Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae Писанов Руслан Вячеславович

Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae
<
Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Писанов Руслан Вячеславович. Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.07 : Ростов н/Д, 2004 151 c. РГБ ОД, 61:04-3/1484

Введение к работе

Актуальность проблемы, В настоящее время общеизвестным является тот факт, что гены основного фактора вирулентности холерных вибрионов — холерного токсина (ctxAB) - локализованы в дистальной части коровой области умеренного филаментозного фага СТХф (Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996), а ее проксимальная часть представлена генами sph (ген одного из белков кап-сида), сер (core encoded pilin), orfU (open reading frame ofunknown function), ace (accessory cholera enterotoxin) и zot (zonula occludens toxin). Продукты всех этих генов являются составляющими фагового морфогенеза, а по меньшей мере два из них - Zot и Асе - обладают и биологической активностью по отношению к клеткам кишечного эпителия. Механизм действия Zot состоит в разрушении межклеточных плотных контактов (tight junctions, tj), что обеспечивает более свободный доступ других токсинов, в том числе холерогена, к поверхности эу-кариотических клеток (Baudry В., et al., 1992; Fasano A, et al, 1991, 1995; Uzzau S., et al, 1999; Wang W., etal, 2000; Di Pierro M.D., et al, 2001)! Предполагаемый механизм действия Асе заключается в формировании ион-проницаемых пор в клеточной мембране, вследствие чего жидкость с ионами поступает в просвет кишечника, вызывая диарею (Trucksis М., et al, 1993, 1997, 2000). Однако на настоящий момент структура и функции Zot и Асе изучены далеко не достаточно.

Дальнейшие исследования Zot требуют наличия его препаратов. Получение их из штаммов Vibrio cholerae малоэффективно и сопряжено с рядом трудностей. Одним из перспективных решений данной задачи представляется создание штамма E.coli - продуцента Zot с помощью клонирования гена. В отечественной литературе сообщения о клонировании этого гена отсутствуют. Рекомбинантные клоны E.coli являются удобными объектами исследования, поскольку сами не продуцируют каких-либо токсических субстанций, что обеспечивает возможность использования полученных из них неочищенных экстрактов для изучения биологической активности Zot, которое, в свою очередь, ограничивается отсутствием доступных моделей, отражающих его действие на эукариотические клетки. Не являясь собственно диареегенным фактором, он не поддается непосредственному выявлению в опытах in vivo. Данные, опубликованные зарубежными авторами, получены в основном с использованием камер Юссинга. Поэтому другая актуальная задача состоит в подборе адекватной биологической модели для тестирования Zot in vitro.

В первые годы после обнаружения фага СТХф его коровая область считалась неделимой генетической единицей (Sears C.L., Kaper J.D., 1996). В дальнейшем было установлено существование предшественника СТХф (рге-СТХф), содержащего все гены коровой области, кроме ctxAB (Boyd E.F. et al., 2000), которые могли быть приобретены им позже вместе с активаторами их транскрипции. В пользу такой гипотезы свидетельствуют существенные отли-рос. :;л:і::опальная

r.>:::v.HOTCKA

'3

С.ИскрС)рг О» 2Гм^акт :

чия содержания ГЦ в генах ctxA и ctxB от такового всех остальных генов коровой облает» СТХф.

На сегодняшний день достоверно идентифицированы рге-СТХф, интегрированные в геном всего 4-х штаммов холерных вибрионов, относящихся к 0 1, 011, 037 и 0139 серогруппам (Boyd E.F. et al, 2000). Данные о распространении таких штаммов, наборах продуцируемых ими токсинов и возможной этиологической опасности в литературе отсутствуют. В нашем распоряжении имеется коллекция из 20 ctxAB'ace zot RS энтеропатогенных штаммов холерных вибрионов 01 и не01/не0139 групп (17 от больных ОКЗ и 3 - из внешней среды), выделенных в России, Крыму и Узбекистане (Монахова Е.В. с соавт., 2001). Вероятно, вызванный ими диарейный синдром был. обусловлен дополнительными токсинами, действие которых могло усиливаться присутствием Zot. Детальное изучение этих штаммов представляет интерес с точки зрения оценки их значимости как этиологических агентов неэпидемической холеры.

Цель работы: конструирование рекомбинантных плазмид и создание штамма E.coli - продуцента zonula occludens toxin V.cholerae для изучения свойств и биологического действия этого токсина.

Задачи исследования: 1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов zot и асе и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков.

  1. Клонирование гена zot в составе рекомбинантных плазмид и создание штам-мон E.coli - продуцентов zonula occludens toxin холерных вибрионов.

  2. Изучение экспрессии клонированного гена zot и подбор адекватных моделей для оценки биологического действия Zot in vitro.

  3. Генотипическая и фенотипическая характеристика ctx'ace+zot+ штаммов холерных вибрионов, выделенных на территориях бывшего СССР, изучение их геномного полиморфизма и вирулентности in vivo и in vitro.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые проведен детальный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов zot и асе и аминокислотных последовательностей кодируемых ими белков, в том числе входящих в состав неполных профагов СТХф (рге-СТХф). Получены новые данные о свойствах Zot и Асе, которые создали теоретическую основу для выявления их наиболее вероятных функций как в морфогенезе СТХф, так и в вирулентности холерных вибрионов.

Впервые проведена подробная генетическая характеристика группы штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент. Методами молекулярной гибридизации и ПЦР определены наборы генетических детерминант дополнительных токсинов и других факторов вирулентности. С помощью блот-гибридизации впервые получена новая информация об изменчивости неполного СТХ-элемента, выявлены молекулярные типы этиологически опасных клонов, один из которых вызвал локальную вспышку ОКЗ в Узбекистане. Показано, что интегрированные в их геном ctxAB-профаги действительно являются производными рге-СТХф По результатам изучения вирулентности штаммов, содержащих

рге-СТХф, in vivo и in vitro они охарактеризованы как этиологически опасные, способные вызывать не только спорадические случаи заболеваний, но и локальные вспышки.

Научно-практическая ценность работы. Созданы штаммы кишечной палочки - продуценты рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген zot под контролем собственного промотора и lac-промотора, а также рекомби-нантный штамм E.coli, одновременно экспрессирующий клонированные гены zot и асе. Штаммы депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» под номерами КМ 171, КМ 172 и КМ 173.

Сконструированы новые праймеры и молекулярные зонды для проведения скрининга свежевыделенных культур на присутствие генов zot и асе. Полученные данные включены в методические рекомендации «Определение генов zot и асе у Vibrio cholerae с помощью полимеразной цепной реакции», одобренные Ученым советом (протокол №5 от 16 апреля 2004 года) и утвержденные директором Ростовского НИПЧИ.

Показана возможность использования культур клеток СаСо2, McCoy и L-929 для выявления биологической активности препаратов Zot in vitro, а также летальное действие Асе на культуру СаСо2.

Положения, выносимые на защиту 1. С помощью компьютерного анализа генов zot и асе и кодируемых ими продуктов получены новые данные о свойствах и функциях этих белков. Расширены представления возможных о механизмах их участия в фаговом морфогенезе и реализации биологического действия на клетки макроорганизма.

  1. Клонирование ПЦР-амплификатов гена zot в E.coli позволило получить рекомбинантные плазмиды с заданными свойствами. Содержащие их штаммы кишечной палочки экспрессирровали клонированный ien под контролем собственного промотора и lac-промотора. Штамм, содержащий zot и асе, одновременно экспрессировал оба клонированных гена.

  2. Препарат Zot, выделенный из рекомбинантного штамма E.coli, несмотря на отсутствие процессинга в клетках неспицифического хозяина сохранял биологическую активность по отношению к клеткам СаСо2, McCoy и L-929, которые представляли адекватную модель для тестирования токсина.

  3. Генотипическая и фенотипическая характеристика 20 штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный СТХ-элемент, свидетельствует о том, что, несмотря на отсутствие генов холерного токсина, эти штаммы обладают вирулентностью за счет экспрессии других факторов. С помощью блот-гибридизации выявлено по меньшей мере 6 этиологически опасных клонов.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института в 2001-2002 гг., на заседании проблемной комиссии по холере в 2002 г., на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003. План диссертационной работы утвержден Ученым советом РНИПЧИ 14.10.2003. Исследования выполнены в рамках плановой научной темы «Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия дополнительных токсинов (Zot и Асе) кассеты вирулентности холерных вибрионов» (№ госрегистрации 033-4-03).

Публикация результатов исследований. Материалы исследования отражены в 8 опубликованных работах.

Структура работы. Диссертация изложена на 151 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 46 работ отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 26 рисунками.

Похожие диссертации на Конструирование штамма Esherichia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio cholerae