Содержание к диссертации
Введение
Глава I Современные представления об этиологической роли условно патогенных микроорганизмов и способах ее оценки (обзор литературы ) 12
1.1. Особенности взаимодействия условно патогенных микроорганизмов и макроорганизма 13
1.1.1. Биологические особенности условно патогенных микроорганизмов 15
1.1.2. Особенности инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами 18
1.2. Основные подходы к изучению и оценке этиологической роли условно патогенных микроорганизмов 22
1.2.1. Бактериологические исследования 23
1.2.2. Морфофункциональные характеристики условно патогенных микроорганизмов 24
1.2.3. Определение антибиотикочувствительности условно патогенных микроорганизмов 27
1.3. Проявление ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации 29
1.3.1. Кристаллографические методы исследования биологических жидкостей для определения роли условно патогенных микроорганизмов в воспалительном процессе 30
1.3.2. Использование био-тестов для определения реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации 33
Глава II Материалы и методы исследования 38
2.1. Материалы исследования 38
2.2. Микроскопические методы 38
2.2.1. Цитологическое и бактериоскопическое исследование вагинального секрета 38
2.3. Бактериологические методы 40
2.3.1 Бактериологическое исследование вагинального секрета 40
2.3.2. Бактериологическое исследование образцов патологического материала из торакального отделения, ОРИТ и смывов с ИВЛ 40
2.3.3. Бактериологическое исследование раневого отделяемого при открытой травме глаза 41
2.4. Определение антибиотикочувствительности 41
2.5. Биохимические методы 41
2.5.1. Определение фосфолипазной активности Candida albicans на яично-желточной плотной среде 41
2.5.2. Определение фосфолипазной активности Candida albicans на желточно-буферной смеси 42
2.5.3. Определение фосфолипазной активности Pseudomonas auruginosa 42
2.6. Определение бактерицидной активности раневого отделяемого 43
2.7. Морфометрические методы исследования 44
2.8. Кристаллографические методы исследования 45
Глава III Неспецифические и внутрибольничные инфекции 47
3.1. Исследование Candida albicans при различных формах кандидозной инфекции 48
3.1.1. Микроскопические исследования 49
3.1.2. Бактериоскопические критерии различных вариантов кандидозной инфекции влагалища 50
3.1.3. Результаты культурального исследования вагинального секрета 51
3.2. Возможности морфометрического анализа в совершенствовании диагностики кандидозной инфекции 56
3.2.1. Использование морфометрического метода для определения фосфолипазной активности С. albicans 63
3.3. Внутрибольничные инфекции 67
3.3.1. Метод компьютерной морфометрии при оценке вирулентности Pseudomonas aeruginosa 68
3.3.2. Возможности компьютерной морфометрии при оценке антибиотикочувствительности 72
Глава IV Условно патогенные микроорганизмы и инфекционные осложнения при оперативных вмешательствах 77
4.1. Микробиологическое исследование раневого отделяемого 77
4.2. Кристаллография слезной жидкости при открытой травме глаза 79
4.3. Методы определения бактерицидной активности раневого отделяемого 97
Заключение 103
Выводы 114
Список литературы 117
- Особенности инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами
- Использование био-тестов для определения реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации
- Использование морфометрического метода для определения фосфолипазной активности С. albicans
- Методы определения бактерицидной активности раневого отделяемого
Особенности инфекционных процессов, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами
Представления о патогенетических механизмах инфекционных заболеваний человека весьма динамичны. Они стремительно изменяются [96]. Так, в частности, появляются инфекции, вызываемые ранее не известными возбудителями бактериальной, вирусной, прионной или иной природы, резко возросло число заболевании, вызываемых атипичными, в первую очередь лекарственно-устойчивыми, штаммами микроорганизмов. Растет число вялотекущих, стертых и бессимптомных форм, а также число заболеваний, обусловленных, в основном, переходом условно патогенных микробов к паразитированию в организме хозяина. Часто встречаются смешанные инфекции или инфекционные осложнения, вызываемые комбинированным воздействием возбудителей, принадлежащих к различным таксонам, например, вирусно-бактериальные инфекции. В этиологии ряда заболеваний, прежде считавшихся соматическими, обнаруживаются возбудители инфекционной природы [27, 100,137].
Патогенные микроорганизмы опасны для практически здоровых людей. К ним относятся возбудители классических инфекционных заболеваний, с которыми имеют дело врачи специализированных (инфекционных) стационаров. Они всегда возникают при экзогенном заражении и не привязаны к госпитальным условиям, так как иммуносупрессия необязательна для их развития. Главное содержание клинической микробиологии составляют оппортунистические инфекции, изменение структуры и свойств их возбудителей, а также течения вызываемых ими инфекционных процессов [23].
Большинство оппортунистических инфекций относятся к внутрибольничным (госпитальным) осложнениям, поскольку реализация условной патогенности решается в индивидуальных системах «макро-микроорганизм», так как зависит от резистентности хозяина. Повышенная чувствительность характерна для лиц с ослаблением иммунитета - местного или общего, специфического или неспецифического. Таких больных принято называть иммунокомпрометированными, а возбудителей, которым они не оказывают должного сопротивления, - микробами-оппортунистами, или оппортунистическими патогенами (от англ. opportunity — удобный, подходящий случай). Нередко иммунитет компрометируют врачебные процедуры, например использование иммунодепрессантов или инструментальных вмешательств, нарушающих целостность внешних покровов. Именно поэтому с УПМ связана, прежде всего, госпитальная патология: вторичные инфекции или инфекционные осложнения, которыми так богата современная клиника, особенно хирургического профиля [63,64]. Одной из биологических причин, способствующих возникновению и распространению ВБИ, является формирование госпитальных эковаров микроорганизмов, обладающих повышенной устойчивостью к деконтаминирующим (антибиотики, антисептики, дезинфектанты) факторам больничной среды и элиминирующим (микробы-антагонисты, неспецифический и специфический иммунитет) факторам организма человека. В процессе формирования госпитальных эковаров бактерий реализуется 2 механизма: первый - селективное давление антимикробных препаратов на популяцию бактерий, второй - высокая частота генераций и появления генетических изменений в популяциях, прежде всего, за счет передачи внехромосомных факторов (плазмид) и мигрирующих генетических элементов (транспозоны, IS-последовательности и др) [184]. Эти процессы не ограничиваются видом микроорганизмов, поскольку у бактерий закон репродуктивной изоляции не срабатывает, и передача генетического материала может осуществляться между клетками бактерий, относящихся к разным видам, родам и, даже семействам. Следствием этого являются высокие темпы эволюции биологических свойств, прежде всего устойчивости к антимикробным препаратам условно патогенных бактерий, проявляющиеся рядом изменений в этиологии ВБИ, формированием и распространением в стационарах госпитальных эковаров бактерий, высоко адаптированных к абиотическим и живым объектам больничной экосистемы [10, 36, 63]. В современных условиях повышается значение эндогенного механизма инфицирования операционной раны у пациентов при выполнении операций, относящихся к условно-чистым и контаминированным. На большом клинико-бактериологическом материале (1970-2003 гг.) установлена эволюция этиологической структуры ГСИ после интраабдоминальных операций на органах желудочно-кишечного тракта, возрастание роли энтеробактерий, неферментирующих грамотрицательных бактерий и неклостридиальных анаэробов в развитии этих заболеваний, динамика чувствительности-устойчивости возбудителей к большому числу антибактериальных препаратов. Эти данные указывают, что микробиологический мониторинг возбудителей инфекций в области хирургического вмешательства и их чувствительности-устойчивости к антибиотикам и антисептикам служит основой для проведения эмпирической антибиотико- и антисептикопрофилактики и терапии [84,100].
Анализ данных литературы позволил установить основные закономерности этиологии ВБИ и в соматических стационарах: многообразие (бактерии, вирусы, грибы, простейшие) и многочисленность (до 200 видов) видового состава возбудителей при преобладающей роли условно патогенных микробов; полиорганный тропизм возбудителей; полиэтиологичность нозологических форм заболеваний; вегетирование в инфекционном очаге ассоциаций микроорганизмов (возбудители, вспомогательные и индифферентные виды); изменение состава видов в микробиоценозах и вариантов в популяциях микроорганизмов в инфекционных очагах пациентов в процессе болезни; формирование госпитальных (больничных) эковаров и штаммов микроорганизмов — возбудителей ВБИ, высокоадаптированных к больничным условиям обитания и их высокая этиологическая значимость; гетерогенность по различным признакам популяций возбудителей в патологическом очаге у больных; зависимость этиологии от нозологической формы заболевания, типа стационара, характера медицинских вмешательств, методов лечения и диагностики, масштабов и типов использования антимикробных препаратов — антибиотиков, антисептиков и дезинфектантов; высокие темпы эволюции возбудителей [170].
Поскольку едва ли не все из микробов-оппортунистов постоянно или временно входят в состав нормальной микрофлоры, то выраженные дисбиотические процессы в тех или иных биотопах создают прецеденты для развития локальных, т.н. неспецифических воспалительных заболеваний, среди которых следует особо отметить заболевания репродуктивной системы женщины, относящиеся к числу важнейших медико-социальных проблем. По данным многочисленных эпидемиологических исследований среди инфекционно-воспалительных заболеваний женских половых органов все большее значение приобретают воспалительные процессы, этиологическим агентом которых выступают условно патогенные бактерии и грибы (U. urealyticum, Bacteroides spp., Corynebacterium spp., Candida spp. и др.), являющиеся составной частью нормальной микрофлоры. Возрастает роль полимикробных ассоциаций с различной степенью этиологической значимости ассоциантов. Микроэкологические исследования позволили выделить в самостоятельную нозологическую форму "бактериальный вагиноз", при котором показана этиологическая роль ассоциации нескольких видов облигатно анаэробных бактерий и гарднерелл [8, 9, 32, 59, 151, 176,180]. За последнее десятилетие среди инфекций влагалища существенную значимость приобрели неспецифический и кандидозный вагинит, которые являются одной из наиболее часто встречающихся причин обращения к гинекологу [62, 66,78, 87,104,]. В России основными возбудителями кандидозной инфекции признаются Candida albicans - типичные представители условно патогенной флоры [131, 132,157]. Особенностями неспецифических инфекционных заболеваний влагалища являются стертая симптоматика, как правило, слабо выраженная воспалительная реакция, в большинстве случаев - микстинфекция. Обнаружение отдельных видов микроорганизмов в составе вагинальной микрофлоры не позволяет дать объективную оценку состояния микроценоза и решить вопрос о необходимости проведения этиотропной терапии. С микроэкологических позиций стала очевидной необходимость пересмотра сложившихся представлений о вагинальных инфекциях, вызванных УПМ. Необходимо иметь в виду, что не каждый присутствующий в патологическом очаге микроорганизм, является "соучастником" инфекционного процесса, и для признания его возбудителем необходимы четкие диагностические критерии, которые в большинстве случаев не разработаны.
Использование био-тестов для определения реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации
Достаточно интересным и перспективным с точки зрения оценки уровня реактивности макроорганизма в зоне первичной колонизации представляется использование биолюминесцентных тестов для определения бактерицидной активности сыворотки крови (БАК) и других биологических жидкостей. В основу данной группы методов была положена оценка изменения (преимущественно снижения) интенсивности биолюминесценции тест систем после воздействия на них анализируемого вещества [38,40,41]. При этом важными особенностями, выгодно отличающими их от прочих инструментов биоиндикации, являются быстродействие, точность и чувствительность.
Наряду с общепринятым нефелометрическим методом регистрации «гашения свечения», широко используются и биолюминометры, усиливающие и регистрирующие сигнал в автоматическом режиме. Широкую популярность приобретает применение люминисцентных тест систем, на основе морских светящихся бактерий и рекомбинантного штамма Escherichia coli Z905, несущего плазмиду с lux-опероном Photobacterium leiognaty. Следует сказать, что клонирование различных lux-оперонов в микроорганизмах Escherichia coli, проявляющих свойства как комменсалов, так и потенциальных патогенов, создало условия для формирования принципиально нового направления использования биолюминесцентного анализа в биологии и медицине — тестирование различных биологических жидкостей и биосред макроорганизма с акцентом на определение их противоинфекционной резистентности [41].
Гашение люминесценции бактериальных биосенсеров обусловлено воздействием антибактериальных агентов на клеточную стенку микроорганизма. Следует отметить, что интенсивность гашения люминесценции Escherichia coly Z905 и «Эколюм -5» достоверно коррелируют с развитием бактерицидного эффекта, а также величинами бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК), определенной традиционным нефелометрическим методом. По мнению ряда авторов [44, 139], многие физиологические жидкости (моча, желчь и др.), содержащие в норме незначительное количество бактерицидных компонентов, являются неплохим питательным субстратом и оказывают на свечение бактериальных биосенсеров стимулирующее действие. Данная ситуация меняется при развитии различных инфекционных состояний, сопровождающихся появлением в составе биологических жидкостей бактерицидных компонентов сывороточного или лейкоцитарного происхождения, что приводит к ингибиции бактериальной люминесценции. В этом контексте использование биолюминесцентного анализа при динамических наблюдениях позволяет интегрально оценить уровень активности компонентов бактерицидных систем в составе биологических жидкостей и, таким образом, провести дифференциацию между инфекционными и неинфекционными патологическими состояниями.
По данным ряда авторов совершенствование лабораторного исследования должно базироваться на применении наукоемких технологий и компьютеризации технологической цепи лабораторного анализа [134, 129, ]. Однако необходимо четко представлять, что клиническая микробиология занимает несколько обособленное место среди других специальностей, связанных с лабораторной диагностикой. Это обусловлено тем, что в процессе микробиологической диагностики сохраняется значительная доля субъективизма. В первую очередь речь идет об оценке клинической значимости выделенных микроорганизмов. Микроскопия патологического материала (мокроты, раневого отделяемого, мочи и др.), составляющая основу любого квалифицированного исследования, последующая оценка результатов первичного посева остаются чисто "ручной" работой. Выявить «атипичные» формы микроорганизмов и оценить их информативность может лишь специалист, используя микроскопические методы. В данной ситуации весьма перспективным и интересным представляется использование «частичной» компьютеризации [150, 168]. Объектами изучения могут стать изображения колоний, мазков-препаратов, микрофотографии, полученные при фазаво контрастной и темнопольной микроскопии, а также данные флюоресцентной микроскопии, рентенограммы, электроннограммы т.д. В области интерактивного анализа основными помощниками человека становятся различные графические пакеты, самыми известными из которых можно считать, «Image-Pro», «MorphoFix», «Морфология-мастер», «Морфотест» и некоторые другие, менее известных фирм, но зачастую очень удобные и полезные ]. Среди них много и бесплатных систем, например, очень удачный продукт "ImageJ". Внедрение в практику морфометрических программ, адаптированных для оценки полученных результатов лабораторных исследований помогут объективизировать последние, и подойти к их оценке с позиций доказательной медицины. Подобная практика нашла применение в цитологических, генетических, иммунологических исследованиях. В литературе приводятся данные об использование универсальной компьютерной программы идентификации стафилокков для исследования диагностической эффективности тест-систем [39] , основанной на статистическом кластерном анализе. Использование цитоанализаторов, автоматизирующих рутинные операции фотометрии клеток мазков крови, позволила создать новый уровень применения стандартных количественных цитологических тестов, таких как подсчет лейкоцитарной и эритроцитарной формул, определение гистограммы распределения гемоглобина в эритроцитах и так далее [31, 136]. Морфологические характеристики клетки могут быть получены и при использовании методов световой микроскопии, однако, при этом математически точные размеры клеток, ядер, соотношения ядра и цитоплазмы, определить невозможно. Компьютерный анализ морфологических структур является перспективным методом исследования, который открывает совершенно новые возможности для морфологов, позволяя получить максимум информации из изучаемого объекта, обработать большое количество данных, значительно повысить точность и производительность морфометрических исследований. Создание компьютерных баз данных оцифрованных изображений позволяет хранить информацию в удобном формате и облегчает доступ к ним для их дальнейшей обработки.
Клиническая практика показала, что успех терапии и особенно отдаленные результаты лечения инфекций зависят не только от элиминации бактерий, вызвавших заболевание, но и от полноты восстановления состояния нормоценоза. При наличии электронной базы данных легко сопоставить микроскопические картины мазков-препаратов при поступлении, в процессе лечения и в период реконвалесценции, что может быть использовано как дополнительный фактор контроля.
Использование морфометрического метода для определения фосфолипазной активности С. albicans
Наряду со сравнительным анализом морфологических и культуральных характеристик грибковых культур, особый интерес представляло определение их фосфолипазной активности (ФЛА), которая рассматривается как основной, коррелирующий с другими, фактор патогенности С.albicans [192, 193 ]. Существующий метод биохимического определения этого фермента продолжителен во времени, требует специального оборудования и обученного персонала. Мы разработали и апробировали оригинальную методику, позволяющую различать штаммы грибов по степени их болезнетворности, что может быть использовано в качестве дополнительного дифференцирующего критерия в клинически спорных случаях.
Для определения ФЛА влагалищный секрет высевали на чашки с плотной средой Сабуро с добавлением яичного желтка. Посевы выдерживали в термостате в течение двух суток при Т=37С. О наличии ФЛА и степени ее выраженности, определяющей вирулентность грибов С.albicans, судили по образованию зоны опалесцирующего просветления ("венчика") вокруг колоний (Рис.3.6). С помощью компьютерной морфометрии оценивали результат, измеряя диаметр 10 произвольно выбранных колоний и ширину "венчика" вокруг них. Основным критерием для дифференцировки двух анализируемых объектов (колония и ободок ФЛА) служила разница их оптических плотностей, регистрируемая компьютером (рис.3.6). Диаметр колонии и ширина ободка фосфолипазной активности измерялись в автоматическом режиме, результаты заносились в электронную таблицу.
В серии специальных экспериментов мы проверяли, насколько получаемые величины Кв для каждой изученной культуры согласуются с результатами традиционного биохимического исследования фосфолипазной активности в анализируемом образце. При этом была установлена сильная прямая связь между показателями ФЛА (у.е.) и предлагаемого нами Кв (г=0,91). В таблице 3.7. приведены результаты, полученные при сравнительном исследовании пяти произвольно выбранных штаммов, уровень ФЛА которых был определен по предлагаемой методике и по измерению в культуральной жидкости, полученной после 24 часов инкубации этих же культур на жидкой среде.
Наличие других липаз, которые могли бы присутствовать у C.albicans, было исключено биохимическим методом.
Используя предлагаемую методику, мы проанализировали ФЛА групп сравнения. Полученные результаты показали следующее: степень вирулентности выделенных штаммов по предлагаемому критерию была различной: в группе Ша она соответствовала "авирулентным": ФЛА была не выражена, а Кв составил от 0,25 до 0,45. В группе Шб - "патогенным" (ФЛА выражена, Кв колебался в диапазоне от 0,62 до 0,92). Систематизированные результаты морфофункциональных характеристик культуры C.albicans, полученные с применением компьютерных технологий, представлены в таблице 3.8.
Анализ полученных данных позволил сделать следующие выводы: показатели фосфолипазного теста, выполненного по предложенной методике, коррелируют с результатами общепринятых методов определения ФЛА, а метрические характеристики клеток и колоний, полученные при их морфометрическом анализе, отражают степень вирулентности С. albicans Методы компьютерной морфометрии дают дополнительную информацию о состоянии популяции, позволяют оценивать этиологическую значимость микроорганизмов, в частности С. albicans, в инфекционном процессе с позиций доказательной медицины, объективизируя результаты исследований, и могут быть использованы при дифференциальной диагностики различных форм вагинального кандидоза. Эти же критерии могут быть применены и для определения целесообразности проведения антимикотической терапии, а также оценки её эффективности.
Методы определения бактерицидной активности раневого отделяемого
Следует отметить, что воспаление служит патогенетической основой большинства инфекционных процессов. Оно возбуждается микробной инвазией и эволюционирует вместе с ней. Воспалительные реакции, возникая в ответ на повреждение, направлены на восстановление гомеостаза, развиваясь или подвергаясь обратному развитию вместе с решением этой задачи. Отсюда символическая формула: эволюция воспаления есть эволюция повреждения [80]. При хирургических вмешательствах повреждающее действие операционной травмы становится фоном, на котором либо возникает и прогрессирует инфекционное осложнение, либо флогогенные факторы устраняются, и происходит репарация поврежденных тканей. Помешать микробной колонизации раневой поверхности самый простой способ заблокировать инфекционный процесс. Раневое отделяемое должно обладать выраженной антиколонизационной активностью, т.к. содержит антиадгезивные, биостатические, биоцидные факторы. Динамика их активности может в существенной степени отражать постоперационнное состояние в зоне хирургических вмешательств. В нашей работе мы предприняли попытку оценить степень бактерицидной активности раневого отделяемого, используя метод люминесцентной микроскопии и компьютерной морфометрии. Анализ влияния проб раневого отделяемого на свечение использованного рекомбинантного штамма E.coli выявил прогрессирующее падение уровня люминесценции по мере увеличения времени контакта с раневым отделяемым.
При этом мы наблюдали эффекты, аналогичные описанным для сыворотки крови [38]. Ингибирующее действие проявлялось уже к 10-минуте инкубации, достигая максимума к 30 минуте, и в дальнейшем достоверно не изменялось. При параллельном исследовании проб (рис.4.11) была прослежена выраженная взаимосвязь между подавлением свечения (количеством светящихся клеток) и долей бактерий, выживших после 10, 20, 30, 40 мин контакта с образцами раневого отделяемого, определенная на основе бактериологического исследования. Вместе с тем, число клеток, сохранивших жизнеспособность после 30-40 мин экспозиции, и определенных при посеве на плотную питательную среду, оказалось вдвое больше, чем количество «светящихся» объектов. По крайней мере, показатель интенсивности свечения большинства анализируемых объектов был ниже уровня , заданного в качестве основного критерия в начале эксперимента, и такие клетки не попадали в «зону обсчета».
E.coli -доля выживших клеток, определенная бактериологическим методом -доля выживших клеток, определенная с учетом их люминесценции Поскольку ранее было показано (1), что тушение бактериальной люминесценции отражает воздействие на клеточную стенку комплекса бактерицидных факторов (комплемент, лизоцим, Р-лизин и т.д.), то снижение числа объектов, соответствующих заданным компьютерной программой порогам яркости и регистрируемым в автоматическом режиме, может быть связано не только с проявлением бактерицидного, но и бактериостатического воздействия раневого отделяемого. Такой эффект не выявляется посредством культурального метода, хотя и отражает ответную реакции в очаге инфекции. На основании проведенных исследований был предложен коэффициент бактерицидности (Кб), рассчитанный по формуле: Кб = (Ак - А0)/Ак х 100, где Ак и А0- средние значение количества светящихся объектов, определенные при автоматизированном обсчете 10 полей зрения в контроле и опыте соответственно. При значении Кб 60% интенсивность воспалительной реакции оценивали как высокую, соответствующую развитию инфекционно-воспалительного осложнения в зоне 101 хирургического вмешательства. Динамические наблюдения за БАРО показали, что её максимальные значения проявлялись спустя сутки после операции. Поскольку во всех случаях наблюдали положительную динамику послеоперационного процесса, изменения БАРО носили однотипный характер, и к 6 суткам ее уровень снижался на 27 - 34%. Четкая визуализация светящихся объектов на темном фоне при УФ- микроскопии и использование возможностей цифровой фотографии работать в режиме «стоп кадр» позволяют с высокой степенью достоверности зафиксировать полученный результат (Рис.4.12).
Нам представляется, что ингибирующий эффект, учтенный по тушению люминесценции, с большей степенью чувствительности отражает анализируемое влияние раневого отделяемого, однако, достоверность такого предположения должна быть доказана.
Влияние раневого отделяемого на рекомбинантный штамм E.coli K12TG1, несущие гены lux-оперона морской люминесцирующей бактерии Photobacterium leoignathi, при 37 С обусловливает эффект тушения люминесценции, возрастающей по мере удлинения времени контакта. Снижение люминесценции является следствием бактерицидного воздействия на рекомбинантные штаммы E.coli, что подтверждается совпадением результатов тестирования БАРО с использованием традиционного бактериологического метода.
Таким образом, предложенная модификация метода определения бактерицидной активности, основанная на микроскопической регистрации эффекта тушения люминесценции рекомбинантного штамма E.coli, несущего гены lux-оперона, при определении БАРО позволяет получать результаты с высокой степенью соответствия традиционному бактериологическому анализу, а использование компьютерных технологий в оценке результатов проводимого исследования, придает методике экспрессность и повышает его объективность.
