Введение к работе
Актуальность проблемы
Среди особо опасных инфекций бактериальной природы, в последние годы привлекающих большое внимание ученых, выделяются возбудители чумы, холеры и сибирской язвы, унесшие миллионы жизней в периоды пандемий и эпидемий. Пристальное внимание к этим биологически опасным агентам вызвано как постоянно существующей угрозой возникновения этих заболеваний на территории России, так и довольно высокой вероятностью использования их в качестве орудия биотерроризма.
Следует отметить, что в освещении патогенеза заболеваний, вызванных возбудителями чумы, холеры и сибирской язвы, важное место занимают знания об особенностях их строения и механизмах их взаимодействия с макроорганизмом. Для понимания этих процессов целесообразно привлечение современных экспериментальных подходов.
Перспективными являются подходы, позволяющие получать новые данные о субклеточном строении бактерий при их трехмерной визуализации. Так, использование современных информационных технологий в медицине и биологии существенно расширяет возможности традиционных способов изучения микромира: позволяет получать новую информацию об объекте исследования, осуществлять моделирование микрообъектов живой природы с сохранением их истинных размеров и форм, проводить компьютерную видовую диагностику в трехмерном режиме и накапливать информацию об их биоразнообразии [Verbeek F.J., 2002].
Создание системы экспериментальных подходов трехмерной ультраморфологии дает возможность получать, хранить и анализировать информацию о форме, рельефе поверхности и пространственных параметрах бактерий. Изучение ультраструктуры микроорганизмов необходимо, в первую очередь, для определения их приспособительной изменчивости, функциональной морфологии, поисков новых ключевых признаков и экологии микромира [Золотарев А.Г. с соавт., 2006; Gonzalez R.C. et al., 1992]. Имеющиеся сведения по морфо-функциональному анализу бактериальных клеток показывают, что они являются сложными высокоспециализированными организмами, способными к адаптации в окружающей среде и коллективному взаимодействию с другими макро- и микроорганизмами [Олескин А.В. с соавт., 2000; Shapiro J.A., 1998; Miller М.В. et al., 2001; PalkovaZ. et al., 2006; Ben-Jacob E., 2008].
Для полного понимания сложных пространственных механизмов и процессов, происходящих в клетке на ультраструктурном уровне, необходима визуализация и изучение ее трехмерной морфологии с высоким разрешением [Russ J.C., 1995]. Построение специализированной информационной системы для воссоздания цифровых трехмерных моделей микрообъектов живой природы является весьма актуальной задачей.
Однако в направлении трехмерного моделирования биологических ультраструктур имеется много нерешенных задач. В частности, не отработаны алгоритмы восстановления структур по серийным срезам, нет автоматизации процесса построения изображений, снижения его сложности и трудоемкости [Пучков Е.О., 2010; Loebl J., 1985; Soille P., 2004].
Все это привело к тому, что на сегодняшний день получены приближенные трехмерные изображения только нескольких видов микроорганизмов - дрожжевых клеток, кишечной палочки [Milliard А., 2007; Gonzalez R.C., 2008]. По имеющимся литературным данным и источникам Internet в настоящее время нет сведений об исследовании тонкой трехмерной структуры бактерий особо опасных инфекций.
Известно, что поверхностные структуры микроорганизма определяют характер его взаимодействия с макроорганизмом, обеспечивая развитие инфекционного или иммунного процесса. Кроме того, поверхностные структуры принимают участие в соединении с абиотической поверхностью, что способствует выживанию патогенов при нахождении вне живого организма [Кутырев В.В.с соавт., 2007; Mesnage S. et al., 1998; Faruque S.M. et al., 2008]. Это обстоятельство способствует повышению интереса к изучению поверхностных структур возбудителей особо опасных инфекционных болезней, тем более что в настоящее время появились новые методические подходы для их изучения с помощью электронной и зондовой микроскопии.
При подготовке высококачественного материала к электронно- и зондово-микроскопическим исследованиям требуется большое количество обязательных приемов, что приводит к потере значительного числа изучаемого материала, поэтому совершенствование технических приемов особенно актуально в связи с перспективами практического применения и возможностью максимального сохранения его ультраструктуры.
Таким образом, проведение комплекса работ, включающих создание устройства подготовки сверхмалого количества биологического материала для электронно-микроскопического исследования, разработку компьютерно-математического алгоритма для трехмерного моделирования клеток возбудителеі чумы, холеры и сибирской язвы, является актуальной задачей.
Цель работы - разработка методических подходов к изучению трехмерноі тонкой морфологии клеток возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы на баз< создания компьютерно-математического алгоритма обработки изображений исследование их поверхностных ультраструктур.
Задачи исследования:
1. Разработать устройство для подготовки сверхмалых количеств про- і
эукариотических клеток для исследования с помощью электронного микроскопа.
-
Создать компьютерно-математический алгоритм обработки изображениі бактериальных микроструктур и программное обеспечение для последующего и: использования в трехмерном моделировании.
-
Визуализировать ультраструктуры чумного микроба, холерного вибриона і возбудителя сибирской язвы методом трехмерного моделирования.
4. Определить возможности вейвлет-анализа с целью увеличени
разрешающей способности и контрастности электронных и зондовы
микроскопических изображений.
-
Показать особенности трехмерной ультраструктуры капсулы чумног микроба методом сканирующей зондовой микроскопии.
-
Выявить структуру экзополисахаридного слоя (капсулу) холерног вибриона электронно-гистохимическим методом.
7. Изучить субмикроскопическую морфологию S-слоя возбудителей чумы и сибирской язвы методами электронной и зондовой микроскопии с применением компьютерно-математических преобразований.
Научная новизна
Разработано устройство (фторопластовый контейнер) для концентрации, фиксации, последующей обработки и заливки в эпоксидную смолу малого количества (несколько десятков) клеток для последующего изучения их ультраструктуры (патент на полезную модель РФ № 40318 от 10.09.2004 г.).
На основе серийных ультратонких срезов бактерий и полученных электронограмм, разработана структура программного обеспечения ЭВМ, способствующая моделированию тонкой трехмерной морфологии клеток. Программа автоматического построения изображений бактерий имеет современный интерфейс, позволяет поворачивать изучаемый объект на произвольно выбранный угол в произвольной плоскости.
Проведена реконструкция трехмерной структуры бактериальных клеток на основе методического подхода к данным электронограмм трансмиссивного электронного микроскопа и разработанного компьютерно-математического алгоритма.
Впервые получены трехмерные изображения поверхностных и внутренних тонких структур бактерий чумы, холеры и сибирской язвы с высоким пространственным разрешением с помощью программы для моделирования бактериальных клеток.
Создана программа проведения фильтрации от различного уровня загрязнений и шумов (свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ -№ 2005610679 от 22.03.2005 г.), позволяющая увеличить разрешающую способность и контрастность электронно-зондовых изображений бактерий, макромолекул (ДНК), на основе вейвлет-анализа.
С помощью сканирующей туннельной микроскопии капсульного антигена - FI (капсулы) чумного микроба впервые показана его ультраструктура в виде геля размерностью частиц 50 нм, с упорядоченным поверхностным и внутренним строением по типу трехмерной пространственной решетки, выполняющей функцию дополнительной «мембраны» клеточной стенки.
Электронно-гистохимическим методом выявлен экзополисахаридный слой бактерии у клеток О-клонов холерного вибриона классического биовара. На поверхности колонии указанных клонов методом сканирующей электронной микроскопии показано присутствие рыхлого слоя.
Показано наличие упорядоченной структуры S-слоя клеточной поверхности чумного микроба методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что изолированный белок формирует пластинчатые структуры с кристаллоподобной поверхностью.
С помощью трансмиссионного электронного микроскопа, в негативно окрашенных препаратах, визуализирована ультраструктура белков S-слоя (Sap и ЕА1) сибиреязвенного микроба, которая представлена в виде решетчатых структур размерами 7-9 нм с наклонной симметрией. Впервые продемонстрированы методом прямого преобразования Фурье их скрытые изображения со строго выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.
С помощью атомно-силовой микроскопии дана субмикроскопическая морфологическая характеристика белков Sap и ЕА1 сибиреязвенного микроба в виде параллельных рядов упорядоченных линейных цепочек размерами кластеров 2-3 нм и 7-8 нм соответственно.
Практическая значимость
Разработан способ обеззараживания микроорганизмов I—IV групп патогенности для исследования методом сканирующей зондовои микроскопии (Акт комиссионных испытаний утвержден директором РосНИПЧИ «Микроб», 2009 г.). Данный способ применяется в отделе диагностики инфекционных болезней ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при приготовлении препаратов для зондовои и атомно-силовой микроскопии.
Применяется на практике: «Устройство для концентрации сверхмалого количества клеток при приготовлении электронно-микроскопических препаратов» в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» и Учреждении Российской академии наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» (Акт от 28 июня 2010 г.).
Создана программа для реконструкции трехмерной организации клеточных наноструктур и оценки качества полученного изображения. Она максимально автоматизирована, проста в использовании и не требует вмешательства высокопрофессионального оператора, может использоваться для прикладных и фундаментальных исследований. Программу используют в учебном процессе кафедры программного обеспечения вычислительной техники и автоматических систем Саратовского государственного технического университета (Акт от 29 июня 2010 г.).
Материалы диссертации используют в учебном процессе на курсах профессиональной переподготовки и повышении квалификации специалистов отдела образовательных программ и подготовки специалистов ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Акт от 2 июля 2010 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработано устройство, позволяющее проводить электронно микроскопическое исследование сверхмалого количества клеток.
-
Комплексный методический подход, созданный на основе трансмиссионньг электронных изображений серийных ультратонких срезов, и разработанно программное обеспечение позволяют воссоздать трехмерное изображение бактериі чумы, холеры и сибирской язвы с высоким пространственным разрешением.
3. Компьютерно-математическая обработка и фильтрация изображений
помощью ортогональных и стационарных вейвлетов Добеши и Фурье
преобразований увеличивает разрешающую способность электронограмм і
сканограмм.
4. Выявлены особенности субмикроскопической морфологии капсулі
бактерий чумы и холерного вибриона, а также трехмерной организации S-сло
Y. pestis и В. anthracis при использовании трансмиссионной и растровой электронно:
микроскопии, сканирующей зондовои микроскопии и электронно-гистохимически
методов.
Апробация работы
Результаты работы доложены и представлены на ежегодных итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (2002, 2003, 2005, 2006-2009 гг.), ежегодных симпозиумах и конференциях по электронной микроскопии Российской Академии наук в г. Черноголовка (2000, 2002, 2005, 2007-2009 гг.). Работа выполнялась в рамках тем: «Создание диагностических и профилактических препаратов нового поколения, на основе модифицированных биологически активных веществ возбудителей ООИ» НИОКР 34-03.08 и «Конструирование современных средств специфической профилактики и иммунодиагностики сибирской язвы» НИОКР 41-33.09.
Публикации
Основное содержание диссертации отражено в 23 научных работах, из которых 5 опубликованы в рекомендованных ВАК РФ изданиях.
Структура и объём диссертации
Диссертация представлена на 115 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 38 рисунками. Библиографический указатель содержит 147 работ, в том числе - 94 иностранных.
