Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень её разработанности
Проблема хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких (ХИВЗЛ) у детей была и остается одной из наиболее актуальных и сложных вопросов в педиатрии и клинической медицине в целом (Хронические заболевания легких у детей. Под ред. Н.Н. Розиновой, Ю.Л. Мизерницкого. М.: Практика, 2011. 224 с). Статистические и эпидемиологические данные подтверждают рост распространенности ХИВЗЛ у взрослого и детского населения (Пульмонология детского возраста: проблемы и решения. Под ред. Ю.Л. Мизерницкого, А.Д. Царегородцева, А.А. Корсунского. М., 2008. Вып. 8. 176 с). Нередко бронхолегочные болезни, начавшись у детей, продолжаются в зрелом возрасте, приводят больных к инвалидности, а иногда - к смертельным исходам.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в диагностике и лечении обострений ХИВЗЛ у детей, многие вопросы, затрагивающие эту патологию, требуют обсуждения. Существующая нормативная база по лабораторной диагностике ХИВЗЛ рассчитана преимущественно на взрослых пациентов (Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ: приказ М-ва здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. М., 1985. 126 с; Барлетт Д.Д. Инфекции дыхательных путей. М.: Бином, 2000. 192 с; Зубков М.Н. Практическое руководство по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи. М.: Издательство МГУП, 2002. 272 с).
В руководствах как отечественных, так и зарубежных существуют значительные разночтения в соотношении и составе клеточных элементов, количестве просматриваемых полей зрения и других приемов микроскопического исследования мокроты у взрослых с инфекционной бронхолегочной патологией. А микробиологическое исследование мокроты в педиатрии вообще не имеет широкого применения из-за трудностей в сборе материала и отсутствии однозначных критериев микроскопической оценки качества мокроты для культурального исследования (Зубков М.Н. Практическое руководство по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи. М.: Издательство МГУП, 2002. 272 с).
Для бактериологического анализа отделяемого дыхательных путей наиболее часто используют 5% кровяной агар, среду для посева и выделения Streptococcus pneumoniae по прописи Л.К. Катосовой, агар с сердечной вытяжкой, которые имеют либо низкие ростовые свойства для «прихотливых» микроорганизмов, в частности для пневмококка, или высокую себестоимость из-за применения дефицитных компонентов в приготовлении, которые недоступны для большинства практических лабораторий (Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ: приказ М-ва
здравоохранения СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. М., 1985. 126 с; Кречикова О.И. и соавт. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2, № 1. С. 88-89).
Исследования последних лет свидетельствуют, что неспорообразующие
анаэробы и их ассоциации с аэробами играют важную роль в развитии как
острой, так и обострения хронической инфекции при легочной патологии. Но
из-за трудностей, связанных с выделением анаэробных бактерий и
необходимым для этого временем, диагноз анаэробных инфекций нередко
основывается только на предположении (Белобородова Н.В. и соавт.
Диагностика анаэробной инфекции у детей методом хроматографии: метод,
рекомендации. Режим доступа:
).
Поэтому для своевременной и качественной диагностики обострений ХИВЗЛ у детей требуется изучение этиологической роли разных микроорганизмов, в том числе их биотипов и серотипов, их антибиотикочувствительности и оценка диагностических возможностей, как культурального исследования клинически значимого материала, так и других лабораторных методов. Кроме того, выявление возбудителей необходимо как для назначения рациональной этиотропной антибактериальной терапии, так и прогнозируемой эмпирической, а также для применения различных методов профилактики обострений ХИВЗЛ у детей.
Цель исследования
Усовершенствовать методы и критерии оценки результатов этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.
Задачи исследования
1. Оценить диагностическую ценность для культурального исследования
у детей образцов мокроты, обнаруживающих при микроскопии менее 25
полиморфноядерных лейкоцитов и более 10 десквамированного
плоскоклеточного эпителия.
-
Разработать доступную питательную среду для выделения, культивирования бактерий и ускоренный способ обнаружения Р-лактамазопродуцирующих штаммов Moraxella catarrhalis из клинического материала.
-
Определить критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.
4. Установить частоту встречаемости серотипов Streptococcus pneumoniae,
выделенных при обострении хронических инфекционно-воспалительных
заболеваний легких у детей в Екатеринбурге и Свердловской области.
5. Оценить возможность использования и диагностическую значимость различных методов определения этиологии обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.
Методология и методы исследования
С 2009 по 2011 гг. был обследован 241 ребенок в возрасте от года до 17 лет, проживающий в Екатеринбурге и городах Свердловской области, с обострением разных нозологических форм ХИВЗЛ: бронхоэктатической болезни (п = 133) и хронического бронхита (n = 108). Дети проходили лечение в торакальном отделении ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1» г. Екатеринбурга. Среди пациентов было 132 (54,8%) мальчика и 109 (45,2%) девочек (соотношение 1,2:1). В динамике обследовано 95 детей.
В контрольную группу были включены дети без инфекционной бронхолегочной патологии (воронкообразная деформация грудной клетки, инородное тело дыхательных путей, атрезия пищевода, рубцовый стеноз пищевода, стеноз трахеи, у которых в общем анализе крови признаков воспаления нет) (n = 45).
Для решения поставленных цели и задач исследования использовались
следующие методы: микроскопический, культуральный, молекулярно-
генетический, непрямой иммунофлюоресценции, газожидкостной
хроматографии, серологический (иммуноферментный анализ).
Исследование одобрено локальным комитетом по этическим вопросам при ГБУЗ СО «ОДКБ № 1» протокол № 24 от 30.10.2012 года.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов статистической обработки материалов исследования, при консультативном участии специалистов в области математического анализа, с использованием программ: Statistica (Data analysis software system, StatSoft) версия 6.0, Microsoft Excel.
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на III международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009. К 160-летию академика И.П. Павлова» (Санкт-Петербург, декабрь 2009); конференции с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, февраль 2010); ХП-ом международном конгрессе по антимикробной терапии Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (Москва, май 2010); VII международной научно-практической конференции «Актуальные научные достижения 2011» (Чехия, июнь-июль 2011); Российской научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2011» (Москва, октябрь 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, октябрь 2011); XIII-ом международном медицинском форуме «Стандарты и порядки медицинской
помощи, как основа повышения эффективности здравоохранения» -межрегиональной междисциплинарной научно-практической конференции «Современные стандарты и технологии диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней» (Нижний Новгород, апрель 2012); заседании общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов Свердловской области (Екатеринбург, февраль 2013).
Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщении данных специальной литературы, в предложении основной идеи и цели исследования, в разработке необходимых методологических подходов, в проведении 95% всех лабораторных исследований и сборе всего необходимого фактического материала. В едином целом автор представил современные методы диагностики (газожидкостную хроматографию, метод непрямой иммунофлюоресценции, полимеразную цепную реакцию, иммуноферментный анализ) и культуральное исследование, участвовал в разработке кровяно-сывороточного агара и способа выявления (3-лактамазопродуцирующих штаммов Moraxella catarrhalis. Автор сформулировал положения, выносимые на защиту, выводы и подготовил диссертационную работу.
Положения, выносимые на защиту
-
Определяющей характеристикой микроскопической оценки годности мокроты у детей для культурального исследования является наличие в мазке 1 и более полиморфноядерных лейкоцитов при отсутствии десквамированного плоскоклеточного эпителия, 10 и более полиморфноядерных лейкоцитов при 1-9 клеток десквамированного плоского эпителия, более 25 полиморфноядерных лейкоцитов при 10-24 клеток десквамированного плоского эпителия, в других случаях образцы не должны подлежать бактериологическому анализу.
-
При комплексном подходе к обследованию детей установлено, что помимо основных пневмотропных микроорганизмов, неспорообразующие анаэробы вызывают обострение хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких в 31% случаев.
3. Доказана диагностическая ценность метода газожидкостной
хроматографии для выявления маркеров анаэробной инфекции в
бронхоальвеолярном лаваже, мокроте, плевральном выпоте при обострении
хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.
Научная новизна
Разработан и внедрен «Способ выявления Р-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis» и получено положительное решение от 3 сентября 2012 г. о выдаче патента на изобретение по заявке от 15 июля 2011 г., №2011129509/10.
Разработана и внедрена «Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар)» и получено
положительное решение от 27 июля 2012 г. о выдаче патента на изобретение по заявке от 08 июля 2011 г., № 2011128466/10.
Установлена частота встречаемости серотипов S. pneumoniae, выделенных при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей в Екатеринбурге и Свердловской области.
Определены критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.
По результатам комплексного подхода к обследованию детей установлена частота обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких, вызванных неспорообразующими анаэробами: в монокультуре - 17,8% (Bacteroides spp.; Fusobacterium nucleatum; Peptostreptococcus spp.) и в ассоциации с основными пневмотропными микроорганизмами - 13,2% {Bacteroides spp. + S. pneumoniae; Propionibacterium spp. + Pseudomonas aeruginosa + Escherichia coli; Peptostreptococcus spp. + Bacteroides ureolyticus + Staphylococcus aureus; Eubacterium spp. + Respiratory Syncytial Virus).
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные могут быть использованы в работе практических лабораторий, а также при обучении в медицинском ВУЗе, включающем обучение ординаторов, курсантов факультетов повышения квалификации врачей и последипломной переподготовки специалистов.
Разработан алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей для культурального исследования.
Разработанные питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) и способ выявления Р-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грамотрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к М. catarrhalis позволяют достоверно улучшить этиологическую диагностику обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей, вызванных S. pneumoniae и Р-лактамазопродуцирующими штаммами М. catarrhalis.
Определена область применения метода газожидкостной хроматографии в диагностике обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей.
Установлена частота встречаемости у детей с обострением хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких различных серотипов S. pneumoniae, входящих в состав конъюгированных пневмококковых вакцин.
Предложен комплексный подход к обследованию детей с помощью газожидкостной хроматографии, метода непрямой иммунофлюоресценции, полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа и культурального исследования для увеличения результативности этиологической диагностики обострений хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких.
Внедрение результатов исследования в практику
Разработаны и используются в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики и бактериологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздрава России учебно-методические пособия: 1) «Микробиологическое исследование мокроты у детей»; 2) «Лабораторные методы обнаружения, идентификации и определения резистентности к антибиотикам Moraxella catarrhalis».
Разработаны и внедрены в работу лаборатории клинической микробиологии ГБУЗ СО «ОДКБ № 1» (г. Екатеринбург): 1) алгоритм действий при микроскопической оценке качества мокроты у детей для культурального исследования; 2) способ выявления Р-лактамазопродуцирующих оксидазопозитивных грам отрицательных диплококков, подозрительных на принадлежность к Moraxella catarrhalis; 3) критерии оценки результатов выявления маркеров бактериальной инфекции методом газожидкостной хроматографии при обострении хронических инфекционно-воспалительных заболеваний легких у детей; 4) питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар). Питательная среда для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала (кровяно-сывороточный агар) также внедрена в работу микробиологической лаборатории МБУ «Детская городская клиническая больница №11» (г. Екатеринбург).
Публикации
Автор имеет 48 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 23 научные работы общим объёмом 151 печатная страница, в том числе 6 статей в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 1 работа в зарубежном научном издании.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста, иллюстрированы 23 таблицами и 20 рисунками, состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 153 источника, из них 84 - отечественных и 69 -зарубежных.
