Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди особо опасных болезней чума, холера и сибирская язва до настоящего времени имеют немаловажное значение в инфекционной патологии человека (Jakab Z., 2007) и довольно широко распространены, продолжая представлять актуальную проблему здравоохранения и ветеринарии (Витязева С. А., 2009; Ерошенгаз Г.А., 2008; Иванова СМ., Новиков Н. Л., Фонарева К.С. и др., 2007; Кутырев В.В» 2008; Марамович А.С., Косилко С.А., ИнокснтьеваТ.И. и др., 2008; Нефедов К.С., 2009; ТерешкинаН., ДевдарианиЗЛ., 2008; Топорков В.П., Величю Л.Н., Шиянова А.Е. и др., 2008; Brachman P.S., 1,970; HauwaertTh., 2002; Hu^i-Jones М.Е., 2003; Marandian M.N., Kamali A., 1981; Pini P., 1996; Sirisanthana Т., Navachareon N., Tharavichitkul P. et al., 1984).
Существует вероятность использования возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы в качестве биологического оружия (Касина И.В., Саяпина Л.В., Анисимова Т.И. и др., 2006; Нетесов СВ., Сандахчиев Л.С., 2004; Ashford D.A., Whitney Е., Fischer М. et al., 2003; Berche P., 1998; Deroin Ph, 2001; Heselson N., Guilemin J., Hugh Jones M. et al., 1993; Lamb A., 2001; Nilson S.L., 1991; Perkins В., 2003; Phillips A.P., Dando MR., 1995).
Актуальными остаются работы по дальнейшему изучению вышеуказанных патогенных микроорганизмов (Агафонова В.В., 2009) и созданию Эффективных новых, а также совершенствованию существующих средств диагностики вызываемых ими инфекций и мер их специфической профилактики (БугОркова С.А., За-думина СЮ., Бугоркова Т.В. и др., 2008; Когстгава О.И., Тюменцева И.С, Афанасьев ЕЛ. и др., 2006; Маринин ЛИ., Тюрин ЕЛ., 2007). Мониторинг и бактериологическая диагностика особо опасных инфекций, генетические исследования (Srivastava P., Chattoraj D.K., 2007), производство разнообразных медицинских и ветеринарных препаратов - вакцин, диащосгикумов, иммунных, сывороток и т.п. (Волох О.А., Шепелев ИЛ., Заднова СП- и др., 2008) подразумевает использование большого количества питательных сред.
В связи с высокой себестоимостью шггательных сред из мяса, мясных и рыбных полуфабрикатов возникает необходимость поиска и апробации подходящего для этой цели стандартного и недорогого сырья. Производство полноценных питательных сред на основах, имеющих низкую себестоимость, является актуальным для экспериментальной и практической бактериологии, для выполнения производственных задач. В настоящее время возрастает востребованность сред, даюших возможность решать конкретные микробиологические задачи; например, увеличивать продукцию определенного метаболита, изменять'морфологические и обнаруживать новые фенотипические свойства, подтвержйать^стабЙльносгь типовых или селектированных штаммов (Ахапкина И.Г., Блинюва 'ЛІЩ'ЗООІ).
Требования к сырью, предназначенному для производства питательных основ, включают содержание необходимого количества полноценного белка, ми-
нимаїїьное содержание жира, высокую биологическую ценность, хорошую растворимость, соответствие ГОСТам (Зайцев В.Ф., Маслов СА., Комоско Г.В. и др., 2003), экономическую эффективность применения. Растительное сырье отвечает основным предъявляемым требованиям и обладает необходимыми функциональными свойствами.' Белки растений представлены большим числом компонентов с различньім а^йнокислстньім составом (Кретович ВЛ., 1975). От животного сырья состав'расгител'ьного сырья отличается большей стандартностью, имеющей первостШё'ннбе'значение для воспроизводимости получаемых в экспериментах результатов^ Использование гидролизатов растений исключает риск контаминаций'живбтньши патогенами (Трошкова Г.П., Юдин А.В., Сумкина ТЛ. и др!, 2003)/-'' '
Актуальность1 работ1 по изучению возможности применения в качестве питательных основ побочных продуктов и отходов пищевых производств обусловлена и. обострением зкологических проблем, ставящих перед микробиологической отраслью задачи развития малоотходных технологий, рационального использования, и переработки'образующихся отходов (Черкашина Н.В., Щербатова ОЛ., Епанчгацев AJL и др., 1998).
Таким образом, современные требования к качеству и стандартности микробиологических питательных сред для культивирования возбудителей ООИ с одновременным упрощением и удешевлением производства определяют актуальность проведенных исследований.
Цель исследования: получение и оценка рабочих характеристик питательных сред для культивирования возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы на основе растительного сырья: картофеля, свеклы, капусты, моркови, солода, сои, соевого молока, мелассы свекловичной (патоки рафинадной).
Основные задачи исследования.
-
Обосновать перечень сырья растительного происхождения, перспективного для использования в составе питательных сред для культивирования возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы.
-
Получить из растительного сырья и охарактеризовать питательные основы микробиологических сред, приготовленные с использованием различных типов гидролиза (ферментативного, кислотного, щелочного).
-
Разработать рецептуру и методики приготовления питательных сред на основе полученных гидролизатов картофеля, свеклы, капусты, моркови, солода, сои, соевого молока.и мелассы свекловичной (патоки.рафинадной), с использованием различных добавок и стимуляторов роста, для культивирования чумного, холерного и сибиреязвенного микроорганизмов.
-
Дать оценку качественных показателей питательных сред при культивировании на них Yersinia pestis. Vibrio cholerae. Bacillus anthracis.
Научная новизна. Впервые разработаны рецептура и методики приготовления микробиологических питательных сред (жидких и плотных) для культивирования возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы (вакцинных и вирулентных
штаммов, НАГ-вибрионов), в качестве основ которых использованы, фермент тативные гидролизаты соевых бобов, картофеля и меласса свекловичная (патока рафинадная). Приоритет разработанных методик подтвержден патентами РФ на изобретения: № 2260620 «Питательная среда (жидкая) для культивирования чумного микроба вакцинного штамма ЕВ» от 20.09.2005 г., № 2301256 «Питательная среда жидкая для культивирования холерного вибриона» от 20.06.07 г., № 2303630 «Питательная среда плотная для культивирования холерного вибриона» от 27.07.07 г., № 2288950 «Питательная среда (жидкая) для культивирования сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов» от 10.12.06 г.
Впервые показана возможность использования питательной среды на ос
нове ферментативного гидролизата соевых бобов для длительного хранения
(в течение 12 мес) штаммов возбудителей чумы (при +4 С) и холеры (при
+20 С) в условиях лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов»
ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора и для получения капсульной формы
сибиреязвенного микроба. ...,,„
Впервые показана возможность использования питательной среды на основе патоки рафинадной для восстановления жизнеспособности Y. pestis после длительного хранения на традиционных средах в условиях лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов».
Проведенные исследования могут служить моделью при изучений использования других видов сырья для микробиологических питательных сред." '
Характеристика спектра химических и физических свойств питательных основ микробиологических сред из картофеля, свеклы, капусты, моркови, солода, соевых бобов, соевого молока, мелассы свекловичной может быть использована для дальнейшего изучения исследуемого сырья с целью1 получения различных специализированных питательных сред и совершенствования методик приготовления питательных основ и питательных сред.
Практическая значимость работы. Полученные жидкие и плотные питатель-іше среды на основе ферментативных гидролизатов сои, картофеля и мелассе свекловичной, обогащенные различными добавками и стимуляторами роста (дрожжевым экстрактом, ферментативным гидролизатом казеина, натрием сер-нистокислым, липоевой кислотой) предназначены для культивирования возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы в лабораторных условиях (акты испытаний в лаборатории сибирской язвы ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора от 20.04.05 г., в лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов I-IV групп патогенности и лаборатории биологического и технологического контроля ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора от 27.04.05 г., в научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций от 16.05.07 г., в лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов».ФГУЗ СтавЬДЩЧИ Роспотребнадзора от 10.10.07 г.). Плотная среда на основе ФГС пригодна для.получе-ния капсульной формы сибиреязвенного микроба (акт испьгганийв научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и дру-
гих инфекцийот .13.01.04 г.). По культуральным свойствам разработанные питательные среды не уступают коммерческим аналогам, приготовленным на ферментативной основе говяжьего мяса (бульону Хотгангера и агару Хоттингера), при этом среды на соевых и картофельных основах в 3,5 раза, а на мелассовых основах --' в 5' раз: выгоднее экономически
Питательная среда (жидкая) для культивирования сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов на основе мелассы свекловичной используется в учебном процессе кафедры микробиологии и вирусологии Ставропольской государственной медицшснэй академии (акт о внедрении от 15.11.2006 г). Питательные среды на основе растительного сырья, предназначенные для культивирования возбудителей чумы и холеры, используются в качестве сред выбора при плановых пересевах музейных штаммов в лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФГУЗ СгавНИПЧИ Роспотребнадзора (акт от 26.032008 г.).
Методики приготовления и рецептура скбнструированньгх питательных сред изложены в 6 методических документах: «Методических рекомендациях по использованию жидких и плотных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои (бобов и соевого молока) для культивирования чумного микроба» (протокол заседания Ученого совета СгавНИПЧИ № 4 от 27 апреля 2005 г.), «Методических рекомендациях по приготовлению и использованию питательной среды (жидкой) для культивирования сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов» (протокол заседания Ученого совета СгавНИПЧИ № 11 от 27 декабря 2005 г.), «Методических рекомендациях по приготовлению и использованию питательной среды (жидкой) для культивирования холерного вибриона на основе патоки рафинадной» (протокол заседания Ученого совета СгавНИПЧИ № 3 от 30 марта 2006 г.), «Методических рекомендациях по технологии приготовления агаровой питательной среды для культивирования микроорганизмов рода Bacillus» (протокол заседания Ученого совета СгавНИПЧИ № 5 от 29 мая 2007 г.), «Методических рекомендациях по приготовлению и использованию жидких и плотных питательных сред на основе ферментативного гидролизата картофеля для культивирования чумного микроба» (протокол заседания Ученого совета СгавНИПЧИ № 4 от 30 мая 2008 г.) и «Методических рекомендациях по приготовлению и использованию плотной питательной среды на основе ферментативного гидролизата картофеля для культивирования холерного вибриона» (протокол заседания Ученого совета СгавНИПЧИ № 5 от 7 июня 2008 г.). 24.04.2009 г. утверждены директором ФГУЗ СгавНИПЧИ Роспотребнадзора после согласования на федеральном уровне 2 нормативных документа: ТУ 9385-002-01897080-2009 на Питательный бульон для культивирования микроорганизмов, готовый к применению (Бульон Хоттингера) и ТУ 9385-004-01897080-2009 на Питательный агар для культивирования микроорганизмов, готовый к применению (Агар Хоттингера), а также Инструкции по применению этих сред, постоянно используемых в ходе проведения исследований в качестве контрольных.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Питательные основы; из растительного сырья пригодны для использования в составе питагельных сред для культивирования возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы.
-
По ростовым свойствам в отношении возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы питательные среды на основе растительного сырья (сои и мелассы свекловичной), содержащие добавки и стимуляторы роста микроорганизмов, не уступают питательным средам, приготовленным на мясных основах.
-
Штаммы возбудителей чумы и холеры при культивировании и длительном хранении на соевых питательных средах стабильно сохраняют свои куль-туральнс-морфологические свойства в течение 12 месяцев (срок наблюдения).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», 2005 г., на VII Международной конференции «Циклы природы и общества», 2005 г., на научно-практической конференции «Естествознание и гуманизм» в честь 170-летия со дня рождения Г.Н. Потанина, 2005 г., на научно-практических конференциях «Опыт работы органов и учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидб-лагополучия и защите прав потребителей, 9-я и 10-я Ежегодные Недели медицины Ставрополья», 2005 и 2006 г.п, Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации «Современньїе проблемы военной прсфилактичесюй.медицины, пути их решения и перспективы развития», г. Санкт-Петербург, 2QQ6; .щ на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиолргичеркрго надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Щге России», 2007 г.
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 научная работа, в том
числе 1 - в издании,,включенном в перечень ведущих рецензируемых науч
ных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки Рос
сии и рекомендованных,для,публикации основных научных, материалов дис
сертации на соискание искомой ученой степени, получено, в сравтррстве 4
патента РФ на изобретение. ,, ..,.,„
Диссертационная^ работа выполнена в рамках плановой,; научной темы
«Изучение возможности использования некоторых видов,растительного сы
рья, как основы питательных сред для возбудителей особо опасных инфек
ций», № гос. регистрации - 0120.0 700411, в. которой автор являлась ответ
ственным исполнителем, ,, :,.;.,';.! и: - -,
Структура ф і объем диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах компьютерного текста и^состоит из введения,-обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 306 источни-
ков, из них 181 отечественных'и 125'— иностранных авторов, приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 10 рисунками.
