Введение к работе
Актуальность проблемы
Согласно современным представлениям, анаэробное превращение практически любого сложного органического вещества в биогаз проходит несколько последовательных стадий: гидролиз, ферментация, ацетогенез и метаногенез. Весь этот сложный комплекс превращений осуществляет микробное сообщество, включающее, по некоторым оценкам, - до нескольких сотен видов (Gujer & Zehnder, 1983; Заварзин, 1986). Летучие жирные кислоты (ЛЖК) являются важными интермедиатами анаэробной деградации органических веществ. В пресноводных экосистемах (природных и антропогенных) деградация ЛЖК невозможна без участия синтрофных бактерий, так как изменение свободной энергии Гиббса при окислении ЛЖК является положительной величиной (Stams, 1994). Такие реакции термодинамически невозможны. Для осуществления реакции окисления ЛЖК необходимо снижение концентрации водорода, образующегося в процессе окисления ЛЖК до 1-10 Па (10" атм). Низкую остаточную концентрацию водорода в пресноводных экосистемах обеспечивают водородиспользующие метаногены (Mclnerney et al., 2008). Научный интерес к метаногенным сообществам, функционирующим при пониженных температурах, обусловлен большой экологической значимостью низкотемпературных микробных экосистем в биосфере Земли.
Традиционно в России сточные воды очищают в аэротенках и реже - в анаэробных биореакторах. Эти методы имеют достоинства и недостатки. При анаэробной обработке сточных вод образуется на порядок меньше биомассы, однако, анаэробная очистка в реакторах с восходящим потоком среды проводится в основном в мезофильных (30-35С) и термофильных (50-55С) условиях и поэтому связана с большими энергозатратами на поддержание определенной температуры в реакторах, что делает этот процесс дорогим. Для снижения энергозатрат перспективной является разработка эффективной технологии анаэробной предобработки концентрированных стоков при температуре окружающей среды без обогрева реактора или с подогревом до 20-25С. Эффективная очистка в таких условиях может быть достигнута при развитии сбалансированного психроактивного микробного сообщества. В анаэробных биореакторах с подачей очищаемой воды снизу (UASB, EGSB), благодаря гидродинамическим условиям, микроорганизмы образуют агрегаты (гранулы), в которых происходит межвидовой перенос водорода между синтрофными бактериями, окисляющими ЛЖК, и водородиспользующими метаногенами. В метаногенном сообществе между группами микроорганизмов существуют тесные и сложные
взаимосвязи, в том числе, и обратные. Ввиду субстратной специфичности метаногенов, их рост невозможен без трофической связи с бактериями предыдущих стадий. В свою очередь, метаногены, используя вещества, продуцируемые первичными анаэробами, определяют скорость реакций, осуществляемых этими бактериями. Выявление особенностей регуляции низкотемпературного метаногенного сообщества, выделение и изучение физиологии микроорганизмов, входящих в его состав, необходимо для прогнозирования поведения микробных сообществ в холодных природных экосистемах, особенно находящихся под сильным антропогенным воздействием.
Цели и задачи исследования
Целью работы было исследование психроактивных синтрофных метаногенных сообществ, окисляющих летучие жирные кислоты (пропионат и бутират), выделение и описание метаногенов из низкотемпературных антропогенных мест обитания.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
исследование метаболической устойчивости психроактивного микробного сообщества анаэробного биореактора к временному повышению или понижению температуры при периодическом культивировании;
-
получение пропионат- и бутират-окисляющих психроактивных микробных консорциумов, изучение их температурных характеристик и микробного состава;
-
выделение и описание психроактивного метаногена из упомянутых синтрофных консорциумов;
-
выделение и описание психроактивных метаногенов из придонных проб заглубленного навозохранилища свинофермы, с температурой in situ ниже 10С.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые исследованы адаптационные возможности биомассы
низкотемпературного анаэробного биореактора к временным изменениям температуры. Выявлено, что инкубирование психроактивной биомассы в течение 45-60 суток при температуре 30С улучшает ее активность при переносе на 10С.
Впервые из биомассы низкотемпературного анаэробного биореактора получены устойчивые синтрофные пропионат- и бутират-окисляющие психроактивные метаногенные консорциумы, растущие при пониженной температуре, и исследован их микробный состав.
Показана различная таксономическая принадлежность бактерий, составляющих низкотемпературный и мезофильный консорциумы. Обнаружено, что большинство бактерий низкотемпературных консорциумов принадлежат к новым таксонам.
Впервые из антропогенных местообитаний - анаэробного реактора и заглубленного навозохранилища, выделены новые психроактивные метаногены. Выделен и описан первый психроактивный гидрогенотрофный метаноген рода Methanospirillum - Methanospirillum stamsii Ptl из пропионат-окисляющего консорциума. Выделен и описан новый психроактивный вид рода Methanosarcina -«Methanosarcina porcellina Pr2 » и его референтный штамм «Methanosarcina porcellina Prl» из накопительной культуры, полученной из свиного навоза. Выделена и частично охарактеризована бактерия-спутник нового вида метаносарцины, представляющая собой новый вид рода Sphaerochaeta sp. штамм PS.
Данные, полученные при исследовании исходной биомассы из анаэробного биореактора, полученных пропионат- и бутират-окисляющих консорциумов, выделенных и описанных новых видов метаногенов расширяют знания о составе, структурных и метаболических взаимоотношениях в низкотемпературных анаэробных антропогенных микробных сообществах. Полученные результаты могут быть использованы для создания новых экономичных технологий очистки муниципальных и промышленных концентрированных стоков, получения биотоплива, выделения ферментов, активных при температуре окружающей среды (10-20С).
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях -«2-nd FEMS Congress of European Microbiologists» в Мадриде (Испания, 2006), на 12-м международном Симпозиуме по микробной экологии ISME-12 в Кернсе (Австралия, 2008), на IV Всероссийской молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008) и на IX Молодежной школе-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2013).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 экспериментальные статьи и 4 тезисов.
Место проведения работы
Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук. Молекулярно-биологические исследования проводили в центре коллективного пользования ИНМИ РАН, в Центре «Биоинженерия» РАН и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета микробиологии Университета г. Хельсинки (Финляндия).
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н. С.Н. Паршиной за научное руководство и помощь в работе, благодарит сотрудников ИНМИ РАН д.б.н., зав. лабораторией А.Н. Ножевникову, к.б.н. А.Ю. Каллистову, к.б.н. Е.Н. Деткову, к.б.н. А.К. Кизилову, Н.А. Кострикину, сотрудников кабинета газохроматографического анализа, сотрудников центра коллективного пользования, сотрудников Центра «Биоинженерия» РАН за практическую помощь и ценные советы.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и включают 35 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования, обсуждение, заключение, выводы и список литературы, состоящий из 220 наименований.
