Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности Заднова Светлана Петровна

Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности
<
Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Заднова Светлана Петровна. Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности : диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.07, 03.00.04 / Заднова Светлана Петровна; [Место защиты: Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб" МЗ РФ].- Саратов, 2009.- 238 с.: ил. РГБ ОД, 71 10-3/51

Введение к работе

Актуальность проблемы. Распространение холеры в странах Азии, Африки и Латинской Америки свидетельствует о том, что эта инфекция по-прежнему остается угрозой для многих стран, включая и Российскую Федерацию (Онищенко с соавт., 2005; Кутырев, 2008; Ломов с соавт., 2008). Важным и перспективным направлением в решении проблемы холеры является изучение генетических основ изменчивости вирулентных свойств возбудителя. О большой вариабельности генома этого патогена свидетельствует тот факт, что в процессе эволюции сформировано три эпидемически опасных варианта Vibrio cholerae: О1 серогруппы классического биовара, О1 серогруппы эльтор биовара и О139 серогруппы (Бароян, 1971; Ломов, 2004; Смирнова, Кутырев, 2004; Finkelstein, 1973; Kaper et al., 1995; Matson et al., 2007).

Очевидная необходимость проведения исследований по проблеме изменчивости V. cholerae определяется и тем, что в связи с изменяющимися экологическими условиями постоянно растет частота выделения природных атипичных штаммов возбудителя холеры. Особый интерес вызывает процесс образования природных штаммов с повышенной вирулентностью (Смирнова с соавт., 2008; Albert et al., 1993; Sharma et al., 1997; Davis et al., 1999; Nair et al., 2002, 2006; Faruque et al., 2003, 2007; Safa et al., 2005, 2008; Raychoudhuri et al., 2009). Структурно-функциональный анализ таких изолятов может обеспечить получение фундаментальных знаний о новых механизмах формирования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Более того, на их основе возможен поиск новых способов генодиагностики природных штаммов с измененной вирулентностью для осуществления адекватного мониторинга внешней среды с целью прогнозирования эпидемических ситуаций.

Поскольку возбудитель холеры может существовать как в инфицированном макроорганизме (человек), так и в природных экосистемах, то другая важная проблема состоит в изучении взаимосвязи между синтезом факторов вирулентности и персистенции V. cholerae, так как этот вопрос остается малоизученным. Так, в последние годы интенсивно изучается механизм обратимых фазовых вариаций, которые выражаются в переключении биосинтеза экзополисахарида или EPS (от англ. – exopolysaccharide), обеспечивающего выживаемость клеток во внешней среде в составе биопленки (Yildiz et al., 2001; Ali et al., 2002). При этом у клонов, продуцирующих экзополисахарид, снижается уровень биосинтеза ряда факторов патогенности (Yildiz et al., 2004). Вместе с тем единичные сообщения на эту тему не дают полного представления об изменении экспрессии генов вирулентности при адаптации возбудителя холеры к меняющимся условиям окружающей среды. Отсутствуют данные о сигналах внешней среды, приводящие к репрессии факторов патогенности при росте клеток в неблагоприятных условиях. Остается неясным, при каких условиях окружающей среды осуществляется переключение экспрессии генов патогенности V. cholerae, определяющее появление у возбудителя вирулентных свойств. Между тем выявление факторов внешней среды, обеспечивающих индукцию экспрессии факторов вирулентности в природных популяциях, может внести существенный вклад в повышение эффективности мониторинга внешней среды.

Еще одной не менее важной является проблема экспрессии резидентных генов патогенности в бактериальных клетках, получивших дополнительный генетический материал (различные плазмиды, транспозоны, бактериофаги). До недавнего времени считалось, что рекомбинантные плазмиды с клонированными генами различных факторов патогенности при введении их в клетки реципиентных штаммов определяют повышенный уровень продукции белков, биосинтез которых кодируется этим дополнительным генетическим материалом. Проведение интенсивных исследований в этом направлении привело к созданию штаммов-продуцентов холерного токсина и его В-субъединицы (Янишевский, 1986; Ильина с соавт., 1987; Филькова с соавт., 1988; Смирнова, 1989; Чеховская, Смирнова, 1994; Захарова, 1997; Ерошенко, 2004; Faruque et al., 2000). В тоже время сведения об изменении экспрессии хромосомных генов, определяющих продукцию других факторов патогенности в клетках, содержащих плазмидный геном, практически отсутствуют. Геномный и протеомный анализ таких штаммов будет основой для понимания ранее неизвестных путей регуляции экспрессии важнейших генов патогенности в новом генетическом окружении. Полученные фундаментальные знания открывают новые подходы для создания штаммов с повышенной продукцией одновременно нескольких протективных антигенов. Такие штаммы могут быть использованы для изготовления современных диагностических и профилактических препаратов.

Цель работы – молекулярно-генетический и биохимический анализ природных и генетически модифицированных штаммов V. cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности и создание на их основе штаммов-продуцентов основных протективных антигенов.

Задачи исследования:

  1. Изучить популяционный состав природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров для выявления фенотипических вариантов с координировано измененным уровнем продукции факторов патогенности и персистенции. Создать коллекцию изогенных штаммов с разным уровнем экспрессии ключевых генов вирулентности.

  2. Провести сравнительный анализ фено- и генотипических свойств двух типов изогенных вариантов природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров, различающихся по продукции экзополисахарида (EPS), холерного токсина (Тох), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар) и подвижности (Mot). Выделить, очисть и изучить моносахаридный состав экзополисахарида модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара.

  3. Провести сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов (EPS++Тох+Нар++Mot++ и EPS+Тох++Нар+Mot+) модельного штамма V. cholerae Дакка 35. Выяснить роль отдельных белков и экзополисахарида в адаптации клеток к неблагоприятным условиям окружающей среды.

  4. Выявить факторы внешней среды, вызывающие координированное переключение экспрессии различных генов вирулентности и персистенции в клетках V. cholerae классического биовара.

  5. Изучить влияние рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 на экспрессию хромосомных генов V. cholerae классического биовара, включая ключевые гены вирулентности и иммуногенности.

  6. Сравнить протеомные профили исходного и содержащего рекомбинантную плазмиду рСТ105::mini-kan модельного штамма V. cholerae классического биовара с целью выявления различий в содержании белков, являющихся факторами патогенности или определяющими жизнеспособность клеток.

  7. Сконструировать содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с повышенной продукцией одновременно трех основных антигенов, обладающих протективными свойствами – холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и О1 антигена. Определить оптимальные условия их глубинного культивирования для получения этих антигенов.

  8. Создать экспериментальную многокомпонентную иммуноферментную диагностическую тест-систему для выяснения антигенного состава химических вакцин и оценки экспрессии основных генов патогенности у природных штаммов V. cholerae О1 серогруппы. Определить ее специфичность, эффективность и диагностическую ценность.

Научная новизна исследования:

Впервые при изучении популяционного состава природных штаммов холерного вибриона эльтор и классического биоваров выявлены штаммы, имеющие в популяции два типа клонов, различающихся одновременно несколькими фенотипическими свойствами: морфологией колоний, продукцией холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижностью. Впервые установлено, что экспрессия генов, определяющих разные фенотипы клеток, имеет координированный характер. Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнаружен экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний и содержащий рамнозу, глюкозу, галактозу и гексозамин. Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток при действии осмотического и оксидативного стрессов.

При проведении сравнительного протеомного анализа двух фенотипически разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 впервые выявлено изменение содержания в клетках ферментов и белков внешней мембраны, играющих важную роль в их метаболизме и выполняющих защитную функцию. Показано, что смена популяционного состава штамма по фенотипу либо повышает его устойчивость к воздействиям повреждающих факторов внешней среды, либо усиливает вирулентность.

Впервые выявлено, что одним из главных факторов, стимулирующих координированное переключение экспрессии генов экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности в штаммах холерного вибриона классического биовара, является щелочная (рН 9,0) реакция среды.

На основании сравнительного анализа протеомов впервые обнаружено, что введение в клетки штаммов V. cholerae классического биовара рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности CTX и RS1, приводит к изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих белки, участвующие в патогенезе, транспорте, энергетическом и метаболическом обменах, входящих в состав внешней мембраны. В результате проведенных исследований впервые выявлена панель белков, кодируемых хромосомными генами (ctxAB, tcpA-F, ompU, hapA), повышение содержания которых характерно для штаммов, содержащих рекомбинантную плазмиду. Впервые установлено, что в присутствии указанной плазмиды в клетках токсигенных штаммов классических вибрионов увеличение экспрессии хромосомных генов tcpA-F и ompU происходит за счет усиления активности глобального регуляторного гена toxR.

Впервые получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара сероваров Инаба (2415 и КМ207) и Огава (2414 и КМ206), отличающиеся от штаммов, используемых в производстве таблетированной холерной химической вакцины «холероген-анатоксин+О-антиген» (569В Инаба и М41 Огава), повышенной продукцией одновременно трех протективных антигенов – холерного токсина или СТ (от англ. – cholera toxin), токсин-корегулируемых пилей адгезии или ТСР (от англ. – toxin-coregulated pilus) и О1 антигена. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена получением 4-х патентов РФ на изобретения: № 2169187 (приоритет от 26.04.2000 г.) «Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава – продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2193598 (приоритет от 26.07.2001 г.) «Штамм бактерий Vibrio сholerae KM200-продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2222595 (приоритет от 15.07.2002 г.) «Штамм бактерий Vibrio сholerae KM206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов»; № 2222594 (приоритет от 15.07.2002 г.) «Штамм бактерий Vibrio сholerae KM207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов».

Выявлены особенности экспрессии генов, кодирующих указанные протективные антигены, при глубинном культивировании штаммов-продуцентов. Определены оптимальные условия продукции ими протективных антигенов и экспериментально доказана целесообразность использования сконструированных штаммов для получения указанных белков и липополисахаридов в условиях производства. Приоритетность работы по получению очищенных протективных антигенов подтверждена патентом РФ № 2324740 (приоритет от 11.07.2006 г.) на способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара.

Впервые создана эффективная и специфичная экспериментальная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система, включающая четыре очищенных протективных антигена (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, О1 антиген Инаба, О1 антиген Огава) и четыре поликлональные антисыворотки к ним, позволяющая оценивать экспрессию основных генов патогенности в природных штаммах V. cholerae О1 серогруппы для уточнения их эпидемической значимости.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонировано 16 штаммов V. cholerae классического биовара сероваров Огава и Инаба, из которых 6 - продуценты холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии; 8 штаммов характеризуются координированным переключением экспрессии трех генов (mot, hap, vps), связанных с вирулентностью; 2 штамма - инсерционные мутанты, утратившие способность продуцировать холерный токсин при внедрении транспозона TnphoA (Kmr) в бактериальный геном.

Результаты исследований использованы в следующих документах:

- Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней». Под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко, чл-корр. РАМН, профессора В.В. Кутырева. – М: ОАО Издательство «Медицина», Издательство «Шико», 2009.

- Методические указания МУК 4.2.2218—07 «Лабораторная диагностика холеры», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 мая 2007 г. и введенные в действие с 1 августа 2007 г. взамен методических указаний «Лабораторная диагностика холеры» МУ 4.2.1097—02.

- Методические рекомендации «Создание штаммов холерного вибриона классического биовара – продуцентов протективных антигенов», одобренные Ученым Советом (протокол № 4 от 13.04.2004 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (14.04.2004 г.).

- Методические рекомендации «Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов патогенности и персистенции», одобренные Ученым Советом (протокол № 7 от 27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

- Методические рекомендации «Выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU холерного вибриона классического биовара», одобренные Ученым Советом (протокол № 7 от 27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

Сконструированные содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы-продуценты одновременно трех основных протективных антигенов холерного вибриона (В-субъединицы в составе холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, О1 антигена серовара Огава или О1 антигена серовара Инаба) используются в научных и производственных лабораториях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при проведении молекулярно-генетических исследований по изучению механизмов регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона и при получении очищенных ключевых протективных антигенов.

Материалы диссертации включены в курс лекций по современной микробиологии холеры на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Популяция ряда природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров содержит два типа клонов, различающихся по морфологии колоний (прозрачные и мутные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Изменение морфологии колоний изогенных вариантов V. cholerae обоих биоваров связано с продукцией клетками экзополисахаридного слоя. Продуцирующие экзополисахарид холерные вибрионы эльтор биовара (EPS++) отличаются от изогенных (EPS+) вариантов меньшей подвижностью, повышенным уровнем биосинтеза холерного токсина, но сниженной продукцией растворимой гемагглютинин/протеазы. Для классических холерных вибрионов характерна обратная связь между экспрессией названных факторов вирулентности.

2. Присутствующий на поверхности клеток модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара экзополисахаридный слой содержит рамнозу, глюкозу, галактозу и гексозамин. Экзополисахарид повышает устойчивость клеток к действию осмотического и оксидативного стресса.

3. Два фенотипически разных варианта модельного штамма V. cholerae Дакка 35 имеют разные протеомы. Среди 841 выявленного белка идентифицировано 57 белков с повышенным или пониженным содержанием в клетках. В клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для клеток EPS+Тох++Нар+Mot+ характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

4. Щелочная (рН 9,0) реакция среды является сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение экспрессии генов экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности. Переключение активности этих генов приводит к изменению вирулентности популяции и её резистентности к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

5. Геном рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности CTX и RS1, при введении его в клетки V. cholerae cholerae, согласно данным сравнительного протеомного анализа, изменяет экспрессию различных хромосомных генов, включая гены, кодирующие белки, являющиеся важными факторами патогенности и иммуногенности (ТСР и OmpU), и участвующими в энергетическом обмене, процессах метаболизма, цитокинезиса, транспорта, входящих в состав внешней мембраны.

6. Получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых протективных антигенов – холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и О1 антигена. Определены оптимальные параметры их выращивания для получения протективных антигенов в полупроизводственных условиях.

7. Создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, состоящая из 4-х очищенных протективных антигенов холерного вибриона (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, О1 антиген Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Указанная тест-система перспективна при оценки экспрессии основных генов патогенности у природных штаммов V. cholerae О1 серогруппы.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на интернациональном симпозиуме «Биомедицинская оптика» (Сан-Хосе, США, 1999), ХIХ Российской конференции по электронной микроскопии «ЭМ2002» (Черноголовка, 2002), 8 Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003), III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), ХIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств – участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), а также на совещаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2005-2007) и ежегодных научных конференциях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 1999-2009).

Публикации по теме исследования.

По теме диссертации опубликовано 47 научных работ, из них 22 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 4 статьи в зарубежных изданиях, 5 патентов на изобретения, 10 тезисов в сборниках международных и Российских конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 239 листах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 514 ссылок, из них 413 зарубежных и 101 отечественных авторов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 45 рисунками.

Похожие диссертации на Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности