Введение к работе
Актуальность проблемы.
Коклюш – респираторное заболевание людей, вызываемое грам-отрицательными бактериями Bordetella pertussis. Бактерии B.pertussis передаются от человека к человеку воздушно-капельным путем. Профилактика коклюша входит в национальный календарь плановых прививок и обеспечивается программами массовой вакцинации детей. Несмотря на это, циркуляция возбудителя коклюша в популяции не уменьшается. Ежегодно в мире регистрируется до 48,5 миллионов заболеваний, из них до 300 000 случаев заканчиваются летальным исходом (Crowcroft N.S. et al. 2003). Чаще, и в более тяжелой форме, коклюшем болеют дети первого года жизни, но в последнее время отмечается рост числа лабораторно подтвержденных случаев коклюша у подростков и взрослых (Cherry JD, Heininger U, 2004). Эпидемиологические исследования показали, что последние являются основным резервуаром инфекции для заражения наиболее восприимчивых к заболеванию новорожденных (Mattoo S,Cherry JD, 2005). Отмечены случаи бессимптомного носительства B.pertussis (Heininger UW et al., 2004). Активно изучаются механизмы носительства и персистенции возбудителя в организме человека. Установлена связь между переживанием бактерий Bordetella внутри эукариотической клетки и экспрессией некоторых факторов вирулентности возбудителя (Bassinet L, 2000).
Одной из характерных особенностей возбудителя коклюша является высокая степень изменчивости его фенотипических признаков. Бактерии с разной вирулентностью, формой колоний и способностью к гемолизу эритроцитов были выделены на разных стадиях заболевания, при экспериментальном заражении лабораторных животных и при культивировании in vitro (обзор Wardlaw A, Parton R, 1988). Такие бактерии были названы фазовыми вариантами (Lacey B. 1960), а их переход из одной фазы в другую – фазовым переходом.
На протяжении последних 20-и лет проведены многочисленные молекулярно-генетические исследования структуры и экспрессии генов вирулентности. Установлено, что большинство из них регулируется на уровне транскрипции, управляемой двухкомпонентной сенсорной системой BvgAS Bordetellа (Cotter PA, Miller JF, 2001, Cummings CA et al., 2006).
Регуляция экспрессии генов вирулентности Bordetellа изучена главным образом в экспериментах in vitro. Только в одной работе предпринята попытка анализа транскрипции bvgAS-зависимых генов cya, fha, prn и ptx в процессе размножения бактерий в легких мышей после их аэрозольного заражении вирулентным штаммом B.pertussis (Wendy L, Stibitz S, 2005). Отсутствие адекватной модели затрудняет изучение роли отдельных факторов вирулентности и фазовых переходов в формировании и развитии инфекционного процесса в экспериментах на животных. Остается открытым вопрос о механизме формирования носительства (персистенции) возбудителя коклюша в организме человека (Mattoo S, Cherry JD, 2005, Cummings CA et al., 2006).
Установлена структурная организация и последовательности хромосом B.pertussis, B.parapertussis и B.bronchiseptica, что позволило идентифицировать повторяющиеся IS–подобные элементы и геномы профагов в хромосомах микроорганизмов рода Bordetella (McLafferty MA et.al.,1989, McPheat WL et.al., 1989, Parkhill JM et al., 2003). Использование современных методов молекулярного анализа (пульс-электрофореза и IS-типирования и гибридизации) выявило значительные отличия структуры хромосом бактерий B.pertussis, выделенных в разные периоды времени и в различных географических регионах (Mary M et al., 2006). Изменения структуры хромосомы обнаружены и после пассажа бактерий B.pertussis на питательных средах in vitro (Brinig MM et al., 2006). Авторы полагают, что перестройки являются следствием рекомбинаций, индуцированных IS-подобными элементами B.pertussis. События гомологичной и «незаконной рекомбинации», индуцированные IS-элементами, обеспечили редуктивную эволюцию геномов микроорганизмов рода Bordetella (Cummings CA et al., 2004, Mary M et al., 2006). Высказываются предположения о формировании некоторых фазовых вариантов B.pertussis в результате перемещения (исключения) IS-элементов в оперон bvgAS B.pertussis (Stibitz S et al., 1989, Monack DM et al., 1989, McGillivray DM al., 1989). Однако экспериментально эти предположения не были подтверждены.
Актуальность проведенных исследований определяется необходимостью расширения знаний об эпидемиологически значимом возбудителе инфекционного заболевания человека. Идентификация мобильных генетических элементов B.pertussis (IS-элементов, Tn-подобных структур, бактериофагов), определение факторов, влияющих на частоту перемещения МГЭ в клетках B.pertussis, изучение роли МГЭ в регуляции вирулентности возбудителя коклюша, позволит понять механизмы изменчивости и адаптации бактерий возбудителя коклюша к среде обитания.
Используемые в настоящее время бактериологические методы лабораторной диагностики коклюша недостаточно чувствительны, а серологические методы недостаточно специфичны. Идентификация ДНК B.pertussis с помощью методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Xuan Qin et al., 2007) не нашла широкого применения в отечественной практике здравоохранения (И.Н. Лыткина и др., 2004). Необходимость дальнейшего совершенствования лабораторной диагностики возбудителя коклюша, в том числе, методов анализа фазовых вариантов бактерий B.pertussis in vitro и in vivо, определяет актуальность прикладного раздела исследования. Тест-системы для обнаружения ДНК возбудителя коклюша в клиническом материале с помощью ПЦР и методы выявления бактерий B.pertussis, содержащих инсерцию IS–элемента в генах вирулентности, будут использованы для изучения носительства возбудителя коклюша, диагностики атипичных форм заболевания, определения структуры и механизмов формирования резервуаров инфекции.
Цель исследования Выявление генетических основ и молекулярных механизмов изменчивости B.pertussis и роли мобильных генетических элементов (МГЭ) в регуляции экспрессии генов вирулентности возбудителя коклюша.
Задачи исследования:
1. Выделение и характеристика повторяющейся последовательности (RS) и Tn – подобных элементов хромосомы B.pertussis.
2. Разработка экспериментального метода для регистрации событий перемещения RS–элементов в специфические сайты хромосомы B.pertussis. Определение факторов, влияющих на перемещение RS–элементов в оперон bvgAS, регулирующий вирулентность B.pertussis.
3. Выделение мутантов B.pertussis, содержащих инсерцию RS –элемента в опероне bvgAS.
4. Выделение и характеристика новых бактериофагов и лизогенности микроорганизмов рода Bordetella.
5. Конструирование тест-систем для идентификации и характеристики ДНК бактерий B.pertussis в биологическом материале от носителей и больных коклюшем детей и взрослых с помощью полимеразной цепной реакции.
Научная новизна
- клонированы повторяющаяся последовательность и транспозоно-подобная структура хромосомы B.pertussis, сконструированы их генетически маркированные варианты. Показано, что изолированные нами RS и Tn–подобная последовательности являются мобильными генетическими элементами, сходными с МГЭ других бактерий. МГЭ B.pertussis способны к RecA- независимым перемещениям, индуцируют образование дупликаций, делеций, инверсий прилегающего генетического материала и формирование коинтегратов в бактериях E.coli. Установлена зависимость RS- индуцируемых событий рекомбинации от фенотипа бактерии–хозяина. Cконструирован штамм E.coli, продуцирующий функционально-активную транспозазу RSBP B.pertussis;
- идентифицированы события спонтанного перемещения RS– элементов в сctagg сайт оперона bvgAS вирулентных бактерий B.pertussis и выделены инсерционные Bvg- мутанты B.pertussis. Установлено, что частота перемещения RS–элементов зависит от функционирования оперона bvgAS и условий культивирования бактерий B.pertussis. Перемещение RS–элементов не регистрируется в бактериях, содержащих мутацию в опероне bvgAS. Показано, что бактерии B.pertussis могут переходить в авирулентное состояние в результате интеграции RS–элементов в оперон bvgAS, регулирующий экспрессию генов вирулентности бактерий;
- выделены и охарактеризованы новые бактериофаги из бактерий международного штамма B.pertussis Tohamа I (fТ) и конвертанта B.parapertussis 17903 (fК), установлена лизогенность бактерий и структура геномов описанных ранее бактериофагов B.pertussis и B.bronchiseptica. Показано, что геномы всех изученных бактериофагов Bordetella, за исключением бактериофага fК, идентичны. Геном бактериофага fК отличается от генома fТ и всех охарактеризованных бактериофагов Bordetella. Бактерий B.pertussis и B.bronchiseptica являются полилизогенами. Геном профага fК находится в хромосоме клетки-хозяина, тогда как геном fТ присутствует, скорее всего, в состоянии плазмиды и утрачивается в процессе культивирования большей частью бактериальной популяции. По меньшей мере, один из выделенных бактериофагов B.pertussis, родственный fТ, способен лизогенизировать бактерии B.parapertussis, интегрируя фрагмент генома в хромосому, и вызывая изменение свойств возбудителя паракоклюша. Свойства охарактеризованных бактериофагов позволяют отнести их к классу мобильных генетических элементов.
Практическая значимость
Показана целесообразность использования разработанных в процессе выполнения работы тест-системы и метода выявления ДНК бактерий B.perussis, находящихся в различных фазовых состояниях, для диагностики заболевания, выявления носителей возбудителя коклюша, определения роли фазовых состояний в патогенезе и персистенции возбудителя.
Использование разработанных тест-систем для лабораторной диагностики коклюша показало их высокую эффективность в сравнении с бактериологическими методами и позволило выявить возбудитель коклюша примерно у 7% «практически здоровых» детей и более чем у 30% больных детей с диагнозом острое респираторное заболевание. Полученные нами и другими авторами результаты указывают на то, что стертая и атипичная формы коклюша является причиной значительного числа заболеваний с симптомами длительного кашля. Длительно кашляющие дети и взрослые, бессимптомные носители бактерий B.perussis, наряду с больными типичной формой коклюша, являются источником инфекции.
Разработанный экспериментальный подход позволяет идентифицировать бактерии, содержащие инсерцию RS-элементов в оперон bvgAS, регулирующий транскрипцию генов вирулентность возбудителя коклюша. Идентификация инсерционных Bvg- мутантов и мутантов по другим генам вирулентности B.perussis на разных стадиях заболевания или в организме носителей позволит определить роль RS-индуцированного мутагенеза при формировании персистирующих форм бактерий Bordetella. Исключение RS-элемента из структуры мутантного гена приводит к восстановлению вирулентного фенотипа, что может вызывать развитие инфекционного процесса в организме хозяина. Определение относительного числа инсерционных мутантов B.perussis у носителей и больных на разных стадиях заболевания может оказаться важным критерием для оценки эпидемиологической значимости носительства Bvg- мутантов и разработки новых подходов к профилактике коклюша.
Подготовлена фармакопейная статья и инструкция по применению «Тест-системы для экспресс-индикации возбудителя коклюша методом полимеразной цепной реакции», одобренные Советом по внедрению научных достижений в практику ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 7 февраля 2008 г., протокол №3.
Апробация работы.
Основные результаты работы доложены на конференции National Institute of Allergy and Infection Diseases USA research conference , June 24-30, 2006; 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000; 2-м Всесоюзном симпозиуме теоретических и прикладных аспектов молекулярной биологии, Самарканд 1991; Всесоюзной школе-семинаре «Молекулярная биология и медицина», Ленинград, 1990; FEMS-symposium Pertussis, Berlin, 1988; 13-ой Всесоюзной конференции по электронной микроскопии «Биология и медицина», Москва 1988.
Апробация диссертации состоялась 13 декабря 2007г на совместной научной конференции отделов медицинской микробиологии, генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 34 работы, из которых 21 в рекомендованных ВАК РФ изданиях.
Структура работы.
Диссертационная работа изложена на 292 страницах, содержит введение, 3 главы («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение») заключение и выводы. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 16 таблицами. Список литературы содержит 490 ссылок, из них 19 в изданиях на русском языке.
