Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время благодаря широкому охвату населения профилактическими прививками как в России, так и в других странах мира, регистрируются спорадические случаи заболевания дифтерией (Маркина С.С., Максимова Н.М., ВОЗ, 2011). Для сохранения эпидемиологического благополучия требуется не только соблюдение правил и схем национальных календарей профилактических прививок, но и постоянный мониторинг за состоянием коллективного противодифтерийного иммунитета (Максимова Н.М., Маркина С.С., 2011).
Напряженность антитоксического иммунитета в Российской Федерации определяют с помощью реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) (Максимова Н.М., Маркина С.С., 2011). В мировой практике для определения поствакцинальных антитоксических антител в сыворотках крови людей используются иммуноферментные тест-системы и реакция нейтрализации в культуре клеток Vero (Miyamura K., 1974). При этом результаты определения содержания антитоксина в крови выражают в международных единицах МЕ/мл (Di Giovine P., Pinto A., 2009).
Вместе с тем антитоксический иммунитет защищает от заболевания дифтерией, но не препятствует свободной циркуляции возбудителя C. diphtheriae tox+ в иммунных коллективах, что обуславливает скрытое течение эпидемиологического процесса (Сухорукова Н.Л., Фаворова Л.А., 1979). Следовательно, антитоксический иммунитет не дает полного представления о противодифтерийной защите, поскольку при этом не учитываются противодифтерийные антибактериальные антитела, образующиеся естественным путем в ответ на бактериальные антигены при контакте с коринебактериями дифтерии. В этой связи очевидна необходимость изучения не только антитоксических, но и антибактериальных противодифтерийных антител с помощью современных иммунодиагностических методов (Шмелева Е.А., 1991).
Цель исследования
Выявить и определить количественное содержание противодифтерийных АТ IgG и АБ IgG, IgM, IgA антител в сыворотках крови различных групп людей с помощью иммуноферментных тест-систем.
Задачи исследования
-
Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения АТ IgG в сыворотках крови людей;
-
Создать иммуноферментную тест-систему для определения АБ IgG, IgM, IgA в абсолютных единицах в сыворотках крови людей;
-
С помощью разработанной тест-системы на основе ИФА определить содержание АТ IgG в сыворотках крови взрослых людей различных возрастных групп, проживающих в Российской Федерации и ряде стран Европы;
-
С помощью биометрического анализа охарактеризовать напряженность АТ противодифтерийного иммунитета в исследованных популяциях людей;
-
Используя разработанные тест-системы выявить содержание АБ антител изотипов G, M, A в сыворотках крови людей различных возрастных групп, проживающих в Российской Федерации и других странах Европы;
-
С помощью биометрического анализа показать напряженность АБ противодифтерийного иммунитета в популяциях взрослых людей из Российской Федерации и ряда стран Европы.
Научная новизна
Впервые разработаны отечественные тест-системы на основе ИФА для выявления противодифтерийных АТ IgG и IgG, IgM, IgA антител к бактериальным антигенам коринебактерий дифтерии в абсолютных единицах.
Показано, что во всех изученных сыворотках крови взрослых людей содержатся противодифтерийные АТ IgG антитела в концентрациях от 8,0 ± 1,5 до 384,5 ± 74,0 мкг/мл и наряду с ними противодифтерийные АБ антитела изотипов G, M, A в концентрациях от 19,0 ± 1,8 до 161,2 ± 19,5 мкг/мл, от 3,1 ± 0,9 до 90,6 ± 12,0 мкг/мл и от 3,4± 0,4 до 29,2 ± 3,6 мкг/мл соответственно.
Определено, что существует прямая корреляционная связь между показателями АТ антител, выявленных в одних и тех же сыворотках взрослых людей с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы (показатели содержания в мкг/мл) и коммерческой тест-системы на основе ИФА (показатели содержания в МЕ/мл).
Выявлено, что самое высокое содержание АТ антител отмечено в сыворотках людей, проживающих в России и Финляндии, где согласно национальным календарям профилактических прививок проводится вакцинация взрослого населения, а также в Латвии, где в 90-е годы отмечались вспышки заболевания дифтерией, сопровождающиеся высоким уровнем носительства (от 14,5 ± 3,0 до 89,0 ± 8,0, от 8,0 ± 1,5 до 384,5 ± 74,0 и от 32,5 ± 7,0 до 184,2 ± 32,5 мкг/мл соответственно). В сыворотках взрослых людей из Англии и Италии антитоксин содержался в самых низких концентрациях (от 14,0 ± 1,5 до 32,5 ± 6,0 и от 14,5 ± 3,0 до 51,5 ± 16,0 мкг/мл соответственно).
Определено, что с увеличением возраста содержание АТ IgG и АБ антител G, M изотипов уменьшается, а содержание АБ IgA увеличивается, что подтверждает изменение синтеза иммуноглобулинов этих изотипов в онтогенезе.
Впервые использование биометрического метода биномиального распределения уровней концентрации АТ и АБ антител в сыворотках крови взрослых людей из разных стран позволило оценить напряженность популяционного противодифтерийного иммунитета. Показано, что оптимальная напряженность противодифтерийного иммунитета характеризуется содержанием в сыворотках крови большего количества людей невысоких концентраций АТ и АБ антител и в сыворотках меньшего количества людей – высоких концентраций (1-й и 2-й модальные пики).
Практическая значимость
Разработанные иммуноферментные тест-системы позволяют выявлять в сыворотках крови людей поствакцинальные АТ и образующиеся естественным путем АБ антитела и определять напряженность популяционного противодифтерийного АТ иммунитета, мониторинг которого входит в систему эпиднадзора.
По результатам работы составлены и утверждены пособия («Определение антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови людей методом иммуноферментного анализа», «Определение антибактериальных противодифтерийных антител в сыворотках крови людей методом иммуноферментного анализа», 2012) для сотрудников научных учреждений по использованию ИФА для количественного выявления противодифтерийных антител.
В 2013 году будут проведены лабораторные испытания разработанных тест-систем на основе ИФА.
Внедрение результатов работы в практику
Разработанные иммуноферментные тест-системы используются в работе Научной группы по изучению противодифтерийного иммунитета в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского для оценки напряженности противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета у людей.
После проведения лабораторных испытаний планируется коммерческий выпуск тест-системы на основе ИФА для количественного выявления противодифтерийных АТ антител с целью дальнейшего использования в практике здравоохранения.
Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2009; 2010 гг.)
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработанная иммуноферментная тест-система позволяет выявлять концентрацию АТ IgG в абсолютных единицах, которые коррелируют с показателями содержания антитоксина в международных условных единицах МЕ/мл, выявленных с помощью коммерческой тест-системы на основе
ИФА.
-
Созданная тест-система на основе ИФА позволяет определять концентрацию образующихся естественным путем АБ антител изотипов G, M, A в сыворотках крови людей в абсолютных единицах.
-
Использование биометрического анализа дает возможность изучить напряженность противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета в популяциях людей.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 4 от 07 июня 2012 г.
Результаты диссертационной работы были представлены на IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», (2-4 июня 2008 г., Санкт-Петербург), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биологическая безопасность в современном мире» (21-22 апреля 2009 г., Оболенск), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (15-17 июня 2009 г., Нижний Новгород,), Second Annual Meeting of Dipnet and Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria (5-7 November 2008, Larnaca, Cyprus), Third Annual Meeting of Dipnet and Eleventh International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria (7-9 October 2009, Riga, Latvia), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (18-20 мая 2010 г., Санкт-Петербург,), X Всероссийской научно-практической конференции "Дни иммунологии в Сибири" (5-6 июля 2012 г., Иркутск).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, 6 – в материалах конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1 и 2), материалы и методы (глава 3), собственные исследования (главы 4, 5, 6, 7), заключение, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация снабжена 32 рисунками и 17 таблицами. В библиографическом указателе приведены 235 источников, из них 151 - на русском и 84 - на иностранном языках.
