Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
Методы биохимической идентификации 16
Использование бактериофагов в лабораторной
диагностике холеры 20
1.3. Молекулярно-генетические методы
индикации и идентификации холерных вибрионов 30
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Материалы 39
Испытуемые (новые) и контрольные (коммерческие) диагностические препараты 39
Штаммы микроорганизмов 40
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Разработка Программ медицинских
приемочных испытаний новых и коммерческих МИБП для выявления
и идентификации возбудителя холеры 41
2.2.2. Определение биохимической
активности микроорганизмов 42
2.2.3. Исследование активности, специфичности и
воспроизводимости бактериофагов
диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx"
жидких 43
2.2.4. Выявление V. cholerae с помощью тест-системы
для выявления ДНК Vibrio cholerae Ol (ctxA+ tcpA+)
методом ПЦР методом полимеразной цепной реакции 44
2.2.5. Безопасность работы 47
2.2.6. Статистические методы оценки результатов исследования 48
ГЛАВА 3. Идентификация микроорганизмов рода Vibrio
по биохимической активности с помощью микротестсистем 49
Изучение диагностической ценности микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) 50
Изучение диагностической ценности микротестсистемы для ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) 58
ГЛАВА 4. Сравнительная оценка качества бактериофагов
диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких 61
ГЛАВА 5. Изучение диагностической значимости тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной
цепной реакции 73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89
ВЫВОДЫ 101
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 103
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИИ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ
МИБП - медицинские иммунобиологические препараты
ФСП - фармакопейная статья предприятия
НД - нормативная документация
МУ - методические указания
СП - санитарные правила
ОСО - отраслевой стандартный образец
ед. - единиц
м.к. - микробных клеток
ПЦР - полимеразная цепная реакция
п.н. - пар нуклеотидов
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты
СИБ - системы индикаторные бумажные
МТС - микротестсистема
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На основании анализа
эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России прогноз по этой инфекции на ближайшие годы остается неблагоприятным. Это связано, прежде всего, с существующей реальной возможностью завоза инфекции из эндемичных по холере стран. Уникальная вариабельность генома Vibrio cholerae позволяет говорить также о дальнейшей эволюции патогенности возбудителя, что способствует возникновению новых высоковирулентных штаммов, которые будут представлять особую опасность для человечества [91; 112; 129; 160; 168; 205; 235; 237; 223; 274; 276; 278; 291].
Кроме этого не исключается возможность эпидемического распространения холеры при биотерроризме. На основании критериев, использованных при отборе биологических агентов, V. cholerae относится к категории В - высокоприоритетных патогенов, которые должны быть учтены при стратегическом планировании готовности к вспышкам, вызванным биотеррористичесими актами [93].
Для своевременного предотвращения возникновения эпидемических вспышек холерой большое значение отводится проведению эпидемиологического надзора на всех этапах выявления заболевших, или подозрительных на заболевание, а также постоянному контролю за объектами окружающей среды. Для прогнозирования эпидемического процесса важным является проведение мониторинга фенотипических и генотипических свойств выделяемых штаммов [7; 83; 92; 143; 173; 214; 224; 240].
Проведение противоэпидемических мероприятий во многом определяется своевременной диагностикой, соответственно, чувствительностью и специфичностью лабораторных методов исследования. Из-за неодинаковой информативности существующих методов и препаратов до настоящего времени остается проблемой определения эпидемической значимости холерных вибрионов.
За последние годы для диагностики холеры в практическое здравоохранение недостаточно активно внедряются высокочувствительные препараты и тест-системы с использованием новых технологий для выявления возбудителя холеры [69; 85; 152]. Исходя из вышеизложенного, актуальным и своевременным является совершенствование диагностики холеры, направленной на внедрение в практику новых специфичных и высокочувствительных препаратов и тест-систем [33; 54; 60; 81; 103; 126; 154].
В последние годы взамен традиционных пробирочных биохимических тестов широко применяются экономичные и чувствительные наборы микротестов разных конструкций, которые значительно облегчают и упрощают процесс дифференциации бактерий [101; 1]. В дополнение к традиционным методам определения биохимической активности микроорганизмов с помощью бумажных индикаторных систем (СИБ), сред Гисса и Меллера лабораторного приготовления, в филиале ФГУП «НПО Микроген» НПО "Питательные среды" в г. Махачкала разработаны микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) [99] .
С момента открытия д' Эреллем холерного бактериофага, фагодиагностика остается ценным специфическим тестом при идентификации холерных вибрионов. Поэтому разработка и усовершенствование препаратов фагодиагностики является важной задачей [5; 9; 24; 76; 93; 136; 163; 199; 203; 266; 285]. Одним из аспектов ее решения является совершенствование методов определения эпидемической значимости холерных вибрионов [8; 23; 51; 75; 77; 137; 158; 197; 226; 238; 287; 294]. В связи с этим специалистами ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разработаны бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных ctx+ и эпидемически неопасных ctx" холерных вибрионов биовара эльтор [136].
Для индикации штаммов, выделяемых из биологического материала и объектов окружающей среды, в последние годы широко используют молекулярно-генетические методы, основанные на выявлении генов, ответственных за синтез основных факторов патогенности, в том числе с помощью ПЦР [14; 28; 41; 79; 84; 126; 249].
ПЦР позволяет выявлять в выделенных штаммах V. cholerae генетические маркеры токсигенности и эпидемической значимости, прежде всего ctxA гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного энтеротоксина. Это дает возможность одновременно с индикацией холерных вибрионов определять их токсигенность [14; 42; 46; 94; 139; 157; 176; 225; 261; 281; 288; 295].
Важная роль в патогенезе холеры и появлении новых токсигенных штаммов принадлежит токсин-корегулируемым пилям адгезии, которые являются рецептором для нитевидного фага СТХф, детерминирующего продукцию холерного токсина [63; 155; 210; 211; 219; 242; 269; 297]. Показано, что наличие генов tcp кластера напрямую связано с эпидемической значимостью штаммов холерных вибрионов [221; 241]. Учитывая вышеизложенное для повышения информативности генной диагностики холеры специалисты ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров) разработали тест-систему, для выявления ДНК Vibrio cholerae основанную на одновременной амплификации двух генетических детерминант - ctxA и tcpA генов, отвечающих за синтез холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии, соотвественно [139].
Таким образом, затронутые некоторые актуальные вопросы по
совершенствованию лабораторной диагностики холеры, указывают на значимость проблемы для обеспечения эпидемиологического благополучия населения страны. В связи с этим дальнейшие исследования, направленные на изучение диагностической ценности новых препаратов для диагностики холеры
с целью внедрения их практическое здравоохранение, несомненно, является
своевременными.
Необходимым условием внедрения в практику здравоохранения новых
медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) является проведение
контролируемых испытаний, а для их выполнения наличие адекватных и
стандартных методов контроля, а также требований к их качеству. К началу
исследований методы оценки качества препаратов для диагностики холеры,
являлись неизученными. Чтобы определить диагностическую ценность новых
МИБП для выявления и идентификации возбудителя холеры необходимо было
всесторонне изучить их с использованием унифицированных схем аттестации,
включающих разработку и стандартизацию методов оценки их качества, выбор
препаратов сравнения; подбора необходимого количества микроорганизмов для
определения специфической активности препаратов; провести
стандартизацию и аттестацию методов контроля; систему регистрации оценки
результатов испытаний; определение области применения новых МИБП,
уточнение Инструкций по применению, требований к качеству при их
масштабированном выпуске [12; 16; 17; 103; 153].
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Сравнительное изучение диагностической ценности новых
микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V,) и
ускоренного определения их групп по Хейбергу (МТС-Х).
2. Оценка эффективности бактериофагов диагностических холерных
эльтор ctx+ и ctx" жидких, предназначенных для ускоренной идентификации и
дифференциации эпидемически опасных ctx+ и эпидемически неопасных ctx" холерных вибрионов биовара эльтор.
3. Изучение качества диагностической тест-системы для выявления ДНК
Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции в
экспериментальных исследованиях.
4. Анализ результатов приемочных испытаний для определения
диагностической ценности новых препаратов и решения вопроса о
целесообразности их внедрения в практику здравоохранения, а также
совершенствование контроля их качества и уточнение ФСП и Инструкций по
их применению.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработаны научные принципы аттестации и оценки качества новых диагностических препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры в медицинских приемочных испытаниях с использованием препаратов сравнения аналогичного назначения. Сформулированы критерии и разработаны требования к основным показателям качества МИБП при их серийных выпусках.
Впервые на представленном материале установлена диагностическая эффективность и обосновано внедрение в практику здравоохранения микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х). Новыми являются данные изучения биохимической активности большого набора музейных штаммов микроорганизмов V. cholerae 01, V. cholerae не 01 и Vibrio других видов с помощью микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (MTC-Xj в сравнении с системами индикаторными бумажными, средами Гисса и Меллера лабораторного приготовления. Идентифицировано 12 видов вибрионов рода Vibrio и подтверждено соответствие их классификации по Берджи [18]. Разработана таблица идентификации по биохимической активности 12 видов рода Vibrio: V. cholerae Ol и не 01, V. parahaemolyticus, V alginolyticus,
V. mimicus, V.flnvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V. anguillarum, V. furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae.
Впервые научно обоснованы принципы оценки диагностической эффективности бактериофагов диагностических холерных эльтор СТХ+ и СТХ" жидких для лабораторной практики. Предложена усовершенствованная схема определения эпидемической значимости вибрионов эльтор. Разработаны требования к методам контроля специфической активности и специфичности фагов и требования к контрольным штаммам.
Разработаны методы и критерии оценки качества новой тест-системы диагностической для выявления ДНК Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции на основе двух праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену ctxA+, ответственного за ведущий фактор вирулентности - токсинообразование и трех праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену tcpA+, кодирующего основную субъединицу токсинкорегулируемых пилей адгезии. Показано, что тест-система обнаруживала V. cholerae (ctxA+ tcpA+) в дозе 1-Ю3 м.к. и 1-104м.к. в пробе, то есть в 100-1000 раз была чувствительнее многих, используемых в лабораторной практике, сертифицированных диагностических препаратов.
Использованные нами в работе критерии качества испытуемой тест-системы позволили доказать возможность одновременного выявления возбудителя холеры, определения его эпидемической значимости и дифференцирования по биовару.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЯ. Работа имеет практическую направленность и посвящена усовершенствованию методов контроля, определяющих качество новых препаратов для диагностики холеры.
Сформулированы критерии и разработаны требования к основным показателям качества МИБП при их серийных выпусках.
11 На основании проведенных исследований новые иммунобиологические препараты одобрены Комитетом МИБП и внедрены в практику здравоохранения:
Микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V), ФСП 42-0504-7631-06 и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) производства филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ НПО "Питательные среды" в г. Махачкала, ФСП 42-0504-7632-06, протокол Комитета МИБП № 8 от 26.12.97 г.
Бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие производства ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб" (г. Саратов), ФСП 42-0020-2038-01, протокол Комитета МИБП № 7 от 05.07.00 г.;
Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae {ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции производства ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров), составлен проект ФСП, протокол Комитета МИБП№7от19.12.02г.
Усовершенствованные требования к основным показателям качества новых препаратов для диагностики холеры внесены в утвержденные нормативные документы (ФСП и Инструкции по применению).
По результатам проведенных испытаний в ФСП и Инструкцию по применению на микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) внесены изменения, касающиеся методики постановки реакции, дополнительно введены штаммы для контроля чувствительности, включена таблица биохимической характеристики 12 видов, относящихся к роду Vibrio: V. cholerae Ol и не Ol, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V.fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V. anguillarum, V. furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae. Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по применению) утвержден начальником Управления регистрации и обеспечения качества лекарственных средств ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ 23.10.2007 г.
В ФСП на Бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx"
жидкие уточнены требования к «Специфической активности и специфичности»
фагов и требования к штаммам для контроля. В Инструкцию по применению на
бактериофаги - для более четкой оценки результатов в схему оценки
эпидемиологической значимости вибрионов эльтор рекомендовано внести
изменения в схему оцениваемых штаммов - помимо разделения на варианты,
обобщить в группы. Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по
применению) утвержден директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»
11.02.2008 г.
В проект ФСП на тест-систему для выявления ДНК Vibrio cholerae {ctxA+ tcpA ) методом полимеразной цепной реакции, внесены изменения, касающиеся определения ее специфической активности и специфичности. Определен порог чувствительности тест-системы для штаммов V. cholerae (ctxA+) - в концентрации ПО3 м.к./мл, для штаммов V. cholerae (tcpA+) - в концентрации 1-10 м.к./мл. Подобраны тест-штаммы, используемые для контроля чувствительности и специфичности препарата. Для повышения чувствительности тест-системы в течение срока годности рекомендовано разделение праимеров, комплементарных нуклеотиднои последовательности гена ctxA и гена tcpA. Акт внедрения рекомендаций в НД (проект ФСП и Инструкции по применению) утвержден начальником ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» 07.11.2007 г.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Внедрение в практику новых микротестсистем для биохимической
идентификации вибрионов (MTC-V) и ускоренного определения групп
вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) позволит расширить диапазон идентификации
видов рода Vibrio семейства Vibrionaceae.
2. Новые микротестсистемы для биохимической идентификации
вибрионов (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу
(МТС-Х) имеют преимущества по экономической эффективности и простоте
постановки перед средами Гисса и Меллера и системами индикаторными бумажными (СИБ).
Сравнительная оценка в приемочных испытаниях чувствительности, специфичности и воспроизводимости новых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких показала их преимущество перед монофагами диагностическими холерными ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ,5 при определении эпидемической значимости выделенных холерных вибрионов.
Обоснована целесообразность внедрения в практику здравоохранения тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции, предназначенной одновременно выявлять возбудителя холеры и определять его эпидемическую значимость по наличию гена ctxA, ответственного за токсинообразование и по наличию гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин корегулируемых пилей адгезии.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены
на научно-практических конференциях Российского научно-
исследовательского противочумного института "Микроб" «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000 г., 2003 г.); научных конференциях и Ученых Советах ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва, 1999 г., 2000 г., 2003 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства питательных сред в решении задач по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения России» (Оболенск,1999); Первой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000 г.); VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003 г.); Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004 г.).
Материалы диссертации вошли в научные отчеты по законченным медицинским приемочным испытаниям, которые были проведены в период с 1997 по 2003 годы. Результаты наших исследований были использованы при составлении и утверждении 6 нормативных документов.
ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации отражены в 13 публикациях, в том числе в 2 - рекомендованных ВАК Российской Федерации научно-практических изданиях.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 302 источника литературы, в том числе 184 отечественных и 118 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 2 рисунками.
