Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение принципов распознавания патогенов клетками макроорганизма, а также молекулярных механизмов активации последующих иммунных реакций, в настоящее время остается актуальной задачей. Важным событием, позволившим сделать значительный шаг в понимании этих механизмов, стало открытие около 20 лет назад первых представителей паттерн-распознающих рецепторов. Было установлено, что эти рецепторы, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, узнают не уникальные эпитопы антигенов, а определенные высококонсервативные молекулярные структуры (паттерны) (pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)), находящиеся в составе клеток патогенных организмов (Medzhitov R, et al., 2000).
К настоящему моменту у человека идентифицировано пять семейств паттерн-распознающих рецепторов: Toll-подобные рецепторы, лектиновые рецепторы С-типа, RIG-подобные рецепторы, NOD-подобные рецепторы, фикколины, а также пентраксины и коллектины, относимые к суперсемейству лектиновых рецепторов С-типа (Ковальчук Л.В. с соавт., 2011).
Связывание лигандов (PAMPs) с паттерн-распознающими рецепторами (PRR) инициирует запуск внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих, в конечном итоге, к активации ряда транскрипционных факторов (АР-1, NF-kB, IRF 3,5,7 и др.), определяющих развитие тех или иных реакций иммунной системы. Среди перечисленных транскрипционных факторов NF-kB играет одну из ключевых ролей в развитии реакций как врожденного, так и приобретенного иммунитета (Baeuerle Р.А., et al., 1994).
Одними из наиболее важных типов PRR в распознавании бактериальных патогенов являются представители семейства Toll-подобных и NOD-рецепторов. Лигандами мембраносвязанных Toll-подобных рецепторов являются молекулы различной химической природы и структуры, такие, как липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий, флагеллин, бактериальные липопептиды, бактериальная и вирусная ДНК и другие.
На сегодняшний день получено множество данных, доказывающих участие данных рецепторов в целом спектре иммунных реакций: усилении фагоцитоза, секреции антибактериальных пептидов, процессинге и презентации антигена дендритными клетками, активации зрелых Т-клеток, пролиферации и созревания В-клеток во время инфекции, прямой активации В клеток памяти и последующей продукции антител, в том числе IgG, и других (Palm N.W., et al., 2009).
Способность лигандов Toll-подобных рецепторов запускать различные реакции иммунной системы позволяет использовать данные молекулы в качестве .различных молекулярных адъювантов, средств немедленной защиты против инфекции и др. (Vijay-Kumar М., et al., 2008, Kaisho Т., et al., 2002).
Лигандами цитозольных NOD рецепторов являются различные молекулы, представляющие собой фрагменты пептидогликана грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Было показано, что минимальным фрагментом пептидогликана, достаточным для активации NOD 1-рецептора, является дипептид >-Glu-mDAP (ІЕ-DAP), присутствующий в составе клеточной стенки большинства грамотрицательных бактерий: Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica Typhimurium и др. (Girardin S.E.et al., 2003). Однако вклад других аминокислот и моносахаридов, входящих в состав пептидогликана бактерий различных видов, в активацию NOD 1-рецептора на сегодняшний день мало изучен. Кроме того, по сравнению с Toll-подобными значение NOD рецепторов в формировании защитных имагунных реакций и протективного иммунитета описано в значительно меньшей степени (Kobayashi K.S,etal.,2005).
Еще меньше данных получено при изучении совместного функционирования Toll-подобных и NOD рецепторов в распознавании целого патогенного микроорганизма и определение вклада того или иного типа патгерн-распознающего рецептора в формировании полноценного протективного иммунитета организма.
Изучение совместного функционирования мембраносвязанных Toll-подобных и цитозольных NOD рецепторов позволит не только идентифицировать фундаментальные механизмы функционирования данных рецепторов, необходимые для формирования полноценного протективного иммунитета, но и предоставит возможность создания на основе композиций лигандов паттерн-распознающих рецепторов целого спектра иммунобиологических препаратов: эффективных средств немедленной защиты от инфекции; молекулярных адъювантов в составе вакцин нового поколения и многих др.
Цель работы: Изучение NF-kB-активирующей способности NOD рецептора 1,
а также его роли в индукции иммунных реакций, включая участие в
формировании антибактериального иммунитета совместно с ТоП-подобными
рецепторами.
В процессе выполнения работ предстояло решить следующие задачи:
-
Провести сравнительный анализ различных видов бактерий с целью выявления наиболее эффективного продуцента лиганда NOD 1 рецептора.
-
Разработать технологию очистки лиганда NOD1 рецептора из наиболее эффективного бактериального штамма-продуцента.
-
Идентифицировать первичную структуру лиганда NOD1 рецептора, выделенного из бактериального штамма-продуцента.
-
Провести сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда NOD1 рецептора, выделенного из бактериального штамма-продуцента, с другими лигандами NOD1 рецептора с различной структурой в условиях in vitro.
-
Определить влияние совместной стимуляции NOD1 и Toll-подобных рецепторов на уровень активности транскрипционного фактора NF-kB в условиях in vitro и in vivo.
-
Определить влияние совместной стимуляции NOD1 рецептора и ТоЛ-подобного рецептора 5 на уровень секреции цитокинов в условиях in vivo.
-
Определить влияние совместной активации NODI и Toll-подобного рецептора 5 на формирование антибактериального иммунитета в условиях in vivo.
Научная новизна
впервые из Neisseria meningitidis серогруппы В была выделена молекула-лиганд NOD1 рецептора и идентифицирована ее первичная структура;
впервые был проведен сравнительный анализ NF-kB активирующей способности лиганда NOD1 рецептора, выделенного из Neisseria meningitidis серогруппы В, с другими лигандами NOD1 рецептора с различной структурой в условиях in vitro, а также впервые были определены характеристики (интенсивность, кинетика) NODl-опосредованной активации NF-kB в условиях in vivo;
впервые были определены различия в способности лигандов NOD1 и Toll-подобных рецепторов активировать NF-kB в условиях in vitro и in vivo;
впервые было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит к эффекту повышения (потенцирования) активации NF-kB по сравнению с изолированной стимуляцией данных паттерн-распознающих рецепторов в условиях in vitro и in vivo. Была показана зависимость данного эффекта от последовательности стимуляции указанных патгерн-распознающих рецепторов;
в условиях in vivo впервые было показано, что последовательная стимуляция NOD1 и TLR5 рецепторов приводит также к повышению (потенцированию) уровней секреции цитокинов в периферической крови и тканях тонкого кишечника;
впервые показано, что по сравнению с изолированной стимуляцией NOD1 и TLR5 рецепторов, последовательная стимуляция данных рецепторов увеличивает на 50% выживаемость животных при инфекции летальными дозами Salmonella enterica Typhimwium.
Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизма распознавания патогенов врожденной иммунной системой организма хозяина и последующем формировании иммунных реакций, но и в перспективе может иметь практическое применение. Полученные данные, показывающие эффект усиления реакций иммунного ответа организма при введении сочетаний лигандов патгерн-распознающих рецепторов, принадлежащих к различным семействам, могут быть использованы при создании многокомпонентных молекулярных адъювантов. Данные адъюванты могут применяться в составе более эффективных вакцин нового поколения совместно с протективными антигенами, обладающими низкой иммуногенностью (например, капсульним полисахаридом Neisseria meningitidis серогруппы В).
Результаты, полученные в данной работе, также могут быть использованы в применении комбинаций лигандов паттерн-распознающих рецепторов в качестве средств немедленной защиты от патогенных микроорганизмов. Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Использование тест-системы на основе эукариотических клеток человека линии HEK293-hNODl для определения биологической активности лигандов NOD1 рецептора». М.-2011, утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФЕБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России, протокол №15 от 14.07.11.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды», (Казань, 2009г.), а также на Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» имени академика В.И.Иоффе, (Санкт-Петербург, 2011г.).
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отдела «Медицинской микробиологии» и отдела «Генетики и молекулярной биологии бактерий» 16 июня 2011 г. ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздравсоцразвития России.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 2 статьи в сборниках Всероссийских конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», Выводы, Список используемой литературы (226 источников, из которых 9 отечественных и 217 иностранных). Работа содержит 3 таблицы и 28 рисунков.
