Введение к работе
Актуальность проблемы
На сегодняшний день инфекционные заболевания урогенитального тракта, вызываемые видом Chlamydia trachomatis, являются одной из серьезных проблем здравоохранения вследствие своего широкого распространения и доказанного риска тяжелых клинических осложнений при отсутствии своевременного лечения (Гранитов В.М., 2002; Дмитриев Г.А., 2003; Carlson J.H., 2008).
В диагностике урогенитального хламидиоза значительная роль отводится лабораторным исследованиям, так как от точности поставленного этиологического диагноза зависит успех лечения инфекции (Савичева А.М., 2007). В настоящее время существует большое количество лабораторных тестов с различной чувствительностью и специфичностью, что создает предпосылки для разночтений при интерпретации результатов, и, следовательно, в постановке диагноза (Аликберов Ш.А., 2007; Bachmaier K., Penninger J.M., 2005).
Выделение хламидий в культуре клеток длительное время являлось «золотым стандартом», с которым сравнивали новые методы диагностики, не связанные с выявлением жизнеспособности микроорганизма. Однако культуральное исследование – это сложная и требующая достаточного времени процедура, для которой нет стандартизированных подходов. Информативность метода во многом зависит от условий забора и транспортировки клинического материала, качества клеточных линий и питательных сред, вариантов детекции хламидий, исправности оборудования и других факторов (Domeika M., 2002). Поэтому в последние годы для диагностики хламидиоза широко применяются молекулярные методы, в основе которых лежат амплификационные технологии. В отличие от культурального метода исследования, они не требуют специальных условий транспортировки клинического материала для сохранения жизнедеятельности возбудителя и обладают высокой специфичностью, чувствительностью и быстротой выполнения. Однако использование ряда коммерческих тест-систем, основной мишенью которых при выявлении Ch.trachomatis, является участок нуклеотидной последовательности видоспецифической криптической плазмиды, выявлена достаточно серьезная проблема. В случае мутации в ДНК-мишени или появления бесплазмидных вариантов хламидий, возможны серьезные диагностические ошибки, ведущие к искажению результатов, а, в ряде случаев, к неверной постановке диагноза, как это произошло при появлении «шведского варианта» Ch.trachomatis (Stary A., 2007; Ripa T., Nilsson P.A., 2007).
Наряду с урогенитальными широко распространены респираторные хламидиозы, к числу которых относят острые респираторные заболевания и пневмонии, возникающие в результате заражения как Ch.trachomatis, так и Chlamydophila pneumoniae (Малкова Е.М. с соавт., 2003). Создание универсальной ПЦР-системы для выявления и видовой дифференциации ДНК хламидий как из урогенитального тракта (Ch.trachomatis), так и верхних дыхательных путей (Ch.trachomatis или Chl.pneumoniae) представляет собой актуальную задачу для практического здравоохранения.
Сообщения последних лет свидетельствуют о возникновении проблемы резистентности хламидий к антибиотикам (Dessus-Babus S. et al.,1998; Somani J. et al., 2000). Определение чувствительности к лекарственным препаратам культуральным методом сопряжено с трудностями стандартизации процедуры и интерпретации результатов (Шипицына Е.В. с соавт., 2004). Поэтому исследования отечественных и зарубежных ученых направлены на разработку методических подходов оценки наличия в ДНК микроорганизмов генетических детерминант, определяющих устойчивость к антибиотикам (Мисюрина О.Ю. с соавт., 2002; Хулуп Г.Я. с соавт., 2006).
Среди Ch.trachomatis выделяют 19 генотипов, которые отличаются распространенностью в популяции, клеточным тропизмом, вирулентностью и иммуногенностью (Полещук Н.Н., Рубаник Л.В., 2005; Hsu M.-C. et al., 2006; Gao X. et al., 2007). Типирование хламидий не имеет значения для постановки клинического диагноза, но является важной частью в эпидемиологическом исследовании, в изучении клинических проявлений, ответа на лечение, а также в создании вакцины (Morre S.A. et al., 2000; Ngandjio A. et al., 2003). В связи с тем, что эталонный метод генотипирования, основанный на секвенировании гена omp1, кодирующего основной белок наружной мембраны хламидий, сопряжен с рядом трудностей и не доступен для рутинных исследований, актуальным представляется вопрос о нахождении альтернативных путей типирования Ch.trachomatis.
Таким образом, трудности дифференциальной диагностики урогенитального хламидиоза, а также недостаточная информативность традиционно используемых методов подтверждают актуальность проблемы, в связи с чем возрастает роль научных исследований, направленных на совершенствование диагностики заболевания.
Цель исследования
Совершенствование диагностики урогенитального хламидиоза на основе сравнительного анализа диагностической значимости прямых методов детекции хламидий, их модификации и предложения алгоритма применения.
Задачи исследования
-
Оценить информативность лабораторных методов диагностики урогенитального хламидиоза в зависимости от характера течения инфекционного процесса.
-
Разработать ПЦР-систему для одновременного выявления и видовой дифференциации ДНК Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis, а также ПЦР-систему для верификации штаммов Ch.trachomatis, выделенных от человека, с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды.
-
Разработать способ генотипирования штаммов Ch.trachomatis методом ПЦР.
-
Установить наличие генетических детерминант антибиотикорезистентности штаммов хламидий методом ПЦР.
-
Подобрать оптимальные условия культивирования Ch.trachomatis и определить набор методических приёмов для детекции хламидий в культуре клеток.
-
Дать оценку диагностической значимости лабораторных методов выявления Ch.trachomatis с учетом их модификаций и предложить алгоритм прямой детекции хламидий в клиническом материале.
Научная новизна
Полученные в ходе диссертационной работы данные расширяют представление о методах диагностики урогенитального хламидиоза.
Дана оценка степени информативности различных методов лабораторной диагностики УГХ в зависимости от характера течения инфекционного процесса. Установлено, что наиболее сильная корреляционная связь прослеживается при клинически выраженной форме инфекции - с положительными результатами ПЦР и ИФА, средняя - с положительными результатами культурального и цитологического исследования. При бессимптомном процессе выявляется сильная корреляционная связь - с положительными результатами ИФА, средняя - с ПЦР, слабая корреляция - с сочетанием положительных результатов культурального и цитологического исследований.
Впервые разработанный способ видовой ПЦР-детекции хламидий позволяет одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Ch.trachomatis и Chl.pneumoniae, а способ ПЦР-верификации участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды - фенотипические особенности возбудителя, выделенного от человека.
Впервые показана возможность молекулярно-генетического типирования штаммов Ch. trachomatis, выделенных от человека, методом ПЦР, что обеспечивает повышение информативности и упрощает исследование по сравнению с существующими способами генотипирования.
Практическая значимость
Результаты проведенных исследований позволяют оптимизировать алгоритм прямой детекции хламидий в биологическом материале и свидетельствуют о необходимости комплексного лабораторного обследования, с использованием модифицированных методов выявления хламидий с целью повышения их диагностической ценности для постановки диагноза.
Применение разработанной ПЦР-системы для видовой дифференциации хламидий, выделенных от человека, позволяет одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis.
Применение разработанной ПЦР-системы для верификации участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды Ch.trachomatis позволяет свести к минимуму наличие ложноотрицательных результатов при диагностике возбудителя.
Разработанный способ молекулярно-генетического типирования штаммов Ch.trachomatis, выделенных от человека, методом ПЦР позволяет в короткие сроки установить генотип возбудителя. Метод применим в стандартных лабораториях, оснащенных ПЦР-оборудованием, и адаптирован для рутинных исследований при хламидиозе.
Внедрение результатов работы в практику
В результате выполненной работы получены три Патента РФ на изобретение: «Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385946 (зарегистрирован 10.04.2010); «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385945 (зарегистрирован 10.04.2010); «Способ генотипирования Chlamydia trachomatis» № 2443782 (зарегистрирован 27.02.12).
Результаты исследований и разработок внедрены в научно-исследовательскую работу лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
После проведения в 2013 году лабораторных испытаний планируется коммерческий выпуск тест-систем на основе разработанных методов для видовой дифференциации хламидий, обнаружения штаммов Ch.trachomatis с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды, а также генетического типирования штаммов с целью дальнейшего использования в практике здравоохранения.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Установлена положительная взаимозависимость между обнаружением хламидий или их маркеров в клиническом материале и характером течения инфекционного процесса.
2. Впервые разработанные ПЦР-системы для диагностики хламидийной инфекции у людей позволяют одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis, а также верифицировать штаммы Ch.trachomatis с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды.
3. Разработанный метод генетического типирования штаммов Ch.trachomatis, основанный на ПЦР-амплификации специфического участка гена omp1, позволяет производить внутривидовую дифференциацию хламидий в стандартных лабораториях, оснащенных ПЦР-оборудованием.
4. Использование комплекса модифицированных методов прямой верификации хламидий повышает информативность лабораторной диагностики хламидийной инфекции.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании секции Учёного Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 1 от 31 января 2013 г.
Результаты диссертационной работы были представлены на XV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008 г.); XVI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2009 г.); XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010 г.); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.); The 3rd Congress of European Microbiologists "Microbes and Man - interdependence and future challenges” (Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009).
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательской работы ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора - «Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при различных патологических состояниях» (Рег.№ 01.2.006 08844) и «Определение функционально-значимых геномных молекулярных детерминант, определяющих таксономическую принадлежность, вирулентность и антибиотикорезистентность возбудителей инфекционно - воспалительных процессов респираторного, урогенитального и кишечного трактов» (Рег.№ 01201157147).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 7 - в рецензируемых изданиях; 1 – в центральной печати; 6 - в сборниках материалов конференций; 1 книга в соавторстве.
Структура и объем и диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах печатного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследований (глава 2), собственные исследования (глава 3 из пяти подразделов), обсуждение полученных результатов (глава 4), выводы, практические рекомендации, список цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 15 таблицами. В библиографическом указателе приведен 191 источник, из них 75 –на русском и 116 – на иностранном языках.
