Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител Федорова Валентина Анатольевна

Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител
<
Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Федорова Валентина Анатольевна. Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител : диссертация ... доктора медицинских наук : 03.00.07 / Федорова Валентина Анатольевна; [Место защиты: Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"].- Саратов, 2004.- 318 с.: ил.

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Крупные вспышки чумы, регистрируемые в течение последних лет в Танзании (1991 г.), Заире (1993 г.) и Индии (1994), появление нового, эпидемически опасного штамма Vibrio cholerae 0139 серовара, вызывающего массовую заболеваемость с высокой летальностью (Hall et al, 1993; Levisalles et al, 1993; Preston, 1993; Shimada et al, 1993; Albert et al, 1993, 1997; Kaper et ai, 1995; Fa-ruque et al, 1998; Basu et al, 2000; Steinberg et al, 2001; Смирнова, 2002), диктуют актуальность проведения научных исследований по совершенствованию диагностических и профилактических препаратов, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию этих инфекций.

В свою очередь конструирование высокочувствительных диагностических тест-систем и разработка эффективных химических вакцин невозможны без новых современных знаний об антигенах Yersinia pestis и V. cholerae 0139, имеющих ряд сходных признаков по структурной организации клетки (наличие капсулы и R-форма ли-пополисахаридов (ЛПС)) (Schutze, 1932; Burrows, 1963; Бахрах с соавт., 1967-1972, 1977; Вейнблат, 1972; Тараненко с соавт., 1972, 1973, 1977, 1988, 1990; Brabaker, 1972,2000; Waldor et al, 1994; Weintraub et al, 1994; Ломов с соавт., 1995; Kaper et al, 1995; Knirel et al, 1995, 1997, 2003; Nandy et al, 1995, 1999; Favre et al, 1996; Дома-радский, 1996, 1998; Skurnik et al, 1996; 1999-2002; Perry, Fetherston, 1997; Attridge et al, 2001; Смирнова, 2002; Gremyakova et al, 2002; Hoist, 2002; Prior et al, 2002; Vinogradov et al, 2002; Bruneteau, Minka, 2003; Oyston et al. 2003 и др.).

Несмотря на огромные достижения отечественных и зарубежных ученых в молекулярной микробиологии и биохимии чумного микроба и холерного вибриона, имму-нохимические свойства многих известных антигенов изучались в малочувствительных по современным представлениям серологических реакциях и опосредованно с помощью рекомбинантных штаммов, что позволяет лишь косвенно судить о биологических функциях полипептидов или полисахаридов в естественных природных условиях, поскольку наличие того или иного гена не всегда коррелирует с проявлением экспрессируемого им признака in vivo.

С появлением гибридомной технологии и новых эффективных методов иммуно-

химического анализа стало возможным изучение структурных особенностей антиге-

'ТоС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА 1

нов полипептидной и углеводной природы на молекулярном уровне (Douglas et al, 1988; Ezzdietal, 1990; Алексеева с соавт, 1991, 1993, 1998,2001, 2002; Храпова с со-авт., 1991, 1994, 1996; Бичуль, 1993; Garg et al, 1994; Helmerhorst et al, 1998; Suss-kind et al, 1998; Rivera-Betancourt, 2000; Prior, Titball, 2002; Heagy et al, 2003; Mitov et al, 2003; Monreal et al, 2003; Ogawa et al, 2003; Someya et al, 2003 и др.). В первую очередь это касается такого сложноорганизованного антигена, как капсульный антиген (К-антиген) чумного микроба (Ф1). В частности, остаются не до конца выяснены вопросы о связи его серологической активности с конкретными антигенными компонентами, особенности фолдинга белка Ф1 у штаммов Y. pestis с Fra± фенотипом, причины кросс-реактивности полученных к нему сывороток.

Другим, имеющим диагностическую значимость, видоспецифическим антигеном чумного микроба является фибринолизин (активатор плазминогена), синтез которого детерминируется уникальной для возбудителя чумы плазмидой пестициногенности (Вейнблатссоавт., 1984, 1988-1991; Титенко, 1985; McDonough, Falkow, 1989; Булгакова с соавт., 1991; Попов с соавт., 1991; Lahteenmaki et al, 2001). Проявление чумным микробом фибринолитической активности, как правило, коррелирует со способностью Y. pestis к коагуляции плазмы (Квашнина, 1941, 1959; Домарадский с соавт., 1960, 1963, 1996, 1998; Яромюк, 1964; Brubaker et al, 1965; Beesley et al, 1967 и др.), -а участвующие в реализации данного процесса антигены - фибринолизин и коагулаза охарактеризованы как полипептиды с м.м. 37 и 35 кД, соответственно (Cavanough, 1971; McDonough, Falkow, 1989; Straley, Brubaker, 1982; Sodeinde et al, 1988, 1989; Булгакова, 1991; Лупикова с соавт., 1992; Домарадский, 1996, 1998; Perry, Fetherston, 1997; Brubaker, 2000; Lahteenmaki et al, 2001; Goguen, 2002). Однако несмотря на значительное количество научных разработок, до сих пор не установлено, один или оба белка определяют фибринолитическую и коагулазную активности возбудителя чумы.

Широко используемая в лабораторной диагностике серологическая дифференциация бактерий по химической структуре ЛПС (Davies, 1960; Luderitz et al, 1966, 1968; Jann, Westphal, 1975; Овчинников, 1979; Захарова, 1980; Яровая, Алешкин, 1991; Книрель, Кочетков, 1993; Whvtfield et al, 1995, 1997; Hoist et al, 1996, 1998, 1999, 2002; Rietschel et al, 1996; Raetz, Whitfield, 2002 и др.), а также данные о способности моноклональных антител (МКА) к ЛПС Y. pestis выявлять все штаммы чумного микроба независимо от наличия или отсутствия собственных плазмид и температуры

5 культивирования (Дсвдариани, 1993) предопределяют актуальность, теоретическую и практическую значимость исследований по определению с помощью современных информативных методов иммунохимического анализа родо- и видоспецифических антигенных детерминантов Л ПС, а также изучению антигенной структуры входящего в его состав липида А и другого полисахаридсодержащего препарата чумного микроба - основного соматического антигена (ОСА) (Дальвадянц, 1968; Бахрах с соавт., 1969, 1970, 1972, 1973, 1977; Боровикова, 1972; Вейнблат с соавт., 1972, 1989, 1991 и

ДР-)-

Как известно, ведущую роль в проявлении чумным микробом вирулентных

свойств большинство исследователей связывает с наличием в его геноме плазмиды Са2+-зависимости (pCad), детерминирующей синтез ряда продуктов, в частности, белков наружной мембраны (БНМ) или Yops (Brubaker et al, 1979, 1991, 2000; Straley, Bowmer, 1986; Bolin, Wolf-Watz, 1988; Cornells et al, 1989, 1997, 1998,2002; Bliska et al, 1990; Видяева, 1992; Кутырев, 1992; Микеров, Кутырев, 1997 и др.), часть из которых обладает протективными свойствами (Burrows, 1963; Brubaker, 1991; Kutyrev et al, 1994; Leary et al, 1995, 1997, 2001; Nakajima et al, 1995; Williamson et al, 1995, 1997, 1999,2001; Anderson et al, 1996; Health et al, 1996; Andrews et al, 1999; Titball et al., 1999, 2000,2002; Jones et al, 2002 и др.)- Несмотря на огромный интерес исследователей к ним, сравнительное изучение иммуногенных свойств отдельных антигенов проводилось косвенно на моделях других бактерий с клонированными генами pCad Y. pestis в связи с трудностями выделения антигенов в чистом виде (Brubaker et al, 1987; Sample, Brubaker, 1987; Sodeinde et al, 1988; Заренков с соавт., 1991; Шмелев с соавт., 1991; Leary et al, 1997; TitbaU et al, 1997,1999,2001,2002 и др.). К тому же, даже при щадящих методах экстракции, изолированные из цельного микроорганизма антигены могут полностью или частично утрачивать свои нативные свойства.

Для преодоления этих препятствий в настоящее время весьма перспективно применение антиидиотипических антител (АИТ), сохраняющих функциональную, серологическую и иммунобиологическую активности исходного антигена и позволяющих проводить изучение его свойств в условиях, максимально приближенных к естественному состоянию in vivo (Amit et al, 1986; Bona, 1988; Anders et al, 1989; Araga, 1993; Field et al, 1993; Fernandez et al, 1994, 2001; Koliakos et al, 2002). He менее актуальна разработка на их основе экспериментальных антиидиотипических вакцин

(Bona, Moran, 1985; Chanh et al, 1990; Raychaudhuri et al, 1990; Beatty, 1992; Sutherland et al, 1993; Herlyn et al, 1995; Spertini et al, 1999; Basak et al, 2000; Le Poole et al, 2002; Magliani etal, 2003 и др.).

Поскольку капсульныс антигены (К-антигены) большинства грамотрицательных бактерий обладают выраженными протективными свойствами и высокой специфичностью, представляет несомненный интерес выделить К-антиген из V. cholerae 0139 серовара и изучить его иммунохимические и иммунобиологические свойства- Сведения о неэффективности существующих холерных вакцин против V.cholerae 0139 (Chongra-nguan et al, 1993; Levisalles, 1993; Ramamurthy et al, 1993; Kaper et al, 1995; Favre et al, 1996; Faruque et al, 1998) придают особую важность исследованиям в. этом направлении.

Не менее актуальными являются исследования по изучению структурной организации ЛПС V. cholerae 0139, выявлению различий в иммунореактивности этого антигена у исходных и диссоциированных вариантов вибрионов со сниженной вирулентностью, а также попытки экспериментально обоснованного получения моноспецифических неадсорбированных антител, пригодных для разработки экспресс-методов индикации возбудителя холеры 0139.

ЦЕЛЬЮ ИССЛЕДОВАНИЯ является получение новых сведений об антигенной структуре возбудителей чумы и холеры с помощью современных методов иммунохи-мического анализа с применением поликлональных, моноклональных и антиидиоти-пических антител, а также экспериментальное обоснование возможности их практического применения.

  1. Получить панель МКА для изучения антигенной структуры возбудителя чумы и разработки на их основе экспериментальных диагностических тест-систем нового поколения.

  2. Изучить природу антигенных детерминантов, определяющих серологическую активность Ф1 чумного микроба, особенности фолдинга белкового компонента капсулы у штаммов Y.pestis с Frafc фенотипом с использованием современных методов иммунохимического анализа и разработать методические подходы для их выявления.

  1. Определить общие и специфические эпитопы углеводсодержащих антигенов возбудителя чумы (ЛПС и ОСА) с использованием набора поли- и моноклональных антител.

  2. С помощью панели МКА изучить иммунохимические особенности фибриноли-зина Y.pestis и возможности использования моноклональных иммуноглобулинов в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном анализах для детекции штаммов чумного микроба, содержащих pPst.

  3. Определить спектр полипептидов, детерминируемых pCad Y. pestis, у возбудителя чумы, выращенного в условиях их максимальной экспрессии. Получить панель поли- и моноклональных антител к белкам, кодируемым pCad чумного микроба, провести сравнительное изучение иммуногенных свойств и диагностической значимости отдельных антигенов с помощью методов иммунохимического анализа.

  4. Получить АИТ к отдельным антигенам чумного микроба и экспериментально -обосновать перспективу их применения для разработки профилактических и диагностических медицинских иммунобиологических препаратов.

  5. Определить видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды путем сравнения электрофоретических профилей клеточных лизатов V. cholerae 01 и не 01 се-рогрупп (в частности, V. cholerae 0139), по наличию или отсутствию которых возможно проведение дифференциации штаммов холерных вибрионов на этапах идентификации выделенных культур.

  1. Изучить иммунохимические свойства ЛПС, экстрагированных из холерного вибриона 0139 серовара различными методами, и получить моноспецифические не-адсорбированные поликлональные антитела, пригодные для его обнаружения в иммуноферментном анализе.

  2. Разработать на основе антикапсульных антител к V. cholerae 0139 методический подход, позволяющий дифференцировать вирулентные и слабовирулентные штаммы этого возбудителя. Изучить протективные свойства К-антигена и обосновать принципиальную возможность его использования в качестве потенциального компонента химической холерной вакцины.

10. Разработать принципы гибкой технологии изготовления как моно-, так и поли-
клональных иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с ис-

пользованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей BALB/c.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые с использованием гибридомной технологии и оригинальных методов скрининга антите-лопродуцирующих гибридом получена уникальная панель моноклональных антител для изучения антигенов возбудителя чумы, кодируемых как хромосомными, так и плазмидными генами.

С помощью антител различной специфичности и современных методов иммуно-химического анализа установлены гликопептидная природа и конформационная зависимость антигенного детерминанта, определяющего серологическую активность Ф1 чумного микроба. Новыми являются сведения о способности углеводного компонента этого антигена возбудителя чумы вызывать продукцию антител у лабораторных животных.

Представлены экспериментальные доказательства исключительной роли СаПМ в доставке Сап на клеточную поверхность Y. pestis, но не в процессе фолдинга мономеров Ф1.

Новыми являются установленные с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа и иммуноблота, основанных на использовании поли- и моноклональных антител, сведения о наличии у полисахарида кора ЛПС чумного микроба как специфических для коровой части антигенных детерминантов, так и общих с липидом А и ОСА эпитопов.

Впервые обнаружены и изучены иммунобиологические свойства у ряда ранее не описанных белков, детерминируемых pCad чумного микроба, при культивировании в условиях их максимальной экспрессии. Получена панель гибридом-продуцентов МКА с различной специфической активностью, направленных к отдельным антигенным детерминантам белков, кодируемым указанной плазмидой Y. pestis. С их помощью подтверждена устойчивость V антигена к протеолитической деградации под влиянием фибринолизина, а также наличие у белков с м.м. 25±2,54±2, 72±2 и 87±2 кД кросс-реактивных эпитопов. Доказано существование YopE в виде сложноорганизо-ванного антигена, состоящего из нескольких субъединиц белковой природы со сходными свойствами, наиболее важными из которых являются высокая иммуногенность и отсутствие деградации под действием фибринолизина.

Впервые с использованием сложной оригинальной системы скрининга гибридом, основанной на функциональных и антигенных свойствах фибринолизина чумного микроба, получена панель МКА различной специфичности. С помощью МКА показана иммунохимическая идентичность фибринолизина и коагулазы Y. pestis. Доказано существование этих субстанций у возбудителя чумы в виде бифункционального белка с двумя ферментативными активностями, проявление которых индуцируется температурой культивирования чумного микроба.

Экспериментально на модели возбудителя чумы подтверждена теория идиотипи-ческих сетей N. Jeme (1974). Впервые получены и охарактеризованы по иммунохими-ческому, иммунологическому и функциональному критериям АИТ к отдельным антигенам чумного микроба. Установлено, что АИТ к ЛПС Y. pestis имеют выраженный адъювантный эффект без токсических проявлений у иммунизированных животных, характерных для исходного препарата, а АИТ к белкам, кодируемым pCad, с м.м. 25±2, 87±2 кД и YopE обладают высокой специфической иммуногенностью, сопоставимой с уровнем протективной активности соответствующих полипептидов. Показана перспективность использования АИТ не только в роли эффективного инструмента изучения антигенной структуры бактерий, но и в качестве основных специфических компонентов для разработки экспериментальных диагностических и профилактических иммунобиологических препаратов.

Впервые для выделения К-антигена из капсулообразующего нового эпидемически значимого 0139 серовара холерного вибриона использован метод, эффективный при экстракции, капсульной субстанции из культуральной жидкости биомассы чумного микроба (Вейнблат с соавт., 1980), который позволил получить приоритетные данные о присутствии в капсульном веществе V. cholerae 0139 наряду с углеводным компонентом двух иммунореактивных полипептидов с м.м. 38±2 и 61±2 кД. При этом установлено, что протективные свойства К-антигена не связаны с его белковым компонентом, а обусловлены капсульным полисахаридом. Иммуногенность последнего по отношению к гомологичному серовару избирательна в отличие от ЛПС, выделенного из биомассы клеток V. cholerae 0139, обладающего одинаковой протективной активностью как при заражении возбудителем холеры Эльтор, так и V. cholerae 0139.

Впервые научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность разработанного нами методического подхода по получению препаративного количе-

ства мышиных моноспецифических поликлональных антител к ЛПС V. cholerae 0139, не нуждающихся в дополнительной адсорбции близкородственными по антигенной структуре гетерологичными микроорганизмами. Благодаря использованию оригинального способа экстракции получены новые данные о выраженных антигенных свойствах липида А V. cholerae 0139 и изучена специфичность полученных к нему антител. Впервые идентифицированы видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды холерного вибриона при сравнительном изучении электрофоретических профилей различных представителей рода Vibrio.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Получен оригинальный набор линий лимфоид-ных гибридных клеток, продуцирующих МКА к белковым и углеводсодержащим антигенам Y. pest is. Эти антитела могут быть использованы для конструирования диагностических тест-систем, а также изучения иммуно- и патогенеза чумной инфекции.

Предложено несколько методических подходов для индикации и идентификации штаммов чумного микроба с Frat-фенотипом, не требующих разработки специальных диагностических препаратов для обнаружения так называемой "атипичной" капсулы ("атипичного" К-антигена): 1. Разрушение идентифицируемых клеток Y.pestis лизи-рующим буфером с последующим определением Ф1 соответствующими коммерческими диагностическими препаратами; 2. Использование для индикации иммунофер-ментных тест-систем, основой которых являются МКА к другому видоспецифиче-скому антигену - фибринолизину/плазмокоагулазе; 3. Применение для обнаружения таких штаммов моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к ЛПС чумного микроба или аналогичной иммуноферментной тест-системы.

Подтверждена более высокая серологическая активность и специфичность К-антигена чумного микроба, выделенного из культуральной жидкости методами В.И. Вейнблата с соавт. (1980) и Л.Н. Сердобинцева с соавт. (1983) в сравнении с традиционным способом его экстракции из клеточной биомассы Y. pestis по Е. Baker et at. (1952), который по настоящее время используется в технологии получения соответствующих чумных гипериммунных сывороток.

Впервые на основе МКА к видоспецифическому антигену фибринолизи-ну/коагулазе чумного микроба разработаны и успешно испытаны в лабораторных условиях экспериментальные диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины и иммуноферментная тест-система, способные выявлять штаммы Y. pestis, содержащие

плазмиду пестициногенности, независимо от температуры культивирования бактерий и не дающие положительных реакций с гетерологичными микроорганизмами, в том числе другими патогенными иерсиниями.

С использованием моноклональных иммуноглобулинов к антигенным детерминантам ЛПС Y.pestis, кодируемого хромосомными генами (Девдариани, 1993), сконструирован сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для обнаружения типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы независимо от отсутствия или наличия в них собственных плазмид. Апробация указанного варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) на большом наборе природных и генно-инженерных штаммов возбудителя чумы свидетельствует о высокой практической значимости ан-тилипополисахаридных МКА, как универсальных диагностических реагентов с широким диапазоном действия, несмотря на перекрестную реактивность только с от-дельнымипредставителямивида Y.pseudotuberculosis.

Обнаружен ряд новых полипептидов, кодируемых pCad чумного микроба, обладающих не только антигенными, но и достаточно выраженными защитными свойствами, которые, в дополнение к протективному белку YopE, могут быть использованы при создании чумных химических вакцин.

Разработана стратегия иммунизации лабораторных животных для индукции АИТ к антигенам чумного микроба. Доказана принципиальная возможность применения АИТ для создания противочумных вакцин нового поколения, не содержащих материала патогена и обладающих выраженными превентивными свойствами. Экспериментально обосновано новое перспективное научно-практическое направление в конструировании медицинских иммунобиологических препаратов с использованием АИТ как аналогов диагностически значимых антигенов.

Установлена достоверно более высокая протективная активность К-антигена в сравнении с ЛПС V. cholerae 0139 при заражении аутбредных мышей гомологичным серовариантом. Полученные результаты позволяют рекомендовать первый из названных антигенов для создания химической вакцины против заболеваний, вызываемых V.cholerae0139.

Предложен способ дифференциации вирулентных и слабовирулентных штаммов V. cholerae 0139, основанный на разной степени активности меченных пероксидазой антикапсульных антител при постановке иммуноферментного анализа с капсулиро-

ванными (мутные колонии) и лишенными капсулы (прозрачные колонии) штаммами V.choleraeO 139.

С помощью иммунохимических методов анализа доказана серологическая идентичность энтеротоксинов (XT) холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Эти данные имеют практическое значение при разработке универсальной химической вакцины против холеры, обязательным компонентом которой является специфический анатоксин.

Впервые в мировой практике получены с использованием биохимически очищенных антигенов и линейных мышей BALB/c неадсорбированные поликлональные антитела к ЛПС и К-антигену холерного вибриона 0139 серовара, не дающие перекрестных серологических реакций с гетерологичными микроорганизмами и вибрионами других серогрупп в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа.

Разработаны принципы гибкой технологии изготовления иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с использованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей BALB/c.

По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены:

- Программа комиссионного испытания иммуноглобулинов диагностических чумных
флуоресцирующих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором
ВНИПЧИ "Микроб" 22.05.90 г.);

- Регламент производства "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие
чумные антикапсульные моноклональные сухие" № 11-86(90);

Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических мо-ноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб", протокол № 21 от 2.11.90 г.);

Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических моноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб", протокол № 21 от 2.11.90 г.);

Методические рекомендации по обнаружению типичных и атипичных штаммов, чумного микроба в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИП-ЧИ "Микроб", протокол № 3 от 4.03.94 г.);

Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания капсульного антигена и липополисахарида Vibrio cholerae OI39 серовара на этапах

экспериментального производства химической холерной вакцины (Утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб", протокол № 5 от 20.06.97 г.);

Методические рекомендации по обнаружению штаммов Vibrio cholerae 0139 серо-вара в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб", протокол № 6 от 10.10.97 г.);

Штамм гибридных клеток Yp.LPS.A6.Sp, продуцирующих моноклональные антитела к ЛПС Y. pestis, депонирован в Российской коллекции клеточных культур в институте цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург) 04.12.89 г. под номером ВСКК(П) 426Д;

Усовершенствованные методические приемы по гибридомной технологии включены в соответствующий раздел методического пособия для врачей и биологов "Методические приемы при работе с возбудителями инфекционных болезней бактериальной природы І—И групп патогенности", которое утверждено пленумом Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ 31.10.2001г.

Теоретические и практические результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, используются при чтении лекций по иммунологии чумы и холеры и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ "Микроб" с 1989 г. по настоящее время.

Похожие диссертации на Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител