Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время дифтерийная инфекция продолжает оставаться серьезной проблемой для здравоохранения. Несмотря на стабилизацию показателей заболеваемости дифтерией в РФ отмечаются случаи заболевания и бактерионосительства среди детского населения в отдельных регионах.
Важно отметить, что продолжают регистрироваться случаи заболеваний дифтерией среди привитых. Так, в г. Вологде и в Вологодской области в последние годы у 80 % заболевших дифтерией в крови определялись антитоксические антитела в титрах 1:40-1:80 и выше (по данным РПГА), которые согласно нормативным документам рассматриваются как обеспечивающие невосприимчивость к инфекции. Однако в последние годы показано, что метод РПГА не отражает истинного состояния невосприимчивости к дифтерии, т.к. коэффициент корреляции между результатами исследования сывороток в РПГА и классической реакции нейтрализации в культуре клеток Vero, принятой в качестве «золотого» стандарта, равен r = 0,5. В то же время этот же показатель для ИФА и РН (Vero) составил 0,95 с уровнем достоверности p < 0,05. (Краева Л.А., 2011 г.).
Известно, что в создании устойчивого иммунитета к инфекционным заболеваниям важное значение имеет не только количество антител, вырабатываемых в результате вакцинации, но особенно их качество. Этот показатель характеризует прочность и устойчивость образованного комплекса «антиген – антитело» (авидность). Установлено, что низкоавидные антитела не могут защитить человека от заболевания в случае инфицирования (Usinger W.R., 1999). Для ряда инфекций (ЦМВ, ВИЧ, краснуха, эпидемический паротит, токсоплазмоз, шистоматоз) зарубежными производителями выпускаются коммерческие тест-системы, в которых предусмотрено определение авидности, рассчитаны критерии невосприимчивости к инфекциям управляемым вакцинопрфилактикой (Eggers M, 2000; Prince H.E., 2002; Le Guillou H. 2001; Bottiger B., 1997). В последние годы появились результаты изучения авидности противодифтерийных антитоксических антител у взрослых лиц, получивших ревакцинирующие прививки с интервалом не менее 10 лет (Краева Л.А., 2011).
Изучение авидности антител у детского населения, получившего цикл вакцинирующих и ревакцинирующих прививок против дифтерии, равно как использование метода ИФА для контроля иммунитета, не проводилось.
Учитывая, что в постэпидемический период, особенно в период 2-ой волны подъема заболеваемости дифтерией, болели преимущественно дети, представлялось важным провести комплексное изучение состояния их противодифтерийного иммунитета с применением новых методических подходов.
Известно, что серьезную проблему представляют бактерионосители C.diphthriae, создающие опасность инфицирования возбудителем дифтерии детей особенно в организованных коллективах. Современный лабораторный диагноз базируется на традиционных приемах обнаружения возбудителя, его токсигенности и выявлении специфических антител методом РПГА. Однако они не решают проблемы экспрессной диагностики и выявления штаммов с «молчащим» геном токсигенности. Для повышения эффективности бактериологической диагностики дифтерии необходимо было оценить значение метода ПЦР для выявления C.diphthriae у детей с клиническим статусом и «так называемых» здоровых.
Изложенное определило необходимость комплексных исследований, направленных на выяснение роли высокоавидных антител в защите от инфекции у детей, их использования для контроля поствакцинального иммунитета и выявление особенностей биологических свойств C.diphthriae, циркулирующих в период вакцинопрофилактики.
Цель исследования:
Оценить показатели поствакцинального иммунитета и степень защищенности детей от дифтерии, совершенствовать тактику контроля дифтерийной инфекции.
Задачи работы:
-
Определить защищенность от дифтерии детского населения с использованием современных методов серологической диагностики.
-
Оценить роль высокоавидных антитоксических противодифтерийных антител в формировании устойчивого поствакцинального иммунитета у детей. Изучить особенности динамики их накопления и регрессии у детей.
-
Определить особенности основных биологических свойств C.diphtheriae, циркулирующих в периоды подъема и спада уровней заболеваемости дифтерией.
-
Разработать алгоритм лабораторного контроля противодифтерийного иммунитета у детей.
Научная новизна. Впервые определен уровень суммарных и высокоавидных АТ-АТ у детей, получивших комплекс вакцинирующих и ревакцинирующих прививок.
Для оценки индивидуального и коллективного иммунитета против дифтерии у детей применен метод ИФА и его модификация, определены достоверные критерии невосприимчивости.
Впервые установлена возрастная группа «риска» (9-13 лет), содержащая в крови низкие уровни АТ-АТ независимо от соблюдения графика прививок.
Выявлена особенность динамики накопления и снижения уровня высокоавидных АТ-АТ у детского населения, состоящее в более длительном сохранением высокоавидных антител, чем у взрослого населения.
Возможная причина супрессии tox-гена у штаммов C. diphtheriae, изолированных от больных с ЛОР-патологией в период подъема заболеваемости может быть связана с использованием пациентами антибактериальных препаратов для лечения основного заболевания.
Установлена высокая частота резистентности штаммов C. diphtheriae, выделенных в 2009-2010 гг., к тетрациклину (83%) и пенициллину (59%) по сравнению с таковыми у штаммов, выделенных в 2005-2006 гг.
Практическое значение. Апробирован и внедрен в практику простой и наиболее адекватный тест для измерения авидности противодифтерийных антитоксических антител с использованием ИФА с расчетом индекса авидности (ИА), позволяющий определять истинные протективные антитела. При коэффициенте ИА, равном 10, обследуемые являются незащищенными, при ИА, равном 30 и более, обеспечивается защита от заболевания на 95% в течении не менее 7 лет.
Данные по проведению и использованию ИФА в практических лабораториях изложены в Методических рекомендациях «Серологические методы для диагностики и мониторинга дифтерийной инфекции», утвержденных Департаментом здравоохранения Вологодской области (2012 г.).
Для унификации и повышения эффективности серологического контроля иммунитета предложен алгоритм, включающий:
-
периодичность серологического мониторинга (не реже 1 раза в 2 года);
-
использование ИА и определения уровня АТ-АТ в МЕ/мл;
-
определение степени невосприимчивости обследуемых с учетом сроков сохранения высокоавидных АТ-АТ;
-
сопоставление серологических данных с результатами изучения циркуляции C.diphtheriae (токсигенных, с «молчащим» геном), что позволит выявлять группы повышенного риска.
Разработан алгоритм микробиологического мониторинга за циркуляцией токсигенных C.diphtheriae с использованием метода ПЦР и определение чувствительности к антибактериальным препаратам.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
На основании данных определения поствакцинальных противодифтерийных антител методом ИФА и его вариантов установлены объективные показатели защищенности детского населения от дифтерии.
-
Обосновано применение метода ИФА c учетом индекса авидности и определения сроков регрессии высокоавидных антител, для установления вакцинального статуса при серологическом мониторинге иммунитета к дифтерии у детей.
-
Для мониторинга циркуляции C.diphtheriae и выявления эпидемически значимых штаммов подтверждена необходимость использования метода ПЦР.
-
Выявленные особенности (доминирование культур с «молчащим» геном токсигенности, выраженная резистентность к антибактериальным препаратам, циркуляция рибо – и биотипов, характерных для эпидемической ситуации) биологических свойств C.diphtheriae, циркулирующих в постэпидемических период и подъема заболеваемости позволяют рассматривать их в качестве основных признаков для прогноза заболеваемости дифтерии у детей.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты работы внедрены в практическую деятельность врачей диагностических центров и микробиологических лабораторий Центров гигиены и эпидемиологии г. Вологды и Вологодской области.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс Вологодского филиала ГБОУВПО «Северо-Западный Государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения РФ.
Материалы диссертации представлены в «Руководстве по клинической лабораторной диагностике» (Раздел: Коринебактерии) М. 2011.
Разработана технология получения контрольных образцов для определения индекса авидности противодифтерийных антитоксических антител с помощью ИФА тест-системы, выпускаемой филиалом ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития Россия Пермское НПО «Биомед» №09/600/22116.
Составлены методические рекомендации «Серологические методы для диагностики и мониторинга дифтерийной инфекции». Утверждены Департаментом здравоохранения Вологодской области, 2012 г.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано: 15 научных работ, в том числе 3 – в изданиях, рецензируемых ВАК.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2006-2012 гг.: 7 февраля 2006 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 26 мая 2007 г. ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава. Всероссийская научная конференция «Современные проблемы медицинской микробиологии» (Хлопинские чтения); 26 февраля 2008 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 2-4 июня 2008 г. Четвертая международная конференция, посвященная 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера; 16-17 декабря 2009 г. Вологда. Пленум, посвященный 65-летию Российской академии медицинских наук и 130-летию со дня рождения академика АМН СССР А.Н. Сысина; 08 июня 2010 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 15 сентября 2010 г. Вологда. Научно-практическая конференции ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области»; 14 сентября 2012 г. Вологда. Научно-практическая конференции ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области».
Личный вклад автора. Собраны, изучены и проанализированы аналитические данные о профилактических прививках обследованных детей, и клинический статус.
Основные результаты получены лично автором, отдельные фрагменты выполнены совместно на базе лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИЭМ имени Пастера. Выделение штаммов C. diphtheriae, сбор сывороток от больных и здоровых лиц проведен в микробиологических лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии г. Вологды и Вологодской области, а также лично автором.
Микробиологические, серологические, иммунохимические, экспериментальные исследования, а также компьютерный и статистический анализ данных проведен автором в лаборатории бактериальных и паразитарных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области» и в лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИЭМ им. Пастера.
Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения.
Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 102 источника отечественных авторов и 250 источников зарубежных авторов.
