Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Альтшулер Михаил Львович

Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A
<
Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Альтшулер Михаил Львович. Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.07 : М., 2005 138 c. РГБ ОД, 61:05-3/1337

Содержание к диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ 15

1.1.1. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ПЦР
16

  1. Структура и совместимость праймеров 16

  2. Денатурация ДНК-матрицы 18

  3. Температура отжига праймеров 19

  4. Количество циклов амплификации 19

1.1.2. ЗНАЧЕНИЕ ПЦР ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ
МУТАЦИЙ И АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ
21

1.1.2.1. Обзор методов детекции мутаций в ПЦР-

ФРАГМЕНТАХ 23

1.1.2.1.1. Полный анализ нуклеотндной
последовательности, проводимый с помощью
секвенироваиия 23

  1. Определение нуклеотндной последовательности методом секвенироваиия по Сетеру 23

  2. Секвенирование, основанное на гибридизации... 24

1.1.2.1.2. Методы, направленные на идентификацию

отличий в нуклсотилиои последовательности или на
определение избранных мутаций 25

1.1.2.1.2.1. Конформационные методы 25

  1. Метод, основанный на локальном плавлениии ДНК 26

  2. Гетеродуплексный анализ 26

  3. Конформационно-чувствительный электрофорез в агарозе 27

  4. Коиформациопиый полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК 28

  1. Лигазная цепная реакция 28

  2. Гибридизация и микрочипы 29

  3. Использование рестриктаз для детекции мутаций 31

  4. Микросиквенс 32

  5. Использование белков, узнающих иекомплементарности 32

  6. Химическое расщетснис некомтементариостей 34

  7. Метод "молекулярныхмаяков" (Molecular beacons) 34

1.1.2.1.2.9. Аглель-специфическаяамтификация 35

1.1.3. ПРЕИМУЩЕСТВА «ГНЕЗДОВОГО» МЕТОДА

ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОИ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 35

  1. АНАЛИЗ ГЕНА RPOB КАК МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 37

  2. ОПАСНОСТЬ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ ГЕРПЕСА И ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ 40

  3. ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ

ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ 41

  1. АКТУАЛЬНОСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ В УСЛОВИЯХ СОВРЕМЕННОГО ОБЩЕСТВА 41

  2. ВЫБОР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МИШЕНИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ YERSINIA PESTIS 42

1.5. ХОЛЕРНЫЙ ЭНТЕРОТОКСИН КАК ФАКТОР

ВИРУЛЕНТНОСТИ И МИШЕНЬ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ43

1.6. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕПАТИТА А И
ЗНАЧЕНИЕ ПЦР В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ 44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ 46

2.1. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ И ВИРУСНЫЕ ШТАММЫ,
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ИСТОЧНИКИ
КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ 46

2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК И РНК 51

  1. Выделение ДНК из М. tuberculosis 52

  2. Выделение РНК вируса гепатита А 54

  3. Выделение ДНК Y. pestis, V. choleraew вируса герпеса 55

  1. ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПЦР 56

  2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР И СОВМЕЩЕННЫХ РЕАКЦИЙ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ С ПЦР 57

  3. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНА RPOB MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 66

  4. АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ 68

  5. АНАЛИЗ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА (SSCP) 69

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 71

3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 71

3.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРА МУТАЦИЙ,
ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К
РИФАМПИЦИНУ.
71

  1. РАЗРАБОТКА УПРОЩЕННОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ НА ОСНОВЕ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА И АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ 73

  2. ВЫЯВЛЕНИЕ ЗНАЧИМОСТИ РЕДКИХ МУТАЦИЙ 84

  3. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ПЦР-ПРОДУКТАХ. 85

3.2. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ

ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ
ЧУМЫ И ИСПЫТАНИЕ СОЗДАННОЙ ТЕСТ-
СИСТЕМЫ НА КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММАХ 87

  1. СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ДНК VIBRIO CHOLERAE И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ АНАЛИЗА ВИРУЛЕНТНОСТИ ВИБРИОНОВ 90

  2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ЧЕЛОВЕКА I И II ТИПА (HSVI HHSV2) 100

  3. ИСПЫТАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ

7 ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА А..109

ВЫВОДЫ 126

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Русские

АТФ (англ. АТР) -аденозиптрифосфорная кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

МКК - монононуклеарные клетки крови

ПЦР - (англ. PCR)- полимеразная цепная реакция

Английские

А - аденин

АТР - аденозиптрифосфорная кислота

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (Базовый инструмент поиска сходства последовательностей, основанный на принципе локального сопоставления)

Ьр- нуклеотидная пара-пара комплементарных нуклеотидов, находящихся напротив друг друга в двух цепях ДНК

С-цитозин

CMV - цитомегаловирус

d АТР - дезоксиаденозинтрифосфорная кислота

dCTP - дезоксицитидинтрифосфорная кислота

dGTP — дезоксигуанозинтрифосфорная кислота

dTTP - дезокситимидинтрифосфорная кислота

EBV - вирус Энштейна-Барра

G-гуанин

HAV - вирус гепатита А

HBV - вирус гепатита В

I1HV6 - вирус герпеса типа VI

HI V-1 — вирус иммунодефицита человека типа I

HSV1 -вирус простого герпеса человека I тина

HSV2 - вирус простого герпеса человека II типа

HTLV-1 -Т-лимфотропный вирус человека типа I

HZV - вирус герпеса зостер

NCBI - National Center for Biotechnology Information (Государственный Центр Биотехнологической Информации, США)

RT-PCR - совмещенная реакция обратной транскрипции (RT)h ПЦР (PCR)

SDS - додецилсульфат натрия

SSCP - single-strand conformation polymorphism (конформацнонпый полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК)

Т-тимин

Введение к работе

1. Актуальность проблемы.

Важнейшим элементом диагностики инфекционных болезней, бактерионосительства, санитарного контроля, экологического мониторинга окружающей среды является детекция инфекционного агента. Среди способов определения возбудителей главенствуют классический микробиологический и иммуноферментный методы. В последнее время в диагностике микрорганизмов применяют выявление специфического фрагмента нуклеотидной последовательности возбудителя, который можно идентифицировать, используя как индикатор его наличия, способность к воспроизведению in vitro в присутствии ДНК-полимеразы, праймеров и дезоксирибонуклеотидов. Этот процесс, подобный процессу естественной репликации хромосом и отличающийся от него исключительно быстрым экспоненциальным накоплением короткого фрагмента ДНК, называется полимеразной цепной реакцией (ПЦР) [104].

По чувствительности, быстроте, простоте и дешевизне ПЦР сопоставима с иммуноферментным анализом или даже превосходит его. В некоторых, случаях ПЦР оказывается предпочтительным или единственно возможным методом детекции возбудителя.

Актуальность представленной диссертационной работы обусловлена необходимостью повышения достоверности, чувствительности и скорости выявления возбудителей. Вариант метода ПЦР, называемый nested или гнездовой ПЦР, нацелен на исключение ошибочных реультатов и обладает повышенной чувствительностью. Суть гнездовой ПЦР заключается в проведеними двух последовательных реакций, при которых исходным материалом для второй реакции является продукт (ампликон) первой [166]. Так обеспечивается двойной контроль результата анализа, практически исключающий вероятность ошибки. Кроме этого, гнездовая ПЦР обладает дополнительным преимуществом. Оно состоит в том, что при использовании аллель-специфических праймеров во время второй реакции гнездовой ПЦР, благодаря структурной простоте матрицы,

становится возможным определение мутаций, удаленных от З'-конца праймера[114].

Создание новых методов тестирования, на наш взгляд, прежде всего необходимо для возбудителей пяти особо опасных или социально значимых инфекций - чумы, холеры, гепатита А, простого герпеса I и II типа (HSVI и HSVII), а также устойчивого к рифампицину Mycobacterium tuberculosis.

Например, выявление с помощью гнездовой ПЦР возбудителя чумы в тестируемом материале позволит своевременно применить экстренные меры профилактики и терапии [90].

Трудоемкость, длительность и относительно высокий риск ошибок при использовании на практике традиционного двухэтапного подхода, применяемого для обнаружения вирулентных штаммов Vibrio cholerae у больных, вибрионосителей, в объектах окружающей среды также делает гнездовую ПЦР предпочтительным методом анализа. В данном случае ПЦР позволяет идентифицировать возбудителя непосредственно в клиническом материале, прошедшем бактерицидную обработку, минуя стадию подращивания и клонирования этого опасного микроорганизма.

Нужно отметить, что для Mycobacterium tuberculosis характерен медленный рост на питательных средах. Это не позволяет своевременно выявить у пациентов лекарственноустойчивые штаммы, в частности, штаммы, устойчивые к рифампицину - одному из ведущих противотуберкулезных препаратов [173]. Возможной альтернативой остается определение мутаций, вызывающих устойчивость к лекарству. [8, 70, 146] Для определения таких мутаций необходим быстрый, недорогой и нетрудоемкий метод. В этом случае также может быть применена гнездовая ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров, перекрывающих несколько мутанті і ых сайтов, дополненная методом конформационного полиморфизма ДНК (single-strand conformation polymorphism, SSCP).

Герпетическая инфекция человека — болезнь, дающая серьезные осложнения. При этом, патологические состояния, вызванные HSV I и

HSV II, неодинаковы по своим проявлениям и последствиям [2]. ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику HSV I и HSV II, а ее гнездовой вариант- исключить ошибки при анализах.

Результаты, полученные при детекции вируса гепатита А в крови пациентов с помощью ИФА, требуют подтверждающего теста, который также может быть выполнен методом ПЦР.

Цель работы. Разработка и испытание методов гнездовой ПЦР и конформационного полиморфизма ДНК (SSCP) как инструментов детекции генов, специфичных для пяти возбудителей инфекционных болезней человека: чумы, холеры, туберкулеза, герпеса и вирусного гепатита А.

Задачи исследования.

  1. Определить спектр мутаций устойчивости к рифампицину у штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в России, и разработать упрощенный метод определения данных мутаций на основе сочетания аллель-специфической амплификации и SSCP.

  2. Разработать чувствительный и специфичный метод комбинированной гнездовой ПЦР и обратной транскрипции для детекции РНК вируса гепатита А. Сопоставить результаты, полученные методами ИФА и гнездовой ПЦР при анализе форменных элементов крови и сывороток у больных гепатитом А или смешанными формами гепатита.

  3. Создать метод гнездовой ПЦР для дифференциальной диагностики вируса простого герпеса I и II типа и проверить его чувствительность и специфичность. Получить данные о распределении I и II типа вируса между различными клиническими группами больных и между различными типами материала, полученного от больных и носителей.

  4. Разработать гнездовую ПЦР, направленную на непосредственную идентификацию гена, кодирующего фактор

вирулентности (энтеротоксин) V. cholerae, у больных,

вибрионосителей и в окружающей среде. 5. Разработать метод гнездовой ПЦР для определения У. pestis, не

дающий перекрестных реакций с У. enterocolitica и У.

pseudotuberculosis. Научная новизна. Научно обоснованы и апробированы методы гнездовой ПЦР с коллекционными штаммами yersinia pestis, Vibrio cholerae, рифампицин-резистентного Mycobacterium tuberculosis, HSV I и HSV II и вируса гепатита А, а также с образцами материала, инфицированного этими микроорганизмами.

Впервые определен спектр мутаций устойчивости к рифампицину в российских штаммах М. tuberculosis. При этом было зарегистрировано необычно высокое относительное количество мутаций в кодоне 516 гена гроВ и была открыта новая, не описанная в литературе двойная мутация.

Показано, что при идентификации точечных мутаций с помощью аллель-специфического праймера возможно определение единичных нуклеотидных замен, удаленных от 3'-конца праймера.

Создан оригинальный метод комбинированной аллель-специфической амплификации и SSCP, при котором единственный аллель-специфический праймер в одном эксперименте способен выявлять любую из шести мутаций, а в едином опыте SSCP можно выявлять любую из пяти других мутаций. Аналогичные подходы могут найти применение на других моделях.

Методом гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией получены экспериментальные данные, касающиеся ассоциации вируса гепатита А с мононуклеарными клетками крови, что расширяет возможности выявления этого вируса у человека в случае отрицательного результата при анализе сыворотки пациента.

Выявлена более высокая способность HSVI проникать в различные органы и ткани, сравнительно с HSVII.

Практическая значимость работы. Разработка быстрого,

экономичного метода определения устойчивости к рифампицину в культурах M.tuberculosis, выделенных от больных, позволяет применять адекватные подходы к лечению больных. Метод обеспечивает значительное сокращение срока анализа, если в качестве исходного материала используют чистые культуры возбудителя, выращенные на питательной среде, поскольку отпадает необходимость пересева этих культур на среду, содержащую рифампицин, и последующего ожидания результата в течение нескольких недель или месяцев.

Созданные методы гнездовой ГТЦР позволяют повысить достоверность и чувствительность выявления Y. pestis, V. choleraey HSVI и HSVII, вируса гепатита А в инфицированном материале различного происхождения. Этот метод позволяет проводить анализы с инактивированными возбудителями, не представляющими угрозы для здоровья человека, что очень важно при работе с возбудителями особо опасных инфекций. При этом сокращаются сроки выполнения анализов.

В случае V. cholerae выбор непосредственного фактора вирулентности как мишени для амплификации выгодно отличает разработанный нами подход от применяемых в настоящее время иммуноферментных и микробиологических тестов, имеющих косвенный характер.

Обнаружено, что, в отличие от мазков из урогенитального тракта и клеточного материала мочи, соскобы из урогенитального тракта дают наиболее полную и объективную информацию о совместном присутствии вирусов HSVI и HSV II у больных с диагнозом «герпетическая инфекция».

Высокая чувствительность метода гнездовой ПЦР позволяет проводить поиск возможной аккумуляции вируса гепатита А во фракции мононуклеарных клеток крови при отсутствии возбудителя в сыворотках.

В случае гепатита А и герпеса практическая ценность разработанных методов, в значительной мере, заключается в возможности использовать их как дополнительный тест, подтверждающий результаты ИФА.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Разработан оригинальный метод детекции мутаций устойчивости к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis с применением подходов, не предполагающих секвенирования ДНК.

  2. Созданы методы гнездовой ПЦР, имеющие преимущества сравнительно с одноступенчатой ПЦР, для тестирования возбудителей простого герпеса I и II типа, холеры, чумы и гепатита А.

  3. Гнездовая ПЦР может быть использована при лабораторной диагностике для обнаружения в клиническом материале РНК вируса гепатита Л, ДНК вирусов герпеса и возбудителя холеры.

Похожие диссертации на Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A