Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Моноклональные антитела к F1 и V антигенам Yersinia pestis для выявления возбудителя чумы Иващенко Татьяна Александровна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Иващенко Татьяна Александровна. Моноклональные антитела к F1 и V антигенам Yersinia pestis для выявления возбудителя чумы: автореферат дис. ... кандидата биологических наук: 03.02.03, 03.01.06 / Иващенко Татьяна Александровна;[Место защиты: Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии - Федеральное бюджетное учреждение науки], 2013

Введение к работе

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Возбудитель чумы (Yersinia pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов и единственный представитель бактерий, относящийся к возбудителям первой группы патогенности (Weekly epidemiological record, 2010).

В настоящее время возбудитель чумы обнаружен более чем в 200 видах диких грызунов, обитающих в очагах чумы на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды (Cui et al, 2008). Люди подвергаются инфицированию, вступая в контакт с зараженным животным. Чума может передаваться человеку при употреблении в пищу мяса инфицированных животных или при обращении с мясом инфицированных животных (Eppinger et al, 2010).

Патогенез чумы начинается с прикрепления бактерий к поверхности клеток-хозяев. После адгезии возбудитель очень быстро размножается. Бактерии в большом количестве вырабатывают факторы проницаемости, подавляющие фагоцитоз, такие как F1, V, рНб-Аг. Массивная антигенемия, выброс медиаторов воспаления, в том числе и шокогенных цитокинов, ведёт к развитию микроциркуляторных нарушений, ДВС-синдрома с последующим исходом в инфекционно-токсический шок (Bartra et al, 2008).

В связи с вышесказанным, быстрая индикация возбудителя способствует
оперативной организации и своевременному проведению

противоэпидемических мероприятий, а при необходимости - выбору правильной стратегии лечения.

Лабораторная диагностика чумы построена на детекции возбудителя и его дифференциации от других представителей рода Yersinia. Для этого в основном используются микробиологические, серологические и биохимические методы исследования. Однако нередко возникают проблемы детекции возбудителя чумы и его дифференциации от близкородственного возбудителя Yersinia pseudotuberculosis (Лебедева и др., 2010; Попов и др., 2009).

В связи с этим возникает необходимость в разработке новых экспрессных методов диагностики, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надёжности и лёгкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.

Видоспецифическим антигеном чумного микроба, на выявлении которого базируется диагностика чумы, является капсульный антиген F1. Однако хорошо известно, что в природе существуют штаммы Y. pestis не продуцирущие F1 антиген, но при этом сохраняющие вирулентность (Winter et al, 1960; Schofield et al, 2012). Данный признак указывает на то, что F1 антиген не всегда является идеальной мишенью для определения возбудителя. Другой антиген чумного микроба - V антиген (LcrV), представляющий собой полипептид с

молекулярной массой 37 кДа, кодируемый геном IcrV в составе оперона IcrGVH, расположенного на плазмиде кальцийзависимости pCad, присутствующей у всех патогенных для человека иерсиний (Anisimov et. al., 2010). У возбудителя чумы и псевдотуберкулеза эта генетическая структура имеет высокую степень гомологии (Roggenkamp et al., 1997; Bergman et al., 1991), но при этом выявлены как небольшие видовые, так и внутривидовые различия в ее структурной организации и фенотипическом проявлении (Сухоносов И.Ю. Автореф. дис. ... канд. мед. наук, 2008). V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis (Светоч Т.Э. Автореф. дис. ... канд. биол. наук, 2012) и может служить хорошей мишенью для индикации патогена.

Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Иммуноанализы на основе антител наиболее часто используемый тип диагностических тестов и остающийся одной из быстро развивающихся технологий при анализе биомолекул.

Одним из ведущих направлений в области совершенствования диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител (МКА), обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов (Andreotti et al., 2003). Использование МКА в диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МКА является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах (Абелев, 1998).

Цель исследования - создание высокочувствительных

иммунодиагностических тест-систем для выявления возбудителя чумы на основе специфичных МКА.

Задачи исследования

1. Получить панели гибридом, стабильно продуцирующие
высокоспецифичные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

2. Изучить специфическую и перекрестную активность полученных МКА
и оценить их диагностическую значимость в различных форматах
иммуноанализа: непрямого ИФА, «сэндвич-ИФА», дот-блот анализа.

  1. Разработать систему специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени при идентификации Y. pestis.

  2. Сконструировать диагностические тест-системы в формате латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа и хМАР-технологии.

Научная новизна

Получена и охарактеризована панель МКА к V и F1 антигенам чумного микроба. Подобраны диагностически значимые пары антител и показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем чумы.

Впервые с помощью метода атомно-силовой микроскопии разработана система специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях при идентификации Y. pestis.

Впервые в России получены и охарактеризованы системы на основе МКА в формате латекс-агглютинации и хМАР технологии для идентификации F1 антигена Y. pestis и ИФА для обнаружения V антигена Y. pestis.

Теоретическая и практическая значимость работы

  1. Получены и депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ - ОБОЛЕНСК») штаммы гибридных клеток - продуценты МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

  2. На основе МКА сконструированы высокоспецифичные лабораторные образцы диагностических тест-систем в формате латекс-агглютинации и хМАР-технологии.

  3. Изготовлены экспериментальные образцы иммуноферментной и латекс-агглютинационной тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.

  4. Получены 4 Патента на изобретение - № 2460787 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 10G4 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № 2460788 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 13F8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № 2478704 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2В8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis»; № 2478703 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 -продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis».

Методология и методы исследования

В работе использовались различные методы исследования: микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, латекс-агглютинация, иммуно-блот), микроскопические.

Положения, выносимые на защиту

  1. Полученные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis являются перспективными иммунореагентами и могут быть использованы в различных иммунологических тестах детекции возбудителя чумы.

  2. Использование метода атомно-силовой микроскопии позволяет визуализировать специфическое взаимодействие антиген-антитело на молекулярном уровне при выявлении Y. pestis.

3. Латекс-агглютинационная тест-система способна выявлять F1 антиген Y.
pestis
в чистых культурах чумного микроба в концентрации от 1х105 м.к./мл до
2х106 м.к./мл и выше и 4 нг/мл водорастворимого F1 антигена Y. pestis, что
подтверждает диагностическую эффективность набора.

4. Разработанная тест-система иммуноферментная моноклональная для
выявления V антигена Y. pestis характеризуется высокой чувствительностью
детекции V антигена 2 нг/мл и не выявляет клетки гомологичных

микроорганизмов в концентрации 10 м.к./мл и ниже.

5. Разработанная тест-система в формате хМАР технологии детектирует
капсульный F1 антиген как в буферном растворе (до 6 пг/мл), так и в сыворотке
крови (до 32 пг/мл), а также клетки возбудителя чумы в концентрации до
1x10 м.к./мл.

Степень достоверности и апробация результатов

Материалы диссертации изложены и представлены на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» ФБУН ГНЦ ПМБ, (Оболенск, 2010); III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2011г) (3-место в конкурсе молодых ученых); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», ФБУН ГНЦ ПМБ, (Оболенск, 2011); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2012г); 7-м Европейском конгрессе по тропической медицине и международному здравоохранению (Барселона, Испания, 2012г); V Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2013г).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 25 марта 2010 г., протокол №3, с изменениями, утвержденными Ученым советом от 11 сентября 2013 г., протокол №7.

Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ГНЦ ПМБ 4 июля 2013 г., протокол № 31.

Публикации

Результатом научной работы являются 11 публикаций по теме диссертации, включающие одну статью, опубликованную в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК, четыре Патента РФ на изобретение: №2460787 С1 РФ и № 2460788 С1 РФ от 28.07.2011; № 2478703 С1 РФ и № 2478704 С1 РФ от 20.12.2011) и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования с их обсуждением, заключение, выводы, список сокращений и список литературы, приложения Работа иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами. Приложения состоят из одной статьи, опубликованной по теме диссертации, четырех Патентов и протокола технических испытаний.

Похожие диссертации на Моноклональные антитела к F1 и V антигенам Yersinia pestis для выявления возбудителя чумы