Введение к работе
Актуальность проблемы и состояние вопроса. При изменении условий окружающей среды - исчерпании питательных веществ, источников энергии и пространственных возможностей, происходит или снижение скорости роста микроорганизмов, или стратегия роста заменяется стратегией переживания и перехода в состояние покоя. Начало исследований покоящегося состояния у микроорганизмов положили работы Ф. Кона и Р. Коха, описавших в 1876 г. эндоспоры бацилл. Наибольшую интенсивность и разносторонность изучение форм и механизмов покоя приобрело в середине XX века в рамках отдельного направления микробиологии. В настоящее время интерес к явлению покоя обусловлен явлением персистенции возбудителя туберкулеза [Wayne, 1994; Zhang, 2004] и других заболеваний [Watson et al., 1998; Бухарин и соавт. 2005], а также существованием вы антибиотикоустойчивых клеток-персисторов [Keren et al. 2004, Lewis, 2007] и, наконец, обнаружением древних микроорганизмов [Сапо, Вогаску, 1995; Vreeland et al. 2000], в том числе, в глубокомерзлых породах [Звягинцев и соавт., 1985]. Однако у большинства видов неспорообразующих бактерий покоящиеся формы неизвестны, что определило актуальность диссертационной работы.
Множество публикаций посвящено жизнеспособному некулътивируемому (ЖНК) состоянию бактерий, в котором клетки, сохраняя потенциальную жизнеспособность, утрачивают способность образовывать колонии на плотных средах [Xu et al., 1982; Colwell et al, 1985; Oliver et al, 1993; Mukamolova et al, 1995; Oliver, 2005; Sachidanandham, Yew-Hoong Gin, 2009]. Несмотря на дискуссии по поводу адекватности этого термина состоянию неделения и сохранения клетками жизнеспособности [Bloomfield et al. 1998; Головлев, 1998; Barer, Harwood, 1999], не вызывает сомнений существование самого явления и важность его исследований особенно в связи с мониторингом патогенных и условно-патогенных бактерий в природных местах обитания. ЖНК-состояние рассматривают и как форму покоя [Kaprelyants et al., 1993; Rahman et al., 1996], и как стадию на пути к отмиранию популяции [Joux et al., 1997; McDougald et al., 1998]. Некоторые авторы считают, что пребыванием клеток в таком состоянии нельзя объяснить длительное выживание бактерий в неростовых условиях [Bogosian et al., 1996].
Облигатное свойство всех бактерий формировать в циклах развития их культур покоящиеся «микроцисты», предназначенные для выживания вида, постулировалось Биссетом [Bisset, 1952]. Экспериментальные доказательства справедливости этой гипотезы - образование клеток цистоподобного типа, были получены позже для узкого круга микроорганизмов [Дуда и соавт., 1982; Sadasivan, Neyra, 1987; Бабусенко и соавт., 1991; Garduno et al., 2002; Berleman, Bauer, 2004]. При описании новых таксонов ряда неспорообразующих прокариот отмечалось
образование клеток, схожих по строению с цистами [Горленко и соавт., 1976; Жи-
лина, Заварзин, 1979; Heulin et al., 2003; Zhang et al., 2003; Zhilina et al., 2004; Ahmed et al., 2007]. При этом в работах таксономической направленности не исследовали их свойства как форм, предназначенных для длительного переживания вида. Отсутствие информации о покоящихся формах неспорообразующих бактерий обусловлено, во многом, отсутствием сведений об условиях, оптимальных для их образования в лабораторных культурах. При этом без достаточного количества покоящихся клеток невозможно исследование их свойств. Следует отметить, что трактовка термина «покой» для неспорообразующих бактериям широка и охватывает: (1) клетки культур стационарной фазы [Vulic, Kolter, 2001]; (2) некультиви-руемые формы [Roszak, Colwell, 1987; Kaprelyants et al., 1993]; (3) неактивные клетки в биопленках [Costerton et al., 1999; Xu et al., 1998]; (4) антибиотико-устойчивые персисторы [Shah et al., 2006]; (5) вышеупомянутые клетки цистопо-добного типа. Это не тождественные состояния пролиферативного и метаболического покоя. Основанием для отнесения клеток к покоящимся формам прокариот является доказательство: 1) длительного сохранения их способности к репродукции; 2) резко сниженной или экспериментально не выявляемой метаболической активности; 3) повышенной устойчивости к повреждающим воздействиям; 4) отличий в ультраструктурной организации от вегетативных (делящихся и стационарных) клеток; 5) их образования в циклах развития культур - в соответствии с определением, принятым в литературе по спорам [Sudo, Dworkin, 1973; Cross, Atwell, 1975; Калакуцкий, Агре, 1977].
Другой важной проблемой при изучении способов выживания микроорганизмов в природе в неростовых условиях является выяснение закономерностей и регуляции образования покоящихся форм. К настоящему времени накоплен обширный материал о сигнальных метаболитах и регуляторных системах, контролирующих многие процессы в циклах развития микробных популяций, такие как длительность лаг-фазы, споро- и антибиотикообразование, реактивацию некуль-тивируемых клеток микрококков и др. [Хохлов, 1988; Fuqua et al., 1994; Олескин и соавт., 2000; Lazazzera, 2000; DeLisa, Bentley, 2002; Mukamolova et al, 1998; 2006]. Описаны плотностные ауторегуляторы - ацилированные гомосеринлактоны (ГСЛ) у ряда грамотрицательных бактерий, которые в зависимости от клеточной плотности популяции контролируют индукцию ряда синтезов в стационарной фазе [Fuqua et al., 1994; Greenberg et al., 1996; Taga, Bassler, 2005]. Участие этих факторов в регуляции состояния покоя неизвестно. Регуляторы другого типа - факторы di, представленные у ряда бактерий алкилоксибензолами (АОБ), имеют функции аутоиндукторов анабиоза [Эль-Регистан и соавт., 1979; 1980; Светличный и соавт., 1986; Осипов и соавт., 1985; Батраков и соавт., 1993; Лойко и соавт., 2002]. Безусловную важность представляет дальнейшее развитие исследований регуляции образования покоящихся форм у широкого круга микроорганизмов, осущест-
вляющейся с участием коммуникативных факторов из групп алкилоксибензолов и гомосеринлактонов, а также изучение их видо(не)специфичности и функциональной роли в переходе клеток в состояние покоя и выходе из него.
Таким образом, изучение способов и форм покоя у неспорообразующих бактерий представляет фундаментальный и практический интерес для микробной экологии, медицины, биотехнологии.
Цель работы - изучить способы выживания неспорообразующих бактерий в неростовых условиях: морфотипы покоя, условия и регуляцию образования и характеристики покоящихся клеток. В настоящей работе были поставлены следующие задачи:
-
выявить условия, способствующие образованию цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорообразующих бактерий в циклах развития их культур;
-
охарактеризовать ЦПК как формы покоя по показателям: длительности сохранения пролиферативного потенциала; отсутствия метаболической активности; устойчивости к повреждающим воздействиям; особенностям ультраструктурной организации;
-
охарактеризовать внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм по морфологическим типам, способности ревертировать к росту, степени глубины покоя, устойчивости к повреждающим воздействиям, фе-нотипической диссоциации при прорастании;
-
изучить роль внеклеточных ауторегуляторных факторов микроорганизмов в контроле перехода бактерий в состояние покоя и его поддержании;
-
разработать подходы к диагностике покоящихся форм бактерий в лабораторных культурах и природных образцах.
Научная новизна и значимость работы
Для широкого круга неспорообразующих грамположительных и грамотрица-тельных бактерий доказано, что при их росте в различных условиях цикл развития культур завершается образованием цистоподобных клеток (ЦПК), обладающих всеми признаками покоящихся форм прокариот. Для массового образования ЦПК в лабораторных культурах разработаны воспроизводимые условия, имитирующие природные. Эти условия принципиально применимы для получения покоящихся форм бактерий других таксонов с учетом специфики их ростовых потребностей.
Впервые показано внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий. Внутривидовое разнообразие проявляется как полиморфизм покоящихся клеток и зависит от условий их образования. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся клеток определенного морфотипа выражается в их разнокачественности по устойчивости к повреждающим воздействиям, отклику на условия прорастания и потребности в специальных процедурах реактивации. Показаны различия в способности покоящихся клеток разных типов к фе-
нотипической диссоциации. Расширены представления о функциях плотностных ауторегуляторов в процессах образования покоящихся форм. Продемонстрировано видонеспецифичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных ал-килоксибензолов при образовании: 1) жизнеспособных ЦПК; 2) не образующих колонии клеток и 3) нежизнеспособных микромумий. Показана принципиально сходная и видонеспецифичная функция алкилоксибензолов и неацилированного гомосеринлактона в ограничении роста численности клеток популяции и смене стадий развития бактериальных культур.
Для повышения эффективности экологического мониторинга разработаны диагностические критерии для обнаружения ЦПК в природных образцах in situ, в том числе глубокомерзлых осадках. Критерии основаны на учете особенностей ультраструктурной организации покоящихся форм и соотношения в них ряда биогенных элементов (Са/К, P/S). Для покоящихся форм, не образующих колонии на обычных средах, применены разные методы учета и приемы выявления жизнеспособных клеток за счет варьирования состава сред для снятия эффекта субстрат-ускоренной смерти и защиты от окислительного стресса. Показана возможность повышения чувствительности ПЦР при использовании покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) как источников матриц ДНК.
Постулируется, что внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий обеспечивает длительное, не сопоставимое со временем генерации клеток, выживание вида в природе при неблагоприятных для роста условиях и его расселение при наступлении ситуаций, предусматривающих возможность реверсии к росту.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для: 1) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов; 2) разработки способов получения длительно хранящихся стабильных бактериальных препаратов; 3) повышения эффективности экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга окружающей среды за счет учета покоящихся и не прорастающих на плотных средах клеток. Цистоподобные покоящиеся клетки сапротрофных аналогов патогенных бактерий рекомендованы для включения в тест-системы для проверки действия антимикробных агентов. Химические аналоги ауторегуляторных факторов (АОБ) испытаны в качестве новых биоцидов для защиты различных материалов от микробного разрушения, что оформлено в виде 2 заявок на патенты РФ. Личный вклад соискателя состоял в планировании и проведении исследований, разработке новых экспериментальных подходов, анализе полученных результатов и их оформлении для опубликования. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора состоял в непосредственном участии в определенных или всех эта-
пах исследования - от постановки задач и проведения экспериментов до обсуждения полученных данных и подготовки их к опубликованию.
Апробация работы. Устные и стендовые сообщения на конференциях: Frontiers of Life (Блуа, Франция, 2000); GeoExtreme Workshop (Тремити, Италия, 2001); Bacterial Paleontology/Astrobiology (Москва, 2002); Second European Workshop on Exo/Astrobiology (Грац, Австрия, 2002); European Geophysical Society (Ницца, Франция, 2003); 1st и 2nd FEMS Congress European microbiologists (Любляна, Словения, 2003; Мадрид, Испания, 2006); 35th Scientific Assembly COSPAR (Париж, 2004); Российско-французском семинаре «Восток 2005» (Репино); Open Science Conference SCAR-IASC-IPY (СПБ, 2008); «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (МГУ 2006; 2009). Публикации: 74 работы: 37 экспериментальных статей, 2 обзора (38 в списке журналов ВАК), 3 главы в монографиях, 5 работ в материалах научных мероприятий, 2 заявки на патент, 26 тезисов докладов.
Место проведения работы. Работа проводилась с 1994 по 2009 гг. в лаб. классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по плановым темам (№ гос/рег. 01200213054; 01200213058; 01200601980) при поддержке РФФИ (гранты 99-04-49144, 01-04-48771, 02-04-49150, 03-04-48403, 04-04-49710, 05-04-49520, 06-08-01469, 07-04-01011; 07-04-12121офи). Ряд исследований проведен в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, ИНБИ им. А.Н. Баха РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Университете им. М.Лютера (Халле-Виттенберг, Германия), ФГУП Гос-НИИОХТ, МИРЭА, КазНЦ РАН и Латвийском университете (Рига). Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность проф. Г.И. Эль-Регистан и чл.-корр. РАН В.Ф. Гальченко за постоянное внимание и поддержку. Искреннюю признательность за многолетнюю совместную работу выражаю сотрудникам ИНМИ РАН: А.Н. Козловой, Ю.А. Николаеву, Н.Г. Лойко, Е.В. Дем-киной, С.Н. Филипповой, Е.В. Менько, В.В. Сорокину, И.А. Цаплиной, Т.Н. Богдановой. За плодотворное и длительное сотрудничество выражаю особую признательность к.б.н. Н.Е. Сузиной и проф., В.И. Дуде (ИБФМ РАН), к.б.н. В.Н. Да-нилевичу (ИБХ РАН). Автор благодарен проф. Л.И. Воробьевой, B.C. Соиной и Е.А. Воробьевой (МГУ), проф. А.С. Капрельянц (ИНБИ РАН), д.б.н. Л.П. Анто-нюк (ИФБРМ РАН), Н.Б. Стражевской и проф. Р.И. Жданову (НИИ общей патологии и патофизиологии), проф. В.П. Тычинскому (МИРЭА), Ю.В. Гоголеву (КазНЦ РАН), Н.А. Тилькуновой и Д.Ю. Залепугину (ГосНИИОХТ), Ю.Н. Трофимовой (Латвийский университет) за совместные исследования. Выражаю при-
знательность д.г.-м.н. Д.А. Гиличинскому (ИБиФХПП РАН) за образцы вечно-мерзлых пород. Благодарю всех соавторов публикаций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 349 страницах текста и включает 86 рисунков и 51 таблицу; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы (100 русских и 628 иностранных наименований). Основные защищаемые положения:
