Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Совершенствование серологической диагностики легионеллеза Карбышев Гериард Львович

Совершенствование серологической диагностики легионеллеза
<
Совершенствование серологической диагностики легионеллеза Совершенствование серологической диагностики легионеллеза Совершенствование серологической диагностики легионеллеза Совершенствование серологической диагностики легионеллеза Совершенствование серологической диагностики легионеллеза
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Карбышев Гериард Львович. Совершенствование серологической диагностики легионеллеза : диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.07 / Карбышев Гериард Львович; [Место защиты: ГОУВПО "Ростовский государственный медицинский университет"].- Ростов-на-Дону, 2006.- 0 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность проблемы

Болезнь легионеров - острое лихорадочное заболевание, вызываемое группой микроорганизмов, относящихся к семейству Legionellacaea Ведущее значение играет Legionella pneumophila серогруппы 1, с воздушно-капельным механизмом передачи и поражением верхних дыхательных путей в виде респираторной лихорадки Понтиак и нижних дыхательных путей в виде острых пневмоний (Прозоровский С В с соавт, 1984)

История изучения болезни легионеров началась с 1976 г и была связана с изучением вспышки острых респираторных заболеваний среди участников конференции «Американского легиона», который проходил с 21 по 28 июля 1976 г в отеле Белью-Стратфорд в Филадельфии Уже 2 августа в Центр по контролю за болезнями в г Атланте поступила информация о смерти трех пациентов с диагнозом тяжелой пневмонии Вскоре было установлено массовое поступление больных с симптомами атипичной пневмонии, а эпидемиологическое расследование показало, что подавляющее большинство больных были участниками указанной конференции Всего был госпитализирован 221 участник конференции с симптомами пневмонии, из которых 34 умерли

В последние годы в различных странах отмечен ряд крупных эпидемических вспышек легионеллеза В 1996 г во время круизных рейсов по Карибскому морю зарегистрировано 50 случаев легионеллеза (Jernigan D В et al, 1996) В 1999 г в Бельгии при проведении торговой ярмарки зарегистрировано 93 случая легионеллеза, из которых 5 больных умерли (Pascual М F et al, 2002) В 1999 г в Нидерландах при проведении выставки цветов зарегистрировано 188 случаев легионеллеза (Den Boer J W et al, 2002, Lettinga К D et al, 2002) В 2001 г во Франции от больных с пневмониями выделено 259 культур легио-нелл различных видов и серогрупп (Doleans A et al, 2002) В 2001 г в Испании зарегистрирована крупнейшая вспышка легионеллеза, во время которой заболело около 800 человек (Garcm-Fulgueiras A et al, 2003)

Частота легионеллеза среди лиц, госпитализируемых в стационары с диагнозом «пневмония», в среднем в Европе и США оценивается от 2 до 15% (Muder R R et al, 1989) По данным Центра по контролю за болезнями в г Атланте (CDC), ежегодно в США регистрируют от 10000 до 18000 случаев легионеллеза По данным агентства производственной безопасности и здравоохранения США (OSHA) число ежегодных случаев легионеллеза составляет 25000, из которых 4000 умирают, а по данным Американского общества микробиологов (ASM) среди больных с пневмониями, госпитализируемых в отделения интенсивной терапии, легнонеллез является причиной 15-30% случаев {Legionella 2003, AWT, 2003)

Частота вігутрибольничного легионеллеза может колебаться от 16,3% среди больных с приобретенными пневмониями до 76% среди больных с различ-

ными формами вторичных иммунодефицитных состояний (Grosserode М , 1993, Junge-Mathys Е, Mathys W , 1994)

На территории нашей страны легионеллез впервые зарегистрирован в 1979 г (Прозоровский С В с соавт, 1984, 1987), а в последующем отмечены спорадические и отдельные групповые вспышки заболеваний (Беленький С Н , 1984, Покровский В И с соавт , 1988, Прозоровский С В с соавт, 1987, Сакварелидзе Л А с соавт, 1990)

Частота выявления легионеллеза среди больных пневмонией колеблется от 10,7% до 12,2% (Покровский В И с соавт, 1988, Тартаковский И С с соавт, 1989, Меморандум ВОЗ, 1990) При сероэпидемиологическом исследовании в группах риска частота положительных результатов колеблется от 1% до 55,4% (Васильева В И с соавт, 1986, Герчикова Н М с соавт, 1990)

В настоящее время описано 48 видов Legionella, включающих 69 отдельных серогрупп (Fields В S et al, 2002). Вид L pneumophila представлен 15 серо-группами В США 90% случаев легионеллеза связаны с L pneumophila и 79% из них - с серогруппой 1 (Marston В J et al, 1994) По данным Weekly Epidemiology Record (WER), возбудителем легионеллеза в Европе в 95,9% случаев является L pneumophila, а среди них лидирующее место занимает серогруппа 1, которую выделяют от больных в 70,8% случаев Среди других серогрупп от больных выделяют серогруппу 3 в 5% случаев и серогруппу 6 - в 3,1% случаев

Однако это заболевание продолжает оставаться малоизвестным в нашей стране Отсутствие патогномоничной клинической картины, зачастую неопределенные данные эпидемиологического анамнеза делают лабораторные методы решающими при установлении диагноза болезни легионеров

Безусловно, «золотым стандартом» диагностики инфекционных заболеваний является бактериологический метод В то же время, практика диагностики инфекционных болезней свидетельствует о большой роли и значимости серологических методов диагностики

Анализ данных литературы свидетельствует о важной роли серологических методов диагностики легионеллеза, необходимости использования коммерческих тест-систем для выявления возбудителя, его растворимых антигенов в клиническом материале и объектах окружающей среды, идентификации и серологического типирования По данным WER, удельный вес серологических методов диагностики колебался от 70% до 78,2%, бактериологического метода -от 17% до 21,6% и ПЦР - диагностики - от 0,83% до 11%

В настоящее время для выявления антител к возбудителю легионеллеза используют три метода реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), иммуноферментный анализ (ИФА) и микроагглютинацию (РА) (Меморандум ВОЗ, 1990) Кроме общепринятых мщгрдов используют и реакцию латексной агломерации, которая является более чувствительной, чем РНИФ и выявляет антитела в диагностических титрах на ранних стадиях заболевания - до 10 дня (Harrison ТС et al, 1987, Friis-Moller A et al, 1986, Maine T J. et al, 1986, Scar-liniG etal, 1986)

Методы обнаружения легионеллезного антигена используют в качестве

экспрессных на ранних стадиях заболевания и широко применяют для диагностики легионеллеза Они включают ИФА, радиоиммунный анализ и реакцию прямой иммунофлтооресценции (РИФ) (Меморандум ВОЗ, 1990) Легионеллез-ный антиген методом ИФА был обнаружен в моче больных еще во время вспышки заболеваний в Филадельфии в 1976 г (Berdal ВР et al, 1979) Дальнейшие исследования позволили предложить метод ИФА для окончательного подтверждения диагноза (Plouffe J Г et al, 1995) на ранних стадиях заболевания - в первые 2-3 дня (Birtles R J et al, 1990, Formica N et al, 2001, Helbig J H et al, 1989, Kashuba AD et al, 1996, Plouffe J F et al, 1995) По данным WER, среди серологических методов, используемых для диагностики в Европе, доля методов выявления антигена в моче в ИФА выросла с 16% до 45%

Для выявления и серологической дифференциации легионелл японские исследователи предложили реакцию коагглютинации (Yoh М et al, 1985) Показано преимущество реакции коагглютинации в сравнении с агглютинацией на стекле по чувствительности и специфичности, поскольку коагглютинирующий диагностикум не давал перекрестных реакций (Yoh М et al, 1985)

В настоящее время в России отсутствуют сертифицированные тест-системы для серологической диагностики легионеллеза

В связи с изложенным, актуальной проблемой в настоящее время является совершенствование серологической диагностики легионеллеза путем создания надежных отечественных препаратов и тест-систем для выявления специфических антител в сыворотках крови, антигена в биологическом материале и объектах окружающей среды, идентификации и серологического типирования возбудителей а также разработка критериев диагностики

Цель и задачи исследования

Целью работы является научное обоснование методических подходов к конструированию препаратов для серологической диагностики легионеллеза, создание антигенных и иммуноглобулиновых диагностикумов с известными свойствами, получение диагностикумов для серологической идентификации L pneumophila, оценка диагностической значимости методов и разработка критериев и алгоритма диагностики легионеллеза

Для достижения указанной цели необходимо решение следующих задач

  1. Изучение антигенной структуры L pneumophila различных серогрупп, поиск иммуногенных белковых и липополисахаридных антигенов, имеющих диагностическое значение

  2. Подбор условий получения растворимого антигена L pneumophila серо-группы 1 с известным антигенным составом для использования его в качестве сенситина при конструировании антигенных вариантов диагностикумов и характеристика его антигенных свойств

  3. Подбор схем иммунизации и получение различных вариантов гипериммунных кроличьих легионеллезных сывороток

  4. Конструирование диагностикума легионеллезного серогруппы 1 антигенного полимерного сухого для реакции объемной агломерации (РАО) Изуче-

ниє чувствительности и специфичности Изучение препарата в практике диагностики заболеваний органов дыхания

  1. Конструирование диагностикума легионеллезного серогруппы 1 имму-ноглобулинового полимерного сухого для РАО Изучение чувствительности и специфичности Определение показаний к практическому использованию диагностикума

  1. Конструирование набора легионеллезных коагглютинирующих диагно-стикумов Изучение чувствительности и специфичности Изучение препаратов в практике бактериологических исследований на легионеллез

  2. Разработка критериев оценки результатов использования комплекса тестов и алгоритма диагностики легионеллеза

Научная новизна

Впервые с использованием современных методов изучен антигенный состав L pneumophila семи серогрупп, наиболее часто встречающихся в патологии человека Получены новые данные об иммуногенных свойствах белковых и липополисахаридных антигенов, имеющих диагностическое значение при конструировании тест-систем

Впервые показано, что, несмотря на гетерогенность по степени иммуно-генности, белковые антигены L pneumophila являются общими для различных серогрупп

Впервые научно обоснован процесс оптимизации получения растворимого антигена с известными антигенными свойствами для использования его в качестве сенситина при производстве диагностических препаратов

Впервые получен легионеллезный антигенный полимерный диагностикум для определения в сыворотках крови специфических антител к различным се-рогруппам L pneumophila

Разработаны новые научно-методические подходы к получению гипериммунных сывороток для конструирования иммуноглобулиновых полимерных и коагглютинирующих диагностикумов, а также для анализа антигенной структуры L pneumophila различных серогрупп

Получены новые данные о спектре антигенспецифических антител при формировании гуморального иммунного ответа в результате иммунизации лабораторных животных L pneumophila семи серогрупп

Разработаны критерии для оценки результатов применения комплекса диагностических тестов при проведении диагностики болезни легионеров

Теоретическая значимость

Анализ перекрестных иммуноблоттингов L pneumophila семи серогрупп с кроличьими гипериммунными сыворотками против семи серогрупп позволил классифицировать белковые антигены по свойству иммуногенности на высоко, средне и низкоиммуногенные, что несет высокую степень информативности и перспективно для дальнейшего изучения антигенной структуры L pneumophila

Полученные на основе отработанных методических подходов кроличьи

гипериммунные сыворотки против L pneumophila семи серогрупп, обогащенные антителами к белковым и липополисахаридным антигенам, перспективны для дальнейшего изучения антигенной структуры L pneumophila различных серогрупп и конструирования новых диагностикумов

Предложенные методические подходы иммобилизации растворимого ле-гионеллезного антигена позволяют оптимизировать процесс создания препаратов для диагностики легионеллеза и получать антигенные варианты диагностикумов с заданными свойствами

Анализ перекрестных иммуноблоттингов L pneumophila семи серогрупп с кроличьими гипериммунными сыворотками против семи серогрупп позволил оценить гуморальный иммунный ответ экспериментальных животных по аффинности образующихся специфических антител, что перспективно для изучения особенностей иммунного ответа у людей при легионеллезе

Практическая значимость

Разработана технология получения растворимого антигена L pneumophila серогруппы 1 с известными антигенными свойствами для использования в качестве сенситина при конструировании антигенных вариантов тест-систем для серологической диагностики легионеллеза

Разработана технология получения кроличьих гипериммунных сывороток против L pneumophila семи серогрупп, обогащенных антителами к белковым и липополисахаридным антигенам, с целью анализа антигенной структуры и конструирования иммуноглобулиновых полимерных и коагглютинирующих диагностикумов

Сконструирован и внедрен в практику диагностикум легионеллезный серогруппы 1 антигенный полимерный сухой для РАО, предназначенный для серологической диагностики легионеллеза у людей, вызванного L pneumophila различных серогрупп Диагностикум прошел Государственные испытания в ГИСК им Л А Тарасевича и решением Комитета медицинских иммунобиологических препаратов рекомендован к регистрации в РФ (Протокол №7 от 19 12 2002 г)

Сконструирован диагностикум легионеллезный серогруппы 1 иммуногло-булиновый полимерный сухой для РАО Диагностикум может быть использован для выявления легионеллезного антигена в моче у больных с целью серологической диагностики заболевания, а также для серологической идентификации L pneumophila серогруппы 1 Диагностикум прошел комиссионные испытания, на него написана инструкция по изготовлению и контролю, утвержденная Ученым Советом РостНИПЧИ (Протокол № 4 от 14 06 2006 г)

Сконструирован и предложен для практического использования набор диагностикумов коагглютинирующих легионеллезных серогрупп 1-7, предназначенный для скрининга колоний и серологической идентификации L pneumophila серогрупп 1 - 7 при проведении бактериологических исследований на легионеллез Диагностикум прошел комиссионные испытания, на него написана инструкция по изготовлению и контролю, утвержденная Ученым Советом РостНИПЧИ (Протокол № 4 от 14 06 2006 г )

Разработаны и предложены для практического использования критерии диагностики легионеллеза на основании анализа эпидемиологических, клинических, рентгенологических данных и результатов дифференцированных лабораторных исследований различного материала от больных

Положения, выносимые на защиту:

  1. Растворимый легионеллезный антиген с известным составом иммуно-генных белков, полученный в результате изучения антигенной структуры L pneumophila семи серогрупп с использованием современных методов, может быть использован в качестве сенситина при конструировании антигенных вариантов диагностикумов

  2. Гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные на основе разработанных научно-методических подходов, позволяют конструировать специфичные и высокочувствительные диагностические иммуноглобулиновые препараты для серологической диагностики легионеллеза и идентификации возбудителя

  3. Специфичные и высокочувствительные тест-системы для выявления антител и антигенов в биологическом материале позволяют повысить диагностическую ценность серологических методов исследования на разных стадиях инфекционного процесса у больных легионеллезом, вызванном L pneumophila различных серогрупп

  4. Набор легионеллезных коагглютинирующих диагностикумов семи серогрупп позволяет проводить скрининг, идентификацию и серологическое тонирование культур L pneumophila различных серогрупп при проведении бактериологических исследований

  5. Разработанные критерии и алгоритм серологической диагностики легионеллеза позволяют давать объективную оценку результатов исследования материала от больных и лиц, входящих в группы риска и определить место серологических методов в диагностике легионеллеза

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на научных конференциях

Конференция Ростовского отделения Всероссийского общества микробиологов, Ростов-на-Дону, 1996 г

VII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997 г

Конференция Ростовского отделения Всероссийского общества микробиологов, Ростов-на-Дону, 1999 г

4-ая Межгосударственная научно-практическая конференция государств -участников СНГ Современные технологии в диагностике особо опасных болезней Саратов, 2003 г

Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа», Ставрополь, 2005 г

VI Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Санитарная охрана территории государств-участников Содружества Независимых Государств Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005 г

V-ая Межвузовская международная биохимическая научно-практическая конференция «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2006 г

Материалы диссертации получены при выполнении четырех плановых научных тем Per № 01 93 0 003251 «Легионеллез на Северном Кавказе», Per № 0195 0 003715 «Особенности эпидемиологии легионеллеза в условиях крупного города», Per № 01 99 0 002823 «Конструирование препаратов для серологической диагностики легионеллеза», Per № 01 200 2 12993 «Изучение Legionella pneumophila с целью поиска антигенов, имеющих диагностическое значение»

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, из них 7 - в изданиях, рецензируемых ВАК

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол № 4 от 19 04 2005 г)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 301 страницах и состоит из введения, материалов и методов, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, каждая из которых включает результаты собственных исследований, их обсуждение, за которым следуют заключение, выводы и список цитируемой литературы Диссертация иллюстрирована 36 таблицами, 22 рисунками Библиографический указатель содержит 395 источника, в том числе 58 работ отечественных и 337 -зарубежных авторов

Похожие диссертации на Совершенствование серологической диагностики легионеллеза