Содержание к диссертации
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16
1. Диморфизм: структурные и метаболические особенности, связанные с морфогенезом мукоровых грибов
1.1. Грибы р. Мисог (краткая характеристика) 16
1.2. Особенности морфогенеза мукоровых грибов 17
1.3. Особенности состава и строения клеточной стенки разных морфологических типов клеток
1.4. Факторы внешней среды, оказывающие влияние на морфогенез
1.5. Особенности метаболизма, связанные с морфогенезом 22
1.5.1. Энергетический метаболизм 22
1.5.2. Азотный метаболизм 23
1.6. Регуляторные факторы диморфизма (эндогенные регуляторы)
1.6.2. Полиамины 26
1.6.3. S-аденозилметионин 27
1.7. Пути передачи сигнала и диморфизм 28
1.8. Особенности биосинтеза белка и РНК, связанные с морфогенезом
2. Липиды в морфогенетических процессах у мицелиальных грибов 33
2.1. Краткая характеристика липидов: функции, биосинтез, регуляция
2.2. Особенности липидного метаболизма, связанные с морфогенезом и диморфизмом
2.2.1. Липиды дрожжеподобных клеток и мицелия 36
2.2.2. Ингибирование биосинтеза липидов
2.3. Роль липидов в передаче сигнала (липиды как сигнальные 40 молекулы)
2.4. Роль стеринов в морфогенезе и диморфизме
2.4.1. Функции стеринов 45
2.4.2. Биосинтез эргостерина 45
2.4.3. Транспорт эргостерина 48
2.4.4. Ингибирование биосинтеза стеринов 49
2.4.5. Влияние стеринов на состав и строение клеточной стенки и морфологию грибов
2.4.6. Структурная и регуляторная функция эргостерина 57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
РЕЗУЛЬТАТЫ 72
1. Липиды как фактор адаптации мицелиальных грибов к стрессовым условиям среды (Влияние физиологических факторов и ингибиторов
на рост и липидообразование мицелиальных грибов)
1.1. Липидообразование в условиях задержки роста Fusarium solani и Mucor circinelloid.es var. lusitanicus полиеновым антибиотиком нистатином
1.2. Липиды мицелиальных грибов в адаптации к условиям гипотермии
1.2.1. Влияние температуры культивирования на рост и состав липидов М. circinelloides var. lusitanicus F-306D
1.2.2. Влияние температуры культивирования на рост и 91 состав липидов F. solani F-142
1.3. Липиды морфологических мутантов F. solani F-142 в условиях роста в присутствии этанола
1.4. Особенности метаболической активности и состава липидов М. circinelloides var. lusitanicus F-306D в условиях влияния режима азотного питания
1.4.1. Рост и липогенез гриба М. circinelloides var. lusitanicus F-306D при различных концентрациях источника азота и способах его введения
1.4.2. Активность ферментов ЦТК и глиоксилатного циклау М. circinelloides var. lusitanicus F-306D в зависимости от режима азотного питания
1.4.3. Состав липидов субклеточных фракций у М circinelloides var. lusitanicus F-306D в зависимости от режима азотного питания
2. Воздействие морфогенных факторов на состав липидов и метаболические процессы у мукоровых грибов
2.1. Метаболическая активность и состав липидов М. circinelloides var. lusitanicus в связи с диморфизмом при высоком содержании глюкозы в среде
2.2. Особенности морфогенеза и состава липидов мукоровых грибов в неблагоприятных условиях
2.2.1. Влияние кислотности среды 128
2.2.2. Морфогенез и липидообразование мукоровых грибов в присутствии хлоранилинов
2.2.2.1. Особенности морфогенеза мукоровых грибов в присутствии хлоранилинов
2.2.2.2. Особенности состава липидов мукоровых грибов в присутствии 4-ХА
3. Диморфизм и состав липидов М. hiemalis F-1156 I55
3.1. Особенности роста М. hiemalis F-1156 157
3.2. Особенности состава липидов артроспор, почкующихся клеток и мицелия М. hiemalis F-1156
3.3. Состав стеринов артроспор и мицелия М. hiemalis F-1156 165
4. Липиды и стерины спорангиоспор в связи с различной способностью мукоровых грибов к диморфизму (Диморфизм мукоровых грибов в зависимости от состава липидов и условий получения спорангиоспор)
4.1. Изменения в составе липидов спорангиоспор в связи с возрастом спорогенной культуры
4.1.1. Состав липидов и жирных кислот спорангиоспор М. 177 hiemalis F-1156
4.1.2. Состав стеринов спорангиоспор М. hiemalis F-1156 185
4.1.3. Состав липидов спорангиоспор М. circinelloides var. 187 lusitanicus 306D
4.1.4. Состав липидов и жирных кислот спорангиоспор М. 192 ramannianus F-530
4.1.5. Состав стеринов спорангиоспор М. ramannianus F- 196 530
4.2. Влияние условий, благоприятных для интенсивного спорогенеза, на жизнеспособность и состав липидов
спорангиоспор М. circinelloides var. lusitanicus 306D
4.3. Влияние экзогенных липидов на морфогенез гриба М. circinelloides var. lusitanicus 306D
5. Синтез биологически активных липидов мукоровыми грибами на средах различного состава (Практическое применение результатов исследования)
5.1. Синтез у-линоленовой кислоты и каротиноидов мукоровыми грибами
5.2. Синтез у-линоленовой кислоты мукоровыми грибами при использовании экзогенных жирных кислот из промывных вод после рафинации растительных масел
5.2.1. Утилизация жиров сточных вод после рафинации растительных масел мукоровыми грибами
5.2.2. Рост и состав липидов М. circinelloides var. lusi- tanicus 306D на среде с различными концентрациями экзогенных жирных кислот из промывных
5.3. Синтез биологически активных липидов на средах, содержащих сельскохозяйственные отходы и отходы пищевых предприятий
5.4. Влияние условий обработки биомассы и способа экстракции на получение липидов, содержащих у-линоленовую кислоту и каротиноиды
ОБСУЖДЕНИЕ 248
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 269
ВЫВОДЫ 273
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 275
Введение к работе
Актуальность проблемы. Липиды грибов, отличающиеся многообразием химической структуры, физических свойств и выполняемых функций, участвуют в поддержании адекватного окружению уровня метаболических процессов, адаптации к изменяющимся условиям среды и в процессах выживания. Роль липидов в жизнедеятельности грибов, морфогенетических процессах и диморфизме определяется их функционированием как структурных и резервных соединений, факторов адаптации и регуляторных соединений [Nozawa, Kasai, 1978; Rao et al., 1985; Noverr et al., 2001, 2003, 2004; Klose et al., 2004; Jeennor et al., 2006].
Проявление диморфизма у грибов сопряжено с существенными изменениями биосинтетических и энергетических процессов и структурно-морфологических характеристик, что имеет адаптивный характер и направлено на поддержание жизнеспособности организма в изменившихся условиях. Диморфизм определяет жизненную стратегию грибов путем образования клеток альтернативных морфотипов, обеспечивающих рост и выживание культуры в различных (в том числе стрессовых) условиях. У грибов, в том числе, представителей пор. Mucorales, диморфизм представлен двумя морфологическими формами - мицелиальной и дрожжеподобной, наиболее существенные различия которых обусловлены структурой и механизмами формирования клеточной стенки, а также характером роста клетки (апикальным или сферическим). Различия в компонентном составе клеточной стенки не являются единственным фактором, определяющим характер морфогенетических процессов и форму клеток. Имеется много работ, посвященных исследованию взаимосвязи липидного обмена с морфогенезом грибов и свидетельствующих о важности липидов как структурных и регуляторных компонентов клетки [Gordon et al., 1971; Nomura et al., 1972; Ohno et al., 1976; Greenspan, Mackow, 1977; Brambl et al., 1978; Daum et al., 1979; Ito et al., 1982; Ghannoum et al., 1986; Sanadi et al., 1987; McLain, Dolan, 1997; Calvo et al., 2001; Klose et al., 2004]. Однако анализ литературы не позволяет сделать определенных выводов о корреляции между липидным составом и морфологическими особенностями клеток и свидетельствует о сложном характере связи липидов с морфогенезом.
В последние годы интерес к изучению роли липидов в диморфизме грибов возрос благодаря тому, что этот феномен оказался связан с широким распространением возбудителей микозов животных и человека и патогенов сельскохозяйственных растений. Мицелиальная и дрожжевая формы диморфных грибов, многие из которых являются патогенными, имеют разную вирулентность [Ghannoum et al., 1986; Kobayashi, Cutler, 1998; Ghormade, Deshpande, 2000; Bahn et al., 2003; Andrews et al., 2004; Ruiz-Herrera et al., 2006]. Известно участие в контроле морфологических переходов (мицелий - дрожжеподобные клетки) не только мембранных фосфолипидов, но и стеринов, а также регуляторных липидов, не выполняющих структурной функции [Ito et al., 1982; Vanden Bossche et al., 1983; Odds, 1985; Odds et al., 1985; Georgopapadakou et al., 1987; Vanden Bossche, 1990; Hube et al., 2001; Klose et al., 2004]. Имеются сведения, что жирные кислоты также могут участвовать в регуляции морфологических переходов у диморфных грибов, связанных с вирулентностью и отношениями хозяин-паразит [Jensen et al. 1992; Тарчевский, Чернов, 2000;Noverr et al., 2001, 2003, 2004].
Мукоровые грибы, являются классической моделью для изучения диморфизма, и хотя в большинстве они не патогенны, отдельные виды в определенных условиях могут вызывать оппортунистические инфекции -мукормикозы разной локализации, при этом патогенной формой гриба является мицелиальная [Josefiak et al. 1958; Baker, 1970; Whiteway et al., 1979; Lehrer, 1980; Prabhu, Patel, 2004; Harada, Lau, 2007]. Очевидно, что в связи с возросшим интересом к исследованию роли липидов в морфогенетических процессах, актуальным является поиск критериев, необходимых для оценки способности грибов к диморфизму. Грибы широко применяются в различных биотехнологических производствах и экологических биотехнологиях [Кузнецов, Градова, 2006], а представители отдельных видов мукоровых грибов являются перспективными продуцентами комплекса биологически активных соединений липидной природы - каротиноидов и у-линоленовой кислоты. Выяснение закономерностей регуляции морфогенетических процессов и диморфизма у мукоровых грибов необходимо для повышения эффективности штаммов-продуцентов и разработки условий, способствующих мелкодисперсному росту при сохранении высоких показателей липогенеза в биотехнологиях получения липидов.
Таким образом, исследования биосинтеза, метаболизма и регуляторных функций липидов у мицелиальных грибов представляют не только теоретический интерес, но и имеют большое значение для современной медицины, ветеринарии и сельского хозяйства, чем определяется актуальность выполненного исследования.
Цель работы - исследовать изменения липидного состава в процессах адаптации к изменениям условий среды и стрессовым воздействиям, определить значимость липидов в морфогенезе и диморфизме грибов и установить биохимические критерии, позволяющие оценивать способность мукоровых грибов к дрожжеподобному росту.
В задачи диссертации входило:
• исследовать изменения состава некоторых классов липидов и жирных кислот мицелиальных грибов при воздействиях стрессовых факторов: полиенового антибиотика нистатина, этанола, а также неоптимальных температур для выявления роли липидов в процессах адаптации к этим неблагоприятным условиям; • исследовать состав липидов и способность мукоровых грибов к диморфизму в аэробных условиях при воздействии морфогенных агентов - хлорированных анилинов и высокой кислотности среды;
• выявить корреляцию между морфологическими изменениями, возникающими в условиях различных режимов азотного и углеродного питания грибов, их метаболической активностью и липидным составом клеток;
• выявить особенности состава липидов дрожжеподобной и мицелиальной форм мукоровых грибов в различных условиях роста;
• исследовать влияние качества спорангиоспор на развитие и морфогенез мукоровых грибов;
• выявить корреляцию между составом структурных и запасных липидов спорангиоспор мукоровых грибов и типами морфологической дифференцировки (дрожжеподобным или мицелиальным);
• исследовать влияние экзогенных липидов различного состава на морфогенез мукоровых грибов.
Научная новизна. В работе использован оригинальный подход к изучению роли липидов в диморфизме грибов, который является новым направлением в изучении взаимосвязи между составом липидов и типом дифференцировки грибных клеток: в сравнительном аспекте исследованы липиды ряда диморфных и мономорфных представителей пор. Mucorales. Морфологические транзиции рассматриваются с позиций биохимической адаптации к стрессовым факторам, что позволило сделать вывод о взаимосвязи реализации определенного морфотипа с составом жирных кислот, мембранных фосфолипидов и стеринов. Установлено, что уровень эргостерина и соотношение метилированных и деметилированных стеринов, непосредственно коррелируют с морфогенезом.
Изучено действие ряда морфогенных агентов и мембранотропных соединений на морфогенез грибов и установлено, что феномен диморфизма распространен шире, чем считалось ранее, и свойствен, помимо диморфных, также видам, ранее относимым к мономорфным, которые способны в стрессовых условиях к дрожжеподобному росту. Впервые получена информация о биосинтезе липидов и их участии в контроле диморфизма при действии на грибы хлорированных анилинов как специфических морфогенных агентов.
Получены новые сведения о функциональной активности грибных липидов. Установлено, что такие резервные липиды как ТАГ и ЭС способны играть защитную роль в стрессовых условиях, а изменения доли полиненасыщенной у-линоленовой кислоты, компонента клеточных мембран, могут рассматриваться как сигнал о стрессе.
Впервые определен состав липидов у различных морфотипов Мисог hiemalis, выявлены особенности состава липидов артроспор, отличающие их от морфологически сходных с ними дрожжеподобных клеток. В составе стеринов артроспор идентифицированы новые редкие соединения - 1-дигидро-дегидронеоэргостерин и дегидронеоэргостерин, продукты трансформации эргостерина, которые могут принимать участие в морфогенетических процессах и служить маркерами различных форм цитодифференцировки гриба.
Получена новая информация о важной роли изменений липидного состава грибов для морфогенетических процессов. Обнаружена взаимосвязь предпочтительного развития определенного морфотипа мукоровых грибов (гифального или дрожжеподобного) с различиями в составе липидов спорангиоспор, использованных в качестве посевного материала; разработаны биохимические критерии оценки способности мукоровых грибов к сферическому (дрожжеподобному) росту.
Практическая значимость. Для оценки жизнеспособности спорангиоспор мукоровых грибов, используемых в качестве инокулята в биотехнологических производствах, и способности спорангиоспор при прорастании давать начало дрожжеподобному росту предложено использовать следующие показатели, основанные на качественных и количественных характеристиках их липидов: (1) высокий уровень ненасыщенных жирных кислот (особенно у-линоленовой) и (2) уровень ДАТ; (3) повышенное отношение ФЭА/ФХ и (4) метилстерины/десметилстерины; (5) низкий уровень ТАГ, (6) пониженное отношение ФЛ/ГЛ и (7) ЭС/ССт в спорангиоспорах.
На основании результатов анализа липидного состава 40 штаммов грибов пор. Mucorales выявлена перспективность использования штаммов М. hiemalis в качестве продуцентов каротиноидов (3.6-8.2 мг/г липидов) и штаммов М. circinelloides как продуцентов комплекса липидов с высоким содержанием у-линоленовой кислоты (до 372.0 мг/л среды) и каротиноидов (до 3 мг/г липидов).
Разработан способ культивирования М. circinelloides var. lusitanicus с высоким выходом липидов и содержанием в них у-линоленовой кислоты (до 40% от суммы жирных кислот), защищенный патентом РФ № 1751212. Состав липидов делает их перспективными для использования в медицинской практике, диетическом питании, косметологии.
Оптимизированы условия выделения липидов из биомассы гриба М. circinelloides var. lusitanicus 306D, обеспечивающие максимальный выход целевого продукта и предусматривающие замену токсичных растворителей (хлороформа и метанола) экологически менее вредными системами (этанолом и гексаном).
Предложены режимы безотходной технологии получения липидов из М. circinelloides var. lusitanicus 306D на основе отходов пищевых предприятий (меласса, кукурузный экстракт, подсолнечное масло, белкозин). Остающаяся после извлечения липидов биомасса, содержащая более 40% белка с практически полным набором незаменимых аминокислот (в том числе лизина), может быть использована в качестве кормовой добавки к рациону сельскохозяйственных животных.
Показано, что мукоровые грибы могут применяться для эффективной доочистки промывных вод маслоперерабатывающих предприятий и получения биологически активных липидов, по содержанию у-линоленовой кислоты (до 15% от суммы жирных кислот) сходных с растительными маслами (примулы вечерней или ослинника; Oenothera biennis L.).
Преимуществами предлагаемых технологий получения грибных липидов являются высокая скорость роста продуцентов, высокое содержание полиненасыщеных жирных кислот в липидах, возможность направленно регулировать процессы роста и липогенеза.
Основные защищаемые положения:
• Липиды мицелиальных грибов участвуют в формировании адаптивных реакций к изменениям условий среды и при воздействии различных стрессовых факторов (полиенового антибиотика нистатина, этанола, гипотермии, изменениям соотношения углерода и азота). Адаптация осуществляется путем регулирования состава жирных кислот, мембранных липидов и основных резервных ацилсодержащих фракций.
• Изменения состава липидов коррелируют с метаболической активностью и морфогенетическими процессами при воздействии морфогенных факторов - высокого содержания глюкозы, закислення среды, хлорированных анилинов, вызывающих реализацию альтернативных программ роста грибов - мицелиального или дрожжеподобного.
• Особенности состава липидов и ЖК у мицелиального и дрожжеподобного морфотипов и артроспор мукоровых грибов, а также соотношения определенных классов липидов могут быть маркерами этих морфотипов.
• Липидные характеристики спорангиоспор мукоровых грибов - уровень ненасыщенных жирных кислот, количества ДАТ, ТАГ, соотношения ФЭА/ФХ, ФЛ/ГЛ, метилстерины/десметилстерины и ЭС/ССт являются показателями жизнеспособности спорангиоспор и потенциальной способности при прорастании давать начало дрожжеподобному росту. • Экзогенное внесение липидов определенного качественного состава, в т.ч. экстрагированных из спорангиоспор различного физиологического возраста, на стадии инокуляции позволяет направленно регулировать развитие гриба в виде желаемого морфотипа.
Апробация работы. Материалы работы были доложены и представлены на конференциях: XVI, XVII, XVIII конференциях молодых ученых МГУ «Проблемы современной биологии» (Москва, 1986-1988), Всероссийской конференции «Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов» (Пущино, 1989), The Tenth International Symposium on Plant Lipids (Held at Jebra, Tunisia, 1992), «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду» (Москва, 1994), Всероссийской конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 1996), III Всероссийском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1996), 21s International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)" (Lviv, Ukraine, 2001), I съезде микологов России (Москва, 2002), I, II, III, IV, V Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003-2007), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003» (Пущино, 2003), Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург, 2005), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006), XV Congress of European Mycologists (St. Petersburg, 2007), II съезде микологов России (Москва, 2008), VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 научная работы, в том числе 28 статей в реферируемых научных журналах, из них 1 обзор, 5 статей в сборниках, 17 тезисов докладов на российских и международных конференциях, 1 патент РФ.
