Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор литературы CLASS 9
1.1. Влияние гербицидов на микрофлору и биохимические процессы в почве 12
1.2. Трансформация и разложение гербицидов 41
1.2.1. Микроорганизмы и некоторые особенности метаболизма гербицидов 42
1.2.2. Особенности формирования микрофлоры и деградация пестицидов в почве 50
1.2.3. Влияние агротехнических мероприятий на микробную деградацию пестицидов в почве 61
2. Материалы и методы исследования 68
2.1. Методика проведения почвенно-микробиологических исследований 68
2.2. Методы изучения симбиотических взаимоотношений клубеньковых бактерий и бобовых растений 77
2.3. Методы изучения деградации гербицидов производных сим-триазинов 82
2.4. Статистическая обработка экспериментального материала 85
3. Закономерности формирования и жизнедеятельности микро флоры в почве, обработанной гербицидами 87
3.1. Методологические основы и разработка практических приемов почвенно-микробиологической оценки пестицидов 88
3.2. Топография распределения микроорганизмов в почве, обработанной гербицидами 102
3.3. Динамика токсического действия гербицидов на микрофлору почвы 105
3.4. Некоторые закономерности поведения индикаторной группы микроорганизмов (мишени) при многолетней систематической обработке почвы гербицидами 123
3.5. Характер и причины изменения почвенно-микробио-логических показателей, устойчивых к токсическому действию гербицидов, в полевых условиях 137
3.6. Многократное использование гербицидов в системе противоэрозионных мероприятий и микрофлора почвы 145
3.7. Последствия многолетнего систематического применения гербицидов в земледелии 162
Заключение 177
Гербициды и симбиотические взаимоотношения клубенько вых бактерий и бобовых растений 180
4.1. Влияние гербицидов на клубеньковые бактерии в условиях чистых культур 189
4.2. Влияние бактерицидных веществ на бобово-ризо-биальный симбиоз 197
4.3. Симбиотические взаимоотношения клубеньковых бактерий с растением люпина при обработке гербицидами хлорпроизводными симметричных триазинов 206
4.4. Влияние гербицидов производных фенокпиалкилкар-боновых кислот на симбиоз клубеньковых бактерий с растением гороха 213
Заключение 231
Микроскопические водоросли как индикаторы фитотоксических веществ 234
5.1. Методика оценки альгицидного эффекта гербицидов в условиях интенсивной культуры микроско пических водорослей 236
5.2. Экспресс-метод оценки фитотоксичности химических соединений с помощью культуры водорослей на бумажных дисках 242
5.S. Микроскриннинг фитотоксических веществ - продуктов искусственного синтеза 24?
5.4. Использование микроскопических водорослей для исследования взаимосвязи между структурой и фитотоксическими свойствами химических соединений 254
5.5. Альгологйческйй анализ фитотоксических свойств продуктов трансформации гербицидов 258
5.6. Альгологйческйй метод определения гербицидов в почве 263
Заключение 273
6. Деградация гербицидов хлорпроизводных сшл-триазинов . 275
6.1. Микроорганизмы, разлагающие гербицид симазин . 277
6.2. Трансформация симазина в культуре A.fumig;atus 283
6.3. Деградация симазина и атразина почвенными водорослями 291
6.4. Разложение симазина автотрофными микроорганизмами 300
6.5. Распределение и деградация симазина и атразина в почве 306
Заключение 330
Обсуждение результатов (Заключение) 332
Выводы 340
Список литературы 344
Приложение 406
- Влияние агротехнических мероприятий на микробную деградацию пестицидов в почве
- Динамика токсического действия гербицидов на микрофлору почвы
- Симбиотические взаимоотношения клубеньковых бактерий с растением люпина при обработке гербицидами хлорпроизводными симметричных триазинов
- Экспресс-метод оценки фитотоксичности химических соединений с помощью культуры водорослей на бумажных дисках
Введение к работе
Актуальность. Успехи современного сельского хозяйства за последние 30-40 лет в значительной степени обусловлены химизацией земледелия. В настоящее время наряду с минеральными удобрениями широко используются химические средства защиты растений - пестициды. Применение последних имело революционизирующее значение в борьбе с вредителями, болезнями и сорной растительностью, что объясняется их высокой агрономической и экономической эффективностью. Суммарный объем производства и применения пестицидов в настоящее время достигает 2 млн.т. Ежегодный прирост применения его в различных странах мира составляет от 6 до 16%. По состоянию на 1980 г. среди химических средств защиты растений 47,4% составляют гербициды, а к 1990 г. доля их возрастет до 56% (Грин и др., 1979; Мельников, 1981; Унанянц, 1981).
Гербициды, являясь физиологически активными веществами, используются в дозах 1-Ю кг/га и, обладая достаточно высокой стабильностью, циркулируют в окружающей среде от нескольких недель до нескольких лет.
Высокая физиологическая активность и относительная стабильность этих веществ в условиях систематического применения создает исключительно сильный прецедент воздействия человека на природу.
Большая часть гербицидов, используемая для борьбы с сорняками, попадает в почву. Поэтому почва является основным природным депо для гербицидов, местом их взаимодействия с микроорганизмами и основным источником загрязнения других природных сред, кормов и продуктов питания. Вместе с тем почва является единственной средой, для которой содержание гербицидов, так же как и других пестицидов, в большинстве стран не нормировано.
Микрофлора почвы является неотъемлемой частью почвы. Значение её обусловлено той ролью, которую играет она в процессах почвообразования, круговорота веществ и самоочищения биосферы. ГГоэтому изучение вопросов взаимодействия гербицидов и микроорганизмов вытекает из насущ-ных потребностей сельскохозяйственного производства и задач по охране природы.
Цель настоящей работы - разработать научные основы почвенно-микробиологической оценки токсичности гербицидов и выработать методические подходы для микробиологического мониторинга и прогно-зирования последствий применения гербицидов в земледелии. Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи: а) изучить основные закономерности поведения почвенной микрофлоры в ответ на обработку гербицидами; б) разработать микробиологические методы тестирования остатков гербицидов и их фитоток-сичных продуктов трансформации; в) выяснить микробиологические факторы деградации наиболее стабильных гербицидов в почве; г) установить основные пути, обусловливающие отрицательное действие гербицидов на эффективность бобово-ризобиального симбиоза.
Экспериментальная работа выполнялась в 1965-1980 гг. во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии ВАСЯНИД лично автором.
В выполнении отдельных разделов исследований принимали участие аспиранты лаборатории микробиологии пестицидов, работавшие под руководством диссертанта: Л.Н.Пароменская, Г.П.Липницкая, В.Г. Масленникова, Л.В.Стати, Е.М.Михайлова, Н.З.Толкачев, И.А.Кузнецова, А.Монейм, М.В.Штальберг, а такяе научные сотрудники Е.А.Гав-рилова, А-И.Перцева, НлБ.Герш, А.А.Шамин. Всем им автор выражает глубокую признательность.
Полевые почвенно-микробиологические и фитопатологические ис следования проводились в различных районах СССР в опытах ВНИИ лекарственных растений, Агрофизического института, ВНИИ защиты растений, Всесоюзного института растениеводства, Андинанского филиала СоюзНЙХИ, Ленинградского института лесного хозяйства, Степ-но-Ишимской опытной станции по борьбе с эрозией почвы в процессе взаимопомощи и выполнения комплексных работ.
Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы.
1. Дано теоретическое обоснование, отобраны показатели и критерии, разработана и апробирована система почвенно-микробиологи-ческой оценки токсичности гербицидов.
2. Установлены основные факторы, обусловливающие отрицательные последствия систематического применения гербицидов на микрофлору и плодородие почвы.
S. Изучены наиболее общие закономерности, характеризующие поведение ассоциации почвенных микроорганизмов в ответ на обработку почвы гербицидами. Развиты представления об "экологических ми— щенях"и теоретически обоснованы методические подходы для микробиологического мониторинга пестицидов и прогноза возможных отрицательных последствий их применения в земледелии.
4. Разработаны альгологические методы определения гербицидов -ингибиторов фотосинтеза в окружающей среде. Дано теоретическое обоснование, и предложено использование зеленых водорослей и циа-нобактерий для экспресс-микроскриннинга вновь синтезируемых химических соединений.
5. Изучен механизм отрицательного действия гербицидов производных, тиокарбаминовой кислоты, феноксиалканов и сим-триазинов на симбиотические взаимоотношения клубеньковых бактерий и бобовых растений. Обоснованы подходы для отбора гербицидов на посевах бобовых культур.
6. Сформулирована новая концепция, согласно которой разложение пестицидов нерастворимых или плохо растворимых в воде, происходит по типу "микробного обрастания", ограничено поверхностью твердых частиц и обусловлено деятельностью экзоферментов, солюЗи-лизирующих веществ и агрессивных продуктов метаболизма, микроорганизмов .
Выполненные автором работы вопши в "Методические рекомендации по оценке токсического действия пестицидов на микрофлору почвы", а также в "Рекомендации по применению торфяного нитрагина (рмзо-торфина)".
Результаты исследований были использованы для почвенно-микробиологического обоснования системы противоэрозионных мероприятий на парующей почве зерно-парового севооборота в условиях Северно-то Казахстана (Степно-Ишимская опытная станция по борьбе с эрозией почвы), а также при разработке мероприятий по защите от сорняков шоголетних плантаций цитрусовых (Сухумская опытная станция ВИР) и лекарственных растении (Московская область, ВЖАР).
Апробация и публикация результатов исследований Результаты работы по теме диссертации вошли в 2 монографии и опубликованы в 89-научных статьях. По материалам исследований получено 4 автор- . ских свидетельства. С 1965 по 1982 гг. по теме диссертации сделано 45 докладов на Международных, Всесоюзных и региональных совещаниях, конференциях, съездах, симпозиумах.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, включающих результаты собственных исследований автора, обсуждения результатов, выводов, приложения. Общий объем работы составляет 269 стр. машинописного текста, 50 таблиц и 53 рисунка, а также 14 стр. приложения. Библиография включает 56? наименований, из которых 263 на иностранных языках.
Влияние агротехнических мероприятий на микробную деградацию пестицидов в почве
В земледелии пестициды используются в общей системе агротехнических мероприятий, которые в той или иной степени могут оказывать влияние на поведение их в почве. Среди таких мероприятий основное место занимают механические обработки почвы, а также применение органических и минеральных удобрений.
Введение органического вещества в почву, как правило, повышает скорость детоксикации пестицидов.
Установлено, что навоз в чистом виде и при совместном использовании с минеральными удобрениями ускоряет разложение метрибузи-на(Ранков,Велев,1975; Rankov, Veiev, 1978 ), симазина ( йлцев и др.,1982; Бакаливанов, 1982; Wieczokowska, 1980 ), монурона ( Толкачёв, 1977 ), афалона ( wieczokowska, 1980 ) и прометрина ( Бакаливанов, 1982 ).
Положительное влияние на деградацию сим-триазинов оказывали компосты из торфа, листьев и бытовых отходов ( Grower, 1966; Hiltbolt, Buchanan, 1969; Мс Cormick, Hiltbolt, 1966 ).
При обработке почвы соломой возрастала скорость деградации атразина ( Напсе, 1974 ), бензтиокарба и 2М-4ХМ ( Duah-Yentumi, Kuwatsuke Shozo, 1982 ).
В опытах ряда авторов отмечалось положительное влияние растительных остатков на деграда цию симазина и атразина (Бакаливанов, 1982; Guenzi, Beard, 1968 ).
Введение растительных остатков в почву в опытах Борделоу с соавторами ( Bordeleau et al., 1972;) И ІУІюреЙ ( Murrey et al., 1969 ) приводило к увеличению скорости деградации ряда производ - 62 - ных фенилмочевин. Наряду с этим в почве увеличивалась численность микроорганизмов и активность пероксидазы. При этом возрастала эффективность накопления производных азобензола.
Рассматривается несколько причин, обусловливающих положительный эффект органических удобрений на разложение пестицидов.
Во-первых, навоз, торф, компосты имеют значительную сорбицион-ную способность и в полевых дозах (20-40 т/га) могут сорбировать достаточно большое количество пестицидов, тем самым снижая его токсический эффект и ограничивая подвижность по почвенному профилю.
Во-вторых, применение органических удобрений непременно приводит к усилению биологической активности почвы. Как правило, резко возрастает ее биогенность и ферментативная активность.
В-третьих, навоз, компосты и особенно свежие растительные остатки содержат различные органические вещества, которые могут оказаться эффективными субстратами в процессах кометаболизма гербицидов.
И, в-четвертых, органические удобрения могут быть источником различных ферментов, кофакторов и веществ, катализирующих трансформацию гербицидов.
По-видимому, все эти 4 фактора имеют место в природе. Их необходимо учитывать и изучать. Однако в литературе нет серьезной оценки места и роли ни одного из этих факторов. Все доказательства являются априорными и основаны на эпизодических наблюдениях и общих логических рассуждениях. Более того, в литературе имеются факты другого порядка, когда органические удобрения и растительные остатки не оказывали заметного влияния на скорость деградации гербицидов (CDompkins et al., 1968; Duah-Yentuini, Kuwatsuke Shozo, 1982) или даже повышали их токсичность в почве (Толкачев, 1977).
Влияние минеральных удобрений на деградацию пестицидов в почве изучено крайне недостаточно. Большинство работ посвящено анализу фитотоксичности гербицидов для культурных растений на удобренном и неудобренном фонах. Однако, результаты анализа фитотоксичности в этом случае могут означать не столько изменение количества пестицида в почве, сколько изменение физиологических особенностей, обусловливающих изменение чувствительности самих растений к гербицидам при использовании удобрений. Это само по себе очень важно, но представляет особую тему для разговора. Что касается поведения гербицидов в почве, то результаты имеют противоречивый характер. Так, в опытах Ранкова и Велева ( Rankov, Velev, 1978) возрастающие концентрации минеральных удобрений (Ы: Р : К = 1:1:1) сокращали лаг-фазу и ускоряли деградацию гербицида метрибузина. Наибольший эффект оказывали азотные удобрения, применяемые отдельно.
По данным Бакаливанова (I9B2), генеральные удобрения (HP и NPK) оказывали положительное влияние на деградацию синазина, ат-разина, метабромурона и линурона. Скорость процесса в среднем возрастала на 10%. Положительное влияние НРК установлено в отношении деградации мезоранила и семерона (Карван, 1981), 2,4-il и 2М-4Х (Duach-Yentumi, Kawatsuka Shozo, 1982; Bellinck et al., 1979). 0днако; по данным Стржелек ( Strzelec, 1976), возрастающие дозы минеральных удобрений тормозили деградацию симазина. Азотные удобрения повышали персистентность монолинурона (Soti-rion et а] 980)Повышение фитотоксичности, а следовательно, и стабильности, сим-триазинов при внесении азотных удобрений наблюдалось в опытах других авторов (Doll, Meggit, 1969; Андреева-Фёт вадждева, \ 1973). Возможно, что противоречивые оценки, полученные в опытах различных авторов, обусловлены использованием различных доз и форм удобрений, а также разными физико-химическими свойствами почвы. Так, показано, что в присутствии нитратных удобрений подвижность симазина и атразина в почве возрастала, тогда как при использовании сернокислого аммония снижалась за счет изменения сорбцион-ной способности почвы (Harris, Hurie, 197,9). Изменение подвижности гербицидов при обработке почвы минеральными удобрениями и при ее известковании отмечали другие исследователи (Ладонин, Цимбалист, 1975, 1975а; Цимбалист, 1976; Swanson, Dutt, 1973).
Динамика токсического действия гербицидов на микрофлору почвы
Мицелий грибов обнаруживается редко. Как правило, он проходит на значительном расстоянии от гербицида, избегая прямого контакта с его частицами. Причем нередко наблюдается деформация и лизис его. Лизированный мицелий атакуется, бактериями.
Полученные результаты приводят к заключению, что атразин обладает избирательным действием на микроорганизмы в почве. Избирательный эффект выражается в том, что на поверхности кристаллов формируется монокультура бактерий. Актиномицеты и грибы как бы отодвигаются от частиц гербицида. По-видимому, в реакции ми-целиальных форм микроорганизмов на гербициды существенное значение имеет отрицательный хемотаксис. Гифы актиномицетов и грибов, достигая зоны диффузии гербицида атразина, прекращают рост в этом направлении и обходят его "стороной". Препарат базудина в гранулах размером 100-500 шм был непроч ным и распадался во влажной почве на более мелкие частицы от 5 до 40шоа рио.3,3, ). Спустя трое суток под влиянием базудина на стеклах обрастания начинает формироваться характерный микропейзаж. В отличие от контроля здесь практически отсутствуют актиномицеты. Грибы встречаются редко. Мицелий их, как правило, располагается на значительном удалении от инсектицида. Различные формы бактерий развиваются в виде небольших групп и микроколоний. Характерно, что вокруг частиц препарата, насыщенных базудином, бактерии группируются на некотором расстоянии, образуя стерильные зоны, что указывает на бактери - 108 -цидный эффект инсектицида. Массовое развитие бактерий на границе стерильной зоны позволяет сделать заключение, что низкие концентрации базудина, складывающиеся по градиенту диффузии, оказывают стимулирующее действие на их развитие. Таким образом так же, как и в случае с атразином, базудин распределяется в почве дискретно, а действие его на микроорганизмы по градиенту диффузии изменяется. Стерилизующий эффект вблизи инсектицида компенсируется массовым развитием бактерий на некотором отдалении от него. При более длительной инкубации (30 дней) на стеклах обрастания вновь появляются гифы актиномицетов. Границы стерильных зон становятся размытыми. Кольцо бактерий вокруг них смыкается. Происходит восстановление микропейзажей, то есть воздействие базудина на микрофлору почвы имеет обратимый характер. Восьмидесятипроцентный смачивающийся порошок ТМТД (тетраме тилтиурамдисульфид оказывает очень сильное воздействие на ха рактер обрастания стекол (рис.3.4, ), Стериль ные зоны занимают обширное пространство. Края их плохо очерчены, что говорит об отсутствии стимулирующего эффекта фунгицида в области низких концентраций. Мицелий гриба встречается на стек лах крайне редко в виде коротких фрагментов. Актиномицеты раз виты плохо и главным образом на периферии стекол. Бактерии рас сеяны в виде одиночных клеток и небольших групп. Массовые скоп ления их отсутствуют, что указывает на отсутствие активного раз множения. Они представлены,главным образом,мелкими кокками, а танке спорами овальной и цлектридиальной формы. Отрицательный эффект удерживался длительное время. Тем не менее, спустя 4-6 месяцев микропейзаа на стеклах обрастания практически выравнивался с контролем» т.е. так же, как и в случае с базудином, отрицательное действие ТМТД на почвенные микроорганизмы имело обратимый характер.
Аналогичные наблюдения были проведены на стеклах обрастания с фосфорорганическим препаратом гардоной [2-хлор-1 (2,4,5-три-хлорфенил)винилдиметилфосфат] и хлорорганическим инсектицидом линданом ( %-гексахлорциклогексаном), которые в принципе подтверждают описанные выше результаты. Полученные материалы, таким образом, отражают определенные закономерности в формировании микробных пейзажей почвы, обработанной пестицидом, и позволяют высказать ряд соображений на этот счет.
Не вызывает сомнения, что нерастворимые или малорастворимые химические соединения распределяются в почве дискретно в виде множества частиц, представляющих собой центры диффузии. От частиц, сколь бы малы они ни были, пестициды диффундируют в окружающую среду. По градиенту диффузии концентрация их снижается. Отсюда следует заключение, что в почве имеются как очень высокие, достигающие 100$ насыщения, так и исчезающие малые концентрации пестицидов. В соответствии с этим от центра к периферии по градиенту диффузии пестицида изменяется и физиологический эффект их на почвенные микроорганизмы.
Для того, чтобы лучше разобраться в существе происходящих в почве биологических процессов при обработке ее пестицидами, рассмотрим обобщенную схему "возмущающего" действия пестицидов на почвенную микрофлору (рис.3.5)
Пусть а, ъ, с, а, е, - отдельные виды микроорганизмов, составляющие микрофлору. При попадании в почву химический препарат начинает диффундировать в окружающую среду. В зоне, примыкающей к центру диффузии, складывается наивысшая концентрация его. У таких препаратов как ТМТД деятельность микроорганиз - 112 мов в этой зоне полностью прекращается. Вокруг частицы препарата образуется стерильная зона. Далее по градиенту диффузии начинают развиваться наиболее устойчивые формы микроорганизмов, обозначаемые: на схеме буквой (а). Причем на некотором отдалении складываются какие-то оптимальные концентрации, которые стимулируют развитие этих микроорганизмов.
При дальнейшем снижении концентрации пестицида по мере удаления от центра диффузии,наряду с культурой (а) в почве начинают развиваться все более и более чувствительные виды микроорганизмов, последовательно ъ, с, а, е, f... и т.д. Не исключено, что так же, как и в случае (а), по мере снижения концентрации пестицида ингибирующий эффект его будет переходить в стимулирующий.
Как видно из рисунка 3.5(A), при удалении от препарата будет возрастать не только численность, но и видовое богатство микрофлоры, которое в конечном счете выравнивается с контролем.
Характерно, что пестициды в этом случае,как физиологически активные вещества, при дискретном распределении в почве могут оказывать на одни и те же микроорганизмы как положительное, так и отрицательное действие одновременно. Это действие пестицида , на микроорганизмы разобщено,в пространстве." Поэтому в целом эффект пестицидной обработки почвы сводится к их пространственной перегруппировке.
По градиенту диффузии в направлении от центра к периферии зоны ингибирования могут чередоваться с зонами более интенсивного развития отдельных видов микроорганизмов. Таким образом, стимулирующий эффект на микрофлору в одной зоне в какой-то степени компенсирует ингибирующее действие в другой.
Несколько иной тип взаимодействия пестицидов с почвенными микроорганизмами представлен на рис.3.5(Б). В этом случае сте - из рильная зона вокруг частиц пестицида отсутствует. Вследствие положительного хемотаксиса или случайного контакта на поверхности этих частиц происходит концентрация и размножение какой-то специфической микрофлоры подобно тому, как это происходит на частицах природных или искусственных полимеров (целлюлоза, хитин, пластические массы, смолы и т.д.) (Звягинцев, 1973).
Многочисленные наблюдения, проведенные в лаборатории на примерах гербицида атразина, инсектицидов гардоны и линдана показали, что на частицах этих препаратов формируется монокультура микроорганизмов, которая первой вступает в контакт и колонизует их. Последнее подтверждает одну из основных закономерностей сукцессии микрофлоры при освоении органического вещества в почве, замеченную еще Виноградским (1952). Однако, и в этом случае чувствительные к пестициду микроорганизмы (Ъ, с, а, е, f...) группируются на некотором отдалении от частиц пестицида, т.е. принципиально та же картина, которая описана ранее (рис.3.5А).
Все сказанное выше приводит к заключению, что взаимодействие пестицидов с почвенной микрофлорой происходит главным образом в микрозонах, т.е. имеет локальный характер. В любом из описанных здесь случаев за пределами этой относительно небольшой зоны, примыкающей к частице пестицида, существенных изменений микрофлоры в почве не наблюдается. Следовательно, действие пестицидов на почвенные микроорганизмы ограничено какой-то частью почвы» Отсюда степень их воздействия на микробиологические процессы в целом по почвенному профилю будет зависеть от того, насколько велика эта часть.
Симбиотические взаимоотношения клубеньковых бактерий с растением люпина при обработке гербицидами хлорпроизводными симметричных триазинов
Хлорпроизводные симметричные триазины ;(симазин, атразин, пропазин, триэтазин) рекомендованы для борьбы с сорняками в посевах различных сельскохозяйственных культур. При этом используются различные способы предвсходовой обработки почвы гербицидами. Вследствие низкой растворимости они медленно передвигаются по почвенному профилю. Обладают высокой стабильностью. Фитотокси-ческий эффект их для чувствительных растений сохраняется от нескольких месяцев до нескольких лет (Майер-Боде, 1972).
Симазин, атразин, пропазин, хлоразин и триэтазин нетоксичны для клубеньковых бактерий. Как показано нами ранее (раздел 4.1), дозы, ингибирующие их рост.на искусственных питательных средах и в почве, составляют сотни миллиграмм на литр (кг), что в десятки и сотни-раз превышает производственные дозы.
Влияние хлордроизводных сим-триазинов на симбиотические взаи - 207 моотношения клубеньковых бактерий и бобовых растений практически не изучено. Опубликованный материал имеет эпизодический и крайне противоречивый характер, что достаточно хорошо видно из краткого обзора литературы.
Последнее, по-видимому, зависело от культуры растений, используемых в опыте, дозы гербицида и почвенно-климатических условий. В связи с этим, необходимо было получить надежные данные и на основанииэтого разобраться в механизме воздействия сим-триазинов на взаимоотношение мевду макро- и микросимбионтами. 0 этой целью была проведена серия вегетационных опытов в песчаной культуре растений. Опыты ставили в сосудах Вагнера емкостью 5 кг. В качестве питательного раствора использовали минеральную смесь Прянишникова, содержащую ОД или 1,0 нормы азота в зависимости от цели и условий постановки опытов. Семена безалкалоидного сорта желтого кормового люпина "Быстрорастущий 4" перед .инокуляцией клубеньковыми бактериями стерилизовали 0,2$ раствором сулемы ( HgCi2 ). Инокуляцию семян производили 5-ти суточной культурой клубеньковых бактерий R.lupini шт. 357а, взятой из коллекции ВНИИ с.-х. микробиологии. Гербициды- симазин, атразин и триэтазин - суспендировали в воде и вносили в песок перед набивкой сосудов. Концентрация их на I кг субстрата указана в таблицах 4.7, 4.8, 4.9.
Учет клубеньков на корнях растений проводили в динамике общепринятыми методами. Содержание общего азота в растениях определяли по Кьельдалю. Белковый азот осаждали гидроокисью мели по Барнштейну и определяли путем мокрого сжигания I моносахара - по Бертрану (Ермаков и др., 1952), активность дегидрогеназ в клубеньках . - по Загорье с соавторами (1973). Азотфиксирующую активность рассчитывали по разнице в содержании азота в растениях-инокулированного и неинокулированного вариантов опытов (метод инокуляции - Доросинский, Афанасьева, 1971).
Результаты учета урожая наземной массы люпина спустя 8. недель после всходов, характеризующие токсический эффект гербицидов, отражены в таблице 4.7.
Как видно, гербициды атразин и триэтазин оказывают незначительное отрицательное действие на продуктивность люпина, семена которого, не инокулировались клубеньковыми бактериями и соответственно корневая система которых не имела клубеньков. Доза 0,2 мг/кг снижала биомассу растений на 20-30$, т.е. растения люпина обладают достаточно высокой устойчивостью к этим гербицидам. Отрицательный эффект гербицидов резко возрастает при инокуляции растений клубеньковыми бактериями. При этом уменьшается эффективность симбиоза. Так, если в контроле продуктивность растения люпина, инокулированного клубеньковыми бактериями, возраста - 209 -ет на 238$, то при концентрации тризтазина 0,2 мг/кг на 177$, а для атразина она составляет - 51$.
Вместе с тем у растении, обработанных гербицидами, уменьшается масса клубеньков. Происходит их измельчение (рис.4.3). Описанная картина указывает на то, что в присутствии гербицидов происходит нарушение нормальных симбиотических взаимоотношений между макро- и микросимбионтами.
Сравнительный анализ азотфиксирующей активности симбиотичес-кой системы в различных вариантах опыта подтверждает сказанное выше. Симазин и атразин в концентрации 0,2 мг/кг полностью блокируют процесс фиксации молекулярного азота (табл.4.8).
Описанная картина указывает на то, что в присутствии гербицидов происходит нарушение нормальных симбиотических взаимоотношений между макро- и микросимбионтами.
Экспресс-метод оценки фитотоксичности химических соединений с помощью культуры водорослей на бумажных дисках
Анализ различных способов культивирования микроскопических во-дрослей, описанных в литературе, позволил остановить наш выбор на методике мембранных фильтров. Последняя была впервые предложена Францевым в 1935 году. Различные модификации ее разработаны для определения обеспеченности почвы в основных элементах питания (Францев, 1935; Крючкова, 1947; Некрасова, 1972,1976,1980) Впоследствии мембранные фильтры в сочетании с радиоуглеродным методом были с успехом использованы для изучения процессов фотосинтеза у водорослей (Сапожников и др., 1964).
Положительная сторона метода заключается в том, что он не требует сложной аппаратуры и позволяет работать с очень небольшим объемом среды, а, следовательно, с ультрамалыми количествами исследуемых веществ. Очень важно, что этот метод может быть использован для анализа как жидких, так и агаризованных сред, а также почвы и минеральных субстратов.
Техника выращивания водорослей при этом элементарно проста. Суспензию водорослей определенной плотности отфильтровывают на мембранные фильтры в аппарате Зейтца. Фильтры наносят на поверхность субстрата (агаризованная питательная среда, почва) и инкубируют на свету в течение нескольких суток. После чего определя-ют биомассу водорослей.
Используя основные идеи, заложенные в методе, мы заменили мембранные фильтры на фильтровальную бумагу.
В серии предварительных опытов были проведены испытания ряда видов зеленых водорослей, в цикле развития которых отсутствовали подвижные формы, и подобраны оптимальные для этих условий питательные среды.
Наилучшие результаты были получены в опытах с Chlorelia vulgaris 157, которая в последующем использовалась как тест-культура при оценке фитотоксичности различных химических соединений.
Культивирование водорослей на бумажных фильтрах имеет некоторые особенности. Как показали результаты микроскопирования, при прохождении суспензии хлореллы через фильтровальную бумагу, на поверхности ее остаются, главным образом, крупные :; зрелые клетки, наполненные автоспорами. Это обусловливало возрастную однородность исходного і материала и практически синхронное; их развитие на дисках, что обеспечивало стабильную реакцию культуры на вводимые в питательную среду химические соединения.
Вследствие короткой экспозиции нарастание биомассы водорослей на дисках было невысоким. Поэтому для анализа относительного содержания их определяли фотосинтетические пигменты в спиртовом экстракте.
Характерные данные, отражающие динамику роста хлореллы на дисках фильтровальной бумаги на среде Ельмана, представлены на рис.5.3. Переход культуры водорослей в стационарную» фазу наблюдается на 7-Ю сутки и часто сопровождается появлением аэробных целлюлозоразлагающих бактерий. Крутизна кривой логарифмического роста и скорость перехода в стационарную фазу увеличиваются с увеличением исходного материала на дисках.
При использовании лампы ДС-30 освещенность рабочего места составляла 3,0-4,0 тыс. люкс. Изменение освещенности в этом диапазоне практически не влияло на развитие хлореллы. Оптимум темпе 100 = ратуры составлял 22-25С. Выше 30С рост Ch.vulgaris 157 резко ухудшался, наблвдались патологические процессы и лизис клеток.
Исходя из этого была разработана следующая методику культивирования водорослей на дисках фильтровальной бумаги и оценки фи-тотоксического эффекта химических соединений.
Водную суспензию хлореллы из рабочей культуры (жидкая или агаризованная среда) переносили на диски фильтровальной бумаги в аппарате Зейтца. Затем диски помещали на поверхность минимальной среды Ельмана и инкубировали в люминостате при непрерывном освещении лампами ДС-30. Спустя трое суток водоросли с дисков смывали питательной средой и использовали в опыте в качестве посевного материала. Плотность суспензии водорослей проверяли тур-бодиметрически и доводили до стандарта, за который была принята 0,1-0,2 единицы по шкале оптической плотности Ф0&_56 (зеленый фильтр, кювета 20 мм). 10 мл подготовленной таким образом суспен-ции водорослей вновь отфильтровывали на диски фильтровальной бумаги в аппарате Зейтца,Г}раскладывали на поверхность исследуемого субстрата (песок, почва, жидкая агаризованная среда Ельмана) и инкубировали в люминостате при непрерывном освещении лампами ДС-30. Освещенность рабочего места составляла 3-4 тыс. люкс. Температура окружающего воздуха 23-26С. После экспозиции на свету диски снимали с поверхности среды. Подсушивали до воздушно-сухого состояния. Интенсивность роста водорослей определяли путем прямого фотометрирования дисков в проходящем свете на универсальном фотометре ФМ-58 (синий фильтр № II) или по содержанию в них хлорофилла. Для извлечения пигментов диски фильтровальной бумаги с водорослями растирали в ступке с кварцевым песком и экстрагировали этиловым спиртом. Спиртовой экстракт пропускали через стеклянный фильтр Шотта }f 3 под вакуумом. Фильтрат доводи - 246 ли до Ю мл и колориметрировали на ФЭК-56 (красный фильтр, кювета 20 мм). Содержание пигментов в спиртовом экстракте выражали в единицах оптической плотности. Ивгибирующий,эффект (ИК ) хи у-г мических соединений определяли по отношению —— 100$, где vr- оптическая плотность спиртового экстракта хлорофилла в варианте опыта с определенной концентрацией химических веществ, Vk - в контрольном варианте.
Для уточнения основных параметров методики тестирования фито-токсических соединений в серии опытов исследовали влияние ряда гербицидов производных фенилмочевины и сим-триазинов на динамику роста хлореллы.
Типичные результаты этих опытов представлены на рис.5.3, из которого видно, что в пределах исследуемых концентраций гербициды обладают альгостатическим действием. Вследствие этого ингиби-рующее действие их в процессе культивирования изменяется, что связано с исчерпывающей сорбцией малых концентраций гербицидов нарастающей биомассой водорослей и адаптацией последних. Большие концентрации гербицидов (для монурона на среде Ельмана 0,8-1,0 мг/л) полностью блокируют рост хлореллы. Поэтому кривые, отражающие зависимость между ингибирующим эффектом и дозой гербицида, рассчитанные на культуры различного возраста (рис.5.3Б) несколько отличаются. У трехсуточной культуры она ближе к идеалу и на участке И%)_зо практически является прямо пропорциональной. В этом случае удается обнаружить токсический эффект более низких концентраций гербицидов, т.е. чувствительность метода заметно повышается.
Стабильные результаты, практически не зависящие от времени культивирования в пределах логарифмической фазы роста, получены для концентраций гербицидов, ингибирующих рост хлореллы на 50$ (HKCQ), ЧТО позволяет рассматривать эту величину, как важнейший показатель при сравнительной характеристике фитотоксических свойств химических соединений.
Вместе с тем четко выраженная зависимость между ингибРірующим эффектом и концентрацией альгицида в среде позволяет широко использовать этот метод для количественного анализа фитотоксических веществ и оценки загрязнения ими окружающей среды.
Статистический анализ результатов этих исследований показал, что при 4-х кратной повторности точность опыта составляет 4-10$ и снижается в вариантах с высокой концентрацией гербицида. Ошибка определений, рассчитанная на основе 16 самостоятельных опытов, проведенных в различное время года, составляет не более 14% . Точность в оценке ИКзд не более 10%
