Введение к работе
Актуальность проблемы. Коклюш – инфекционное респираторное заболевание человека, вызываемое грамотрицательными бактериями Bordetella pertussis, характеризующееся тяжелым течением и высокой летальностью у новорожденных и детей первого года жизни. Летальность при коклюше обусловлена развитием осложнений: апноэ, нарушения мозгового кровообращения, кровотечения из задне-глоточного пространства и бронхов, внутричерепные кровоизлияния, надрывы диафрагмы, коклюшная пневмония, эмфизема легких и др. Массовая противококлюшная вакцинация, проводимая в нашей стране с помощью АКДС-вакцины, начиная с 1950-х гг. прошлого столетия, значительно снизила летальность и заболеваемость коклюшем в типичной форме (Захарова М.С., 1969, Сигаева Л.А, 1986, Озерецковский Н.А., 2004). Несмотря на клиническую и лабораторную гиподиагностику коклюша, по данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется до 50 миллионов случаев заболевания, умирает около 300 тысяч детей, преимущественно в возрасте до 1 года (WHO, 2003). В последние десятилетия во всем мире наблюдается рост заболеваемости коклюшем среди подростков и взрослых (Cherry J.D. et al., 2004, Отвагин С.А., 2005, Тимченко В.Н., 2009). Типичную клиническую картину коклюша наблюдают сегодня все реже, в основном, у не вакцинированных, наиболее восприимчивых к коклюшной инфекции младенцев до 5-6 месяцев и у детей старше 10 лет (Wood N. et al., 2008). Увеличивается число случаев атипичных форм коклюша: стертых, бессимптомных, абортивных, транзиторного бактерионосительства (Лобзин Ю.В., 2011). Эпидемиологические исследования подтвердили, что для восприимчивой группы детей источником инфекции являются подростки и взрослые, у которых коклюш, как правило, протекает в атипичных формах. Носителями возбудителя коклюша могут быть практически здоровые люди (Герасимова А.Г., 2004, Heininger U., 2004, Mattoo S., 2005).
Диагностика атипичных форм коклюша затруднена из-за отсутствия характерной клинической картины и адекватных лабораторных методов. Бактериологический метод на ранних стадиях коклюша выявляет возбудитель не более чем в 10% случаев даже при типичных формах заболевания (Борисова О.Ю., 2010), серологические методы (РНГА, РПГА, ИФА) подтверждают заболевание только на поздних стадиях, а нарастания титров специфических антител у бактерионосителей, как правило, не наблюдается (Ценева Г.Я., 2003). Раннее лабораторное подтверждение диагноза «Коклюш» особенно актуально в клинической практике для диагностики атипичных форм, определения тактики лечения и проведения противоэпидемических мероприятий в семейных очагах и организованных детских коллективах (Сипачева Н.Б., 2011).
Бактерии Bordetella pertussis – микроорганизмы, обладающие значительной изменчивостью, проявляющейся в появлении бактерий разной степени вирулентности. Это зависит от условий культивирования, длительности заболевания, лечения, ранее проведенной вакцинации (Friedrich M.J., 2011). Впервые на изменчивость B.pertussis in vivo было указано еще Трушиной-Тумановой Е.Ф. в 1949 г., выделившей непосредственно от 39 больных с различной клинической картиной коклюша 40 атипичных культур B.pertussis. Экспрессия генов вирулентности бактерий B.pertussis контролируется опероном вирулентности bvgAS. B.pertussis в I фазе (Вvg+) экспрессируют все факторы вирулентности. В результате мутаций, нарушающих структуру оперона bvgAS, происходит переход из I вирулентной фазы в IV авирулентную (Вvg–) фазу и изменение экспрессии факторов вирулентности (фазовые модуляции). Частичная потеря вирулентности наблюдается у B.pertussis во II и III фазах вирулентности, объединенных в понятие промежуточной фазы (Вvgi) (Tracy L. Nicholson et al., 2012).
Исследования по изучению регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша, проводимые в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, показали, что перемещение инсерционных последовательностей (IS-элементов 481 и 1002) в оперон bvgAS является одним из механизмов, обеспечивающих переход бактерий B.pertussis из вирулентной I фазы в авирулентную IV фазу. Популяции бактерий B.pertussis in vitro были гетерогенны и содержали разное, зависящее от условий культивирования, количество вирулентных Вvg+ бактерий и авирулентных инсерционных Вvg– мутантов. Соотношение между числом вирулентных и авирулентных бактерий было названо фазовым составом популяции бактерий B.pertussis (Каратаев Г.И., 2008). Вероятно, in vivo с течением инфекционного процесса происходит накопление авирулентных инсерционных мутантов возбудителя коклюша и формирование бактерионосительства.
Разработка метода быстрой идентификации возбудителя коклюша и определения фазового состава популяции бактерий B.pertussis поможет улучшить диагностику атипичных форм коклюша. Установление корреляции между фазовым составом популяции бактерий B.pertussis и клинической картиной заболевания позволит определить тактику лечения и проведения противоэпидемических мероприятий.
Цель работы: регистрация инсерционных авирулентных Bvg– мутантов бактерий B.pertussis in vivo и выявление корреляции между клинической картиной заболевания у больных типичными и атипичными формами коклюша и фазовым составом популяции возбудителя.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
-
Разработка тест-системы ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для количественного определения ДНК бактерий B.pertussis в клинических образцах, содержащих инсерции IS481 и IS1002 в опероне вирулентности bvgAS.
-
Выявление бактерий B.pertussis с помощью ПЦР-РВ в сравнении с бактериологическим методом в назофарингеальных мазках от больных типичными и атипичными формами коклюша и практически здоровых детей и взрослых, контактировавших и не контактировавших с больными.
-
Количественное определение авирулентных бактерий B.pertussis, содержащих инсерциии IS481 и IS1002 в опероне bvgAS в ПЦР-РВ положительных клинических образцах.
-
Установление корреляции между клинической картиной заболевания у больных типичными и атипичными формами коклюша и фазовым составом популяции бактерий B.pertussis.
-
Изучение сроков персистенции и фазового состава популяции бактерий B.pertussis разработанным методом ПЦР-РВ при экспериментальном заражении мышей вирулентными бактериями B.pertussis.
Научная новизна. Впервые разработан неинвазивный количественный метод для выявления возбудителя коклюша и его инсерционных авирулентных (Bvg–) мутантов для изучения фазового состава популяции бактерий B.pertussis у больных типичными и атипичными формами заболевания.
Впервые показано, что популяции бактерий B.pertussis у больных различными формами коклюша гетерогенна, установлена корреляция между её фазовым составом и клинической картиной заболевания: абсолютное большинство бактерий B.pertussis у больных типичными формами коклюша содержит интактный оперон вирулентности (I фаза, Bvg+), тогда как у больных атипичными формами коклюша – в среднем 0,2% инсерционных авирулентных Вvg– мутантов, у бактерионосителей – от 10 до 90%.
Впервые показано, что ДНК возбудителя коклюша выявляется у 55,6% больных с диагнозом «ОРВИ» и смешанными респираторными инфекциями, у 31% больных – с симптомом «длительный кашель».
ДНК B.pertussis была выявлена у 75% «практически здоровых» детей и взрослых, контактировавших с больными.
Научно-практическая значимость работы. Разработанная тест-система ПЦР-РВ предназначена для дифференциальной диагностики респираторных инфекций, трудно поддающихся этиотропной терапии, в комплексе с общепринятыми методами диагностики коклюша (бактериологическому и серологическому).
С помощью созданной тест-системы ПЦР-РВ будет возможно проведение развернутых эпидемиологических обследований для изучения сроков персистенции бактерий и проведения адекватных санитарных мероприятий (карантина и т.д.).
Использование тест-системы ПЦР-РВ необходимо для оценки эффективности коклюшных вакцин, совершенствования и разработки новых профилактических препаратов, а также в фундаментальных научно-исследовательских работах, направленных на дальнейшее изучение механизмов образования персистирующих форм бактерий.
По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Способ выявления авирулентных бактерий Bordetella pertussis, сформированных в результате инсерций IS-элементов 481 и 1002 в оперон вирулентности bvgAS, у больных атипичными формами коклюша», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 22 ноября 2012 г., протокол № 22.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработана тест-система ПЦР-РВ, позволяющая в клинических образцах выявлять бактерии возбудителя коклюша и изучать фазовый состав популяции бактерий Bordetella pertussis у больных типичными и атипичными формами коклюша.
-
С помощью разработанной тест-системы ПЦР-РВ показана широкая распространенность возбудителя коклюша среди больных с инфекционной респираторной патологией, а также возможность носительства бактерий B.pertussis практически здоровыми людьми.
-
Установлена корреляция между клинической картиной коклюша у больных типичными и атипичными формами и фазовым составом популяции бактерий B.pertussis.
-
Разработанный способ выявления авирулентных инсерционных мутантов B.pertussis позволяет изучать механизмы изменения популяции возбудителя коклюша в процессе развития инфекционного процесса.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», 3-е место (Москва), на научно-практической конференции Научного Центра Здоровья Детей РАМН «Актуальные проблемы педиатрии» в рамках конкурса молодых ученых (Москва, 2009), на Международной школе по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), на XIV Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», в рамках конкурса молодых ученых, 1-е место (Санкт-Петербург, 2011), на международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012). Защищена дипломная работа на факультете фундаментальной медицины Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова «Диагностическое значение фазовых состояний возбудителя коклюша (Bordetella pertussis), выявляемого в клинических образцах детей и взрослых с диагнозом «ОРЗ» (Москва, 2009).
Апробация работы состоялась 8 июня 2012 г. на совместной научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий и отдела медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе две статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и одна статья – в зарубежном издательстве. По результатам работы подана заявка на получение патента (2011 г).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 34 отечественных и 151 иностранный источник. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 8 рисунками.
