулентностью за счет экспрессии других факторов. С помощью блот-гибридизации выявлено по меньшей мере 6 этиологически опасных клонов.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института в 2001-2002 гг., на заседании проблемной комиссии по холере в 2002 г., на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003. План диссертационной работы утвержден Ученым советом РНИПЧИ 14.10.2003. Исследования выполнены в рамках плановой научной темы «Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия дополнительных токсинов (Zot и Асе) кассеты вирулентности холерных вибрионов» (№ госрегистрации 033-4-03).
Публикация результатов исследований. Материалы исследования отражены в 8 опубликованных работах.
Структура работы. Диссертация изложена на 151 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 46 работ отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 26 рисунками.
