Введение к работе
Актуальность проблемы. Кокцидиоидомикоз - инфекционное заболевание, вызываемое особо опасными диморфными грибами Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii. С immitis эндемичен для Калифорнии (США), а C.posadasii имеет значительно более широкое географическое распространение, включая юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку [М.С. Fisher et al., 2001; 2002].
В эндемичных регионах распространённость этой инфекции довольно высока. По данным внутрикожной аллергической пробы и результатам серологических реакций, в США инфицировано кокцидиоидомикозом около 10 млн. человек и ежегодно заболевает от 25 000 до 100 000 человек [R.A. Сох et al., 2004].
Отдельные эпидемические вспышки кокцидиоидомикоза описаны и вне эндемичных регионов. Опасности заражения подвергаются люди, посещающие эндемичные территории, и пациенты при пересадке органов от больных кокцидиоидомикозом [J.E. Blair et al., 2001; S.Verghese et al., 2002; V.Chaturvedi et al., 2000; S.A. Desai et al., 2001; P.W. Wright et al., 2003; M.B.Miller et al., 2004]. Иммунодефицитное состояние макроорганизма увеличивает риск возникновения заболевания [J.N.Galgiani, 1999; J.A. Leake et al., 2000].
Спорадические вспышки в неэндемичных районах могут быть вызваны артроспорами грибов, находящимися в импортируемом инфицированном сырье (преимущественно сельскохозяйственная продукция) [A.Ogiso et al., 1997].
В России до сих пор не было зарегистрировано ни одного случая этого микоза. В то же время имеется вероятность выявления данных возбудителей у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных стран Западного полушария, а также в продуктах растениеводства, импортируемых из этих стран.
Ввиду существования угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате террористических актов, интерес к возбудителям кокцидиоидомикоза проявляется и как к потенциальным агентам биотерроризма [D.M. Dixon, 2001]. Степень угрозы обусловлена не только легкостью создания микроспорового аэрозоля, неэффективностью вакцин, сложностью терапии и диагностики, но и отсутствием иммунной прослойки и потому практически полной незащищенностью нашего населения от этого патогена.
В естественных условиях возбудители кокцидиоидомикоза обитают в почве в мицелиальной форме, а инфицирование людей и многих видов млекопитающих происходит при случайной встрече человека и животных с этими патогенами во время обильной вегетации грибов. При ингаляции артроспор в макроорганизме происходит совершенно иной, чем в почве, морфологический цикл развития грибов, именуемый паразитическим или тканевым. Артроспоры увеличиваются в размерах, что сопровождается быстрым и синхронным делением ядра, и гриб образует сферические клетки, так называемые сферулы, содержащие эндоспоры. По мере созревания стенка зрелых сферул разрывается и эндоспоры, попадая в кровь и ткани, образуют новые сферулы [J.N.Galgiani, 1993].
Трудности диагностики кокцидиоидомикоза обусловлены диморфным характером этих микроскопических грибов - способностью существования в виде мицелиальной (сапробиотической) форме во внешней среде и тканевой (паразитической) в организме человека и животных. Выделение и идентификация культуры по традиционной схеме лабораторного анализа, включая использование биопробных животных, занимает около 30 суток. Общим для всех иммуно-серологических методов, направленных на выявление грибов, является их недостаточная чувствительность и специфичность [А.В.Липницкий и др., 1995; В.СЛесовой и др. 1995].
В качестве альтернативных способов выявления данных патогенов в последнее время все более активно используются молекулярно-генетические методы идентификации. Одним из них является полимеразная цепная реакция, которую отличает универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения. Первое сообщение о разработке праймеров для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза опубликовано S. Pan и G. Cole в 1995 году [S. Pan, G.T. Cole., 1995]. Выбранные праймеры на основе последовательности гена, кодирующего 19 kDa специфичный антиген, авторы рекомендовали для создания амплификационной тест-системы с целью выявления С immitis В последующих работах для конструирования специфических праймеров использовалась спейсерная область рибосомальных генов [D.R. Greene et al., 2000]. Однако, учитывая высокую консервативность рибосомальных генов различных видов грибов, существует вероятность получения ложноположительных результатов, в первую очередь при исследовании материала из объектов внешней среды [B.C. Millar et al., 2003]. Тест-система на основе праймеров, фланкирующих ген, кодирующий АГ богатый пролином [R.Bialek et al., 2004], была апробирована только при исследовании биопсийных образцов тканей, пораженных C.posadasii. В этой работе отсутствовали данные о какой либо возможности идентифицировать предложенной тест-системой С.immitis. До сих пор нет публикаций, в которых бы приводились результаты использования ПЦР не только для выявления, но и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза между собой.
На основании вышеизложенного, очевидна актуальность исследований, направленных на совершенствование схем лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза и создания амплификационных тест-систем для идентификации С. immitis и С posadasii
Цель работы заключалась в выборе специфичных праймеров и конструировании тест-системы для выявления и дифференциации С. immitis и С posadasii методом полимеразной цепной реакции.
Задачи исследования
Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора праймеров для идентификации C.immitis и Сposadasii методом ПЦР.
Оценить специфичность и чувствительность выбранных олигонуклеотид-ных затравок на широком наборе гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов и сконструировать амплификационную тест-систему для идентификации и дифференциации С immitis и C.posadasii.
Определить видовую принадлежность штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза, предоставленных Коллекционным центром Волгоградского научно-исследовательского противочумного института, с помощью методов генетического типирования.
Установить оптимальные способы обеззараживания материала и подготовки проб при исследовании объектов внешней среды и биологического материала, контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза.
Оценить эффективность сконструированной тест-системы для детекции С immitis и С posadasii в объектах внешней среды и диагностики экспериментального кокцидиоидомикоза.
Научная новизна
Впервые разработана отечественная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза на основе фрагмента гена макрофагсвязанного протеина C.immitis и на основе фрагмента гена гликопротеина внешней стенки сферул С posadasii. Показана ее эффективность при обнаружении ДНК грибов в объектах, искусственно контаминированных штаммами Coccidioides spp., и биологическом материале от экспериментально зараженных животных. Олигонуклеотидные праймеры CimMBPXs -CimMBPlas обеспечивают специфическую амплификацию обоих возбудителей кокцидиоидомикоза, а праймеры CpSOW%2s - CpS0W$2as - только C.posadasii.
Схема лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза дополнена этапами ПЦР как при идентификации чистых культур C.posadasii и C.immitis, так и исследовании экспериментального клинического материала и проб из объектов внешней среды.
На основе результатов внутривидового генетического типирования и анализа культур Coccidioides spp методом ПЦР с использованием двух пар праймеров, определена видовая принадлежность коллекционных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза.
Предложен способ выделения ДНК возбудителей особо опасных микозов из контаминированных проб почвы и клинических образцов, обеспечивающий высокоэффективный лизис клеток патогенных грибов с последующей очисткой ДНК. Приоритетность исследований подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение «Способ выделения ДНК Coccidioides immitis для проведения полимеразной цепной реакции» №2005122043/14(024850) от 12. 07.2005г.
Практическая значимость
Сконструированная амплификационная тест-система может быть использована в специализированных лабораториях для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза. На сегодняшний день предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института для анализа музейных штаммов Coccidioides spp при изучении их фенотипических и генетических особенностей
Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний и противодействию биотерроризму.
По результатам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Способ обеззараживания материала, зараженного возбудителями кокцидиоидомикоза, для проведения полимеразной цепной реакции» и «Использование олигонуклеотидных праймеров CimMBPls - CimMBP2as и CpSOWB2s - CpSOWS2as для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза», одобренные Ученым советом Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (протокол №5 от 07.06.2006 г.) и утвержденных директором института.
Основные положения, выносимые на защиту:
Олигонуклеотидные праймеры CimMBPls - CimMBPlas, подобранные на основе гена, детерминирующего макрофагсвязанный белок МВР-1, обеспечивают амплификацию специфичных фрагментов ДНК обоих видов возбудителей кокцидиоидомикоза, а праймеры CpSOWbls - CpSOWlas, выбранные на основе SOWgp82 гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул, позволяют детектировать Cposadasii
Амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза, сконструированная на основе родос-пецифических праймеров CimMBPls - CimMBPlas и видоспецифических олигонуклеотидных затравок CpSOlV82s - CpSOWZ2as для выявления Cposadasii, обладает чувствительностью 1х104 артроспор/мл при анализе чистых культур микромицетов.
Обработка проб раствором мертиолятом натрия до конечной концентрации 1:1000 позволяет проводить обеззараживание материала, содержащего возбудителей кокцидиоидомикоза, для его исследования методом ПЦР без снижения чувствительности реакции амплификации.
Экстракция ДНК грибов с помощью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформного метода с последующей нуклеосорбцией является эффективным способом подготовки проб при исследовании объектов внешней среды и биологического материала методом ПЦР.
Разработанная амплификационная тест-система с праймерами CimMBP\s - CimMBP2as и CpSOWS2s - CpSOWZlas обеспечивает выявление возбудителей кокцидиоидомикоза при исследовании биологического материала от экспериментально зараженных животных.
Сконструированная тест-система позволяет специфически детектировать С immitis и C.posadasii с чувствительностью 1х104 артроспор/мл при исследовании объектов внешней среды (почвы), искусственно контамини-рованных возбудителями кокцидиоидомикоза.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены: на научно-практической конференции по медицинской микологии «VII Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2004); V Всероссийской научно - практической конференции, - «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004); III Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2005); Научно-практической конференции по медицинской микологии «VIII Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2005); VI Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); IV Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2006); Научно-практической конференции по медицинской микологии «IX Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2006), а также на научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 124 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 177 источников, в том числе 35 отечественных и 142 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком.
