Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1. Сообщества ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих Fe(II), S /S " и сульфидные минералы 11
2. Характеристика рода Sulfobacillus 18
2.1. История открытия. Таксономическое положение 18
2.2. Морфология, физиология и структурная организация клеток сульфобацилл 22
2.3. Метаболизм сульфобацилл и некоторых других ацидофильных микроорганизмов 29
2.3.1. Метаболизм углерода 29
2.3.1.1. Фиксация ,4СОг; карбоксилазы автотрофной и гетеротрофной фиксации 29
2.3.1.2. Углеводный метаболизм 36
2.3.1.3. Ферменты цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта 38
2.3.2. Влияние экзогенных факторов на активность ферментов углеродного метаболизма у бактерий рода Sulfobacillus 41
2.3.3. Метаболизм железа 44
2.3.3.1. Окисление и восстановление железа 44
2.3.3.2. ЭТС микроорганизмов при окислении Fe(II) 46
2.3.4. Метаболизм серы 52
2.3.5. Пул АТФ в клетках бактерий 56
3. Использование микробных ассоциаций термоацидофилов для выщелачивания/окисления сульфидных минералов 61
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Объекты и методы исследования 65
2.1. Объекты исследования 65
2.2. Методы исследования 71
Глава 3. Результаты 88
3.1. Метаболизм S. thermotolerans Krl 88
3.1.1. Рост и окисление субстратов бактерией S. thermotolerans Krl при различных типах питания 88
3.1.2. Ферменты углеводного обмена, ЦТК, фиксация 14СС«2 и карбоксилирующие ферменты S. thermotolerans Krl при различных типах питания 88
3.2. Внутриклеточный пул АТФ, тип питания и динамика роста сульфобацилл и других ацидофильных бактерий с различным типом метаболизма 94
3.2.1. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста S. thermotolerans Krl 94
3.2.2. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания.в динамике роста S. sibiricus ~Nl 96
3.2.3. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста S. thermosulfidooxidans 1269 101
3.2.4. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста миксотрофа Alicyclobacillus tolerans Kl 103
3.2.5. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с потреблением субстратов в динамике роста гетеротрофов Alb. acidocaldarius 27009 и Alb. cycloheptanicus 4006 106
3.2.6. Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с потреблением субстрата в динамике роста автотрофа At. ferrooxidans TFBk 109
3.3. Синтез АТФ суспензиями клеток S. sibiricus N1 и S. thermotolerans Krl при окислении различных субстратов. Ингибиторный анализ 110
3.4. Скорости дыхания клеточных суспензий и мембран клеток сульфобацилл 114
3.4.1. Скорость дыхания суспензий клеток S. sibiricus N1 и S. thermotolerans Krl 114
3.4.2. Скорость дыхания мембран клеток & sibiricus N1 115
3.5. Цитохромный и гемовый состав клеток S. sibiricus N1 и S. thermotolerans Krl 118
3.6. Рост S. sibiricus N1 и S. thermotolerans Krl при снижении содержания кислорода в газовой фазе и условиях гипоксии 124
3.7. Цитологические особенности S. thermotolerans Krl и 5". sibiricus N1 125
3.8. Использование термофильных сульфобацилл для биоокисления упорного пирротинового золотосодержащего пиритно-арсенопиритного флотоконцентрата при 50С 130
Глава 4. Обсуждение 137
Заключение 150
Выводы 151
Список литературы 153
- Сообщества ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих Fe(II), S /S " и сульфидные минералы
- Метаболизм сульфобацилл и некоторых других ацидофильных микроорганизмов
- Рост и окисление субстратов бактерией S. thermotolerans Krl при различных типах питания
- Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста S. thermosulfidooxidans 1269
Введение к работе
Постановка проблемы и её актуальность. Сульфобациллы — уникальная группа хемолитотрофных аэробных грамположительных спорообразующих экстремально ацидофильных бактерий семейства "Alicyclobacillaceae", окисляющих Fe2+, S/S2- и сульфидные минералы. Большинство представителей рода Sulfobacillus - умеренные термофилы; оптимальный тип питания — миксотрофный, когда одновременно используются различные метаболические пути окисления неорганических (указанных) и органических соединений (дрожжевой экстракт, глюкоза и др.) (Современная микробиология, 2005); рост бактерий при хемоорганогетеротрофном и хемолитоавтотрофном типах питания, как правило, ограничен несколькими пассажами (Каравайко, 2006; Захарчук, 2006). Местами обитания сульфобацилл являются отвалы сульфидных руд и угля, кислые гидротермы, шахтные воды, месторождения сульфидных минералов, где температура варьирует в пределах 10-60С.
Сульфобациллы являются постоянными членами сообществ микроорганизмов в области температур до 55С, играющих важную роль в биогидрометаллургических процессах и принимающих участие в циклах окисления-восстановления железа и окисления серы в природе. К настоящему времени подробно исследованы экофизиология и выщелачивающая активность этих бактерий (Каравайко и др., 2006). Значительные успехи также достигнуты в изучении центрального конструктивного метаболизма умеренно термофильных представителей рода Sulfobacillus в области оптимальных температур (Wood, Kelly, 1984; Захарчук и др., 1994; 2003; Цаплина и др., 2000), тогда как в области предельных для их роста температур, характерных для природных и техногенных экосистем, сведений нет. Данные об энергетическом обмене немногочисленны. В литературных источниках не представлено информации о процессах энергообеспечения клеток сульфобацилл в форме АТФ или других макроэргических соединений (МЭС) (кроме Захарчук, 2006; в этих исследованиях участвовала автор, Журавлева, в 2005-2006 гг.); остается неясной роль органических субстратов при миксотрофном типе питания этих бактерий. Электронтранспортная система сульфобацилл практически не изучена: предполагается наличие отдельных переносчиков электронов -цитохромоксидазы ааз-типа и цитохромов 6-типа — у бактерий, позднее отнесенных к видам рода Sulfobacillus - S. thermosulfidooxidans и S. acidophilus (Barr et al., 1990; Blake, Shute, 1994).
Исследование особенностей метаболизма штаммов сульфобацилл имеет большое значение как для решения теоретических задач, так и практического применения.
Поскольку конструктивный метаболизм и, в особенности, энергетический, непосредственно обуславливают способность железо- и сероокисляющих микроорганизмов к окислению сульфидных минералов, оптимизация данного процесса зависит от знания путей их углеродного метаболизма и понимания механизмов получения и консервации энергии. Изучение путей метаболизма сульфобацилл при изменении условий культивирования — при переключении с оптимального миксотрофного на литоавто- или органогетеротрофный типы питания, изменении содержания кислорода, температуры, в условиях нестабильного снабжения органическими веществами, является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение конструктивного обмена новой термотолерантной бактерии S. thermotolerans KrlT, выделенной при 30С, и особенностей энергетического метаболизма представителей рода Sulfobacillus при различных типах питания и температурах роста.
Задачи исследования включали:
Подробную характеристику фенотипических свойств термотолерантной культуры S. thermotolerans KrlT - роста и центральных путей углеродного метаболизма - при различных типах питания и предельных температурах.
Изучение энергетического обмена S. thermotolerans Krl и умеренного термофила 5". sibiricus N1 : установление взаимосвязи внутриклеточного АТФ с типом питания, определение субстратов-доноров электронов и акцепторов электронов, исследование электронтранспортной системы (ЭТС) при окислении Fe(II).
3. Исследование возможности использования термофильных сульфобацилл для
биоокисления упорных золотомышьяковых концентратов сульфидных руд
Олимпиадинского месторождения при 50С. Выделение преобладающих культур из
термофильной ассоциации.
Научная новизна и практическая значимость. В результате исследования активности ферментов катаболизма углерода обнаружено, что у термотолерантной бактерии S. thermotolerans Krl , в отличие от умеренно термофильных сульфобацилл, функционируют три главных пути метаболизма Сахаров - путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, окислительный пентозофосфатный и путь Энтнера-Дудорова при различных типах питания (миксо-, органогетеро- и литоавтотрофном). При всех условиях питания активны карбоксилазы автотрофной и гетеротрофной фиксации СОг. В области предельных температур роста (12 и 55 С) сохранение жизнеспособности и окислительной
активности клеток сульфобацилл обеспечено ферментными системами путей Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и Энтнера-Дудорова, что объясняет присутствие бактерий и их функционирование в местах обитания при низких и высоких температурах. Впервые исследована динамика пула АТФ и потребление субстратов в процессе миксо-, органо- и литотрофного роста сульфобацилл, установлена взаимосвязь этих процессов. Обнаружены различия в динамике пула АТФ, окисления субстратов и роста культур сульфобацилл при различных типах питания. Предложено использовать величину пула АТФ в качестве показателя эффективности роста и энергетического метаболизма сульфобацилл.
Выявлено сопряжение синтеза АТФ с функционированием электронтранспортной системы (ЭТС) при окислении неорганического и/или органических субстратов. Таким образом, органические вещества являются как источником углерода, так и донором электронов для ЭТС в условиях миксотрофии. Установлено использование бактериями S. sibiricus N11 и S. thermotolerans Krl альтернативного кислороду акцептора электронов -Fe(III) - в условиях гипоксии и пониженного содержания кислорода в газовой фазе.
Обнаружено, что ЭТС S. sibiricus N1 разветвлена и обеспечивает эффективное окисление железа при различном содержании О2. Система переноса электронов & sibiricus N1 при окислении Fe(II) в начале роста включает кислотоустойчивый растворимый цитохром с и цитохромоксидазу ааз-типа, в конце роста - цитохром с, мембрансвязанный высокопотенциальный цитохром А573 и цитохромоксидазу Ьо^-типа. Впервые выявлен состав гемов цитохромов у штаммов S. sibiricus N1 (гемы А, В, С и О) и S. thermotolerans Krl (А и В, не исключено наличие гема С).
Лабильность конструктивного и энергетического метаболизма умеренно термофильных сульфобацилл впервые позволила реализовать биовыщелачивание упорных золотомышьяковых концентратов при 50С в режиме двустадийного полунепрерывного процесса в лабораторных реакторах. Выделены новые, преобладавшие в реакторах, штаммы сульфобацилл, которые отнесены к виду Sulfobacillus sibiricus.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на П-ой
(международной) и IV-ой (с международным участием) молодежной школе-конференции
«Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, ИНМИ им. С.Н.
Виноградского РАН, 2006, 2008 гг.), 4-м московском Международном Конгрессе
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), 17-м
Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Германия, 2007 г.),
международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН, 2007 г.).
Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано 10 работ; 1 статья сдана в печать.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 190 страницах машинописного текста, включают 20 таблиц и 37 рисунков. Диссертация состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы», «Объекты и методы исследований», «Результаты» и «Обсуждение»), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 94 отечественных и 230 иностранных работ.
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории хсмолитотрофных
микроорганизмов (зав. лабораторией чл.-корр. РАН |Каравайко Г.И.[, д.б.н. Кондратьева Т. Ф.) Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, и на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации:
Цаплина И.А., Журавлева А.Е., Исмажов А.Д., Захарчук Л.М., Красилъншова Е.Н., Богданова Т.Н., Каравайко Г.И. Взаимосвязь внутриклеточного содержания АТФ с типом питания ацидофильных бактерий рода Sulfobacillus thermololerans и Alicyclobacillus tolerans II Микробиология. 2007. Т. 76. № 6. С. 742-751.
Zhuravleva А.Е., Tsaplina LA., Ismailov A.D., Zakharchuk L.M., and Karavaiko G.L. Metabolism peculiarities of bacteria of the genus Sulfobacillus // Advanced Materials Research. 2007. V. 20-21. P. 469^72.
Журавлева A.E., Исмаилов А.Д., Захарчук Л.М., Красилъншова Е.Н., Цаплина И.А. Особенности процессов энергообеспечения у умеренно термофильных бактерий рода Sulfobacillus II Микробиология. 2008. Т. 77. № 5. С. 708-712.
Цаплина И.А., Красилъншова Е.Н., Журавлева А.Е., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Сузина Н.Е., Дуда В.К, Богданова Т.И., Стадничук КН., Кондратьева Т.Ф. Сравнительные аспекты фенотипических свойств Sulfobacillus thermotolerans II Микробиология // 2008. Т. 77. № 6. С. 742-751.
Dinarieva T.Y., ZhuravlevaА.Е., Pavlenko О.А., Tsaplina LA., NetrusovA.L Ferrous iron oxidation in a moderate thermoacidophile Sulfobacillus sibiricus N1 II FEBS Letters (в печати).
Тезисы конференций:
Журавлева А.Е., Каравайко Г.И. "Особенности метаболизма бактерий семейства Alicyclobacillaceae". II молодежная международная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва. Россия. 1-3 ноября 2006. С. 57-58.
Журавлева А.Е., Цаплина И.А., Исмаилов А.Д., Богданова Т.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Красильникова Е.Н., Каравайко Г.И. "Особенности метаболизма бактерий семейства Alicyclobacillaceae". Четвертый московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва. Россия. 12-16 марта 2007 г. С. 350.
Цаплина И.А., Богданова Т.И., Савари Е.Е., Сергеева Т.В., Кондратьева Т.Ф., Журавлева А.Е., Седельникова Г.В., Каравайко Г.И. "Исследование сообщества умеренно термофильных сульфобацилл в процессе окисления пиритно-арсенопиритного концентрата". Четвертый московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва. Россия. 12-16 марта 2007 г. С. 325.
Zhuravleva А.Е., Tsaplina I.A., Ismailov A.D., Zakharchuk L.M., and Karavaiko G.I. Metabolism peculiarities of bacteria of the genus Sulfobacillus. International Biohydrometallurgy Symposium "Biohydrometallurgy: From the Single Cell to the Environment". 2007. V. 20-21. P. 469-472.
Цаплина И.А., Журавлева A.E., Богданова Т.И., Кондратьева Т.Ф. "Биотехнологический потенциал хемолитотрофных умеренно термофильных бактерий Sulfobacillus sibiricus". Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Москва. Россия. 19-20 ноября 2007. С. 140-141.
Журавлева А.Е., Цаплина И.А. "К вопросу об энергетическом метаболизме сульфобацилл". IV молодежная школа-конференция с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва. Россия. 20—22 октября 2008. С. 16-18.
Список сокращений. АТФ (АДФ/АМФ) - аденозинтри(ди/моно)фосфорная кислота
(аденозинтри(ди/моно)фосфат), ЭТС - электронтранспортная система, МЭС -
макроэргические соединения, НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный,
НАД(Ф) - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, РБФК/О -
рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа, ФЕП - фосфоенолпируват, ФРК -фосфорибулокиназа, ЦТК — цикл трикарбоновых кислот, УХ - убихинон, АФС -
аденозинфосфосульфат, ЗИФ - золотоизвлекательная фабрика, ДМСО -
диметилсульфоксид; ДЦКД - дициклогексилкарбодиимид; РНК-аза - рибонуклеаза; ДНК-аза - дезоксирибонуклеаза; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; УЗДН — ультразвуковой дезинтегратор; ФЭК - фотоэлектроколориметр; ДС-Na — додецилсульфат натрия; ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография; КоА — коэнзим А; ВПЭФ — высоковольтный пульс-электрофорез; МПА - мясо-пептонный агар; ЛПА - легкоплавкая агароза. УМБ - ультрамикробактерия.
Сообщества ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих Fe(II), S /S " и сульфидные минералы
Местами обитания сообществ ацидофильных микроорганизмов на Земле могут быть естественные (природные) и искусственные (антропогенные). Их общим свойством являются низкие значения рН - 3.0. Аборигенные сообщества ацидофилов присутствуют и функционируют в геологически активных местообитаниях, которыми являются геотермальные источники, например, Йеллоустонского национального парка (Yahya et al., 1999) и острова Монтсеррат (Atkinson et al., 2000), сульфатары, месторождения сульфидных минералов (Головачева, Каравайко, 1978; Вартанян и др., 1988; Цаплина и др., 2008), кислые почвы (в условиях разогрева) (Каравайко и др., 1982; 2006; Kelly, 1992; Johnson, 1998; Diaby et al., 2007), шахтные воды (Bond et al., 2000 а, б), реки с высоким содержанием тяжелых металлов (река Тинто, "Иберийский пиритный пояс" Испании). (Gonzalezoril et al., 2003), стены пещер из карбонатных пород с микробными сообществами в виде биопленок (Италия, Macalady et al., 2007). Наиболее распространенными местами обитания ацидофильных микроорганизмов являются: антропогенные, образование которых связано с добычей угля (Johnson, 1998) и металлов (благородных металлов - золота и серебра; цветных - меди, цинка, свинца, никеля и др.) (Каравайко и др., 2006). В этих местообитаниях создаются условия, ограничивающие видовое разнообразие микроорганизмов - низкие значения рН, высокие концентрации ионов металлов, в том числе тяжелых, колебания температуры, низкое содержание органического вещества и ограниченная доступность кислорода. Несмотря на небольшое число видов, характерных для экониш, окислительная активность обитающих в них организмов весьма значительна, что определяет их роль в глобальных циклах серы, железа и других элементов в природе и практическое использование (Иванов, 1964; Карвайко и др., 1982; 2006; Каравайко, 1989; Johnson, 1998; Cavicchioli, Thomas, 2000; Baker, Banfield, 2003; Rawlings, Johnson, 2007). Микроорганизмы, катализирующие оксидоредукцию железа играют ключевую роль в геохимических циклах, поскольку железо является наиболее распространенным элементом в литосфере (Заварзин, 1972; 2004; Ehrlich, 2002; Yahya et al., 2008). Способность некоторых ацидофильных прокариотов ускорять окисление сульфидных минералов используется в обширной области биотехнологии, называемой биогидрометаллургией (Karavaiko, 1988; Каравайко и др., 2006; Rawlings, Johnson, 2007). С другой стороны, аналогичные процессы, протекающие в отработанных породах, ведут к загрязнению окружающей среды - закисленню и повышению концентрации ионов тяжелых металлов в почве и грунтовых водах (Pronk, Johnson, 1992; Komnitsas et al., 2001; Каравайко, 2004; Каравайко и др., 2006; Kock, Schippers, 2008).
Преимущественное развитие тех или иных ассоциаций микроорганизмов зависит от факторов — температуры, кислотности, снабжения органическими веществами и аэрации. Одним из важнейших параметров является температура. Железо- и сероокисляющие/восстанавливающие ацидофилы представлены бактериями и археями, относящимися к мезофилам ( 5-40С), умеренным термофилам ( 40-60С), облигатным термофилам (60-80 С) и гипертермофилам ( 80С) (Бонч-Осмоловская, 1989; Johnson, Hallberg, 2007). В мезофильных условиях преобладают грамотрицательные ацидитиобациллы (Каравайко и др., 1972; Каравайко, 1989; 2004; Заварзин, 1972; 2004; Kelly et al., 2000; Kelly, Wood, 2000; Агеева, 2003), некоторые тиобациллы, лептоспириллы и ферроплазмы (Golishina et al., 2000; Robertson, Kuenen, 2006). В условиях умеренной термофилии обнаружены преимущественно грамположительные бактерии и археи (Головачева, Каравайко, 1978; Головачева, 1989; Johnson, Hallberg, 2007). При температурах, превышающих 60С, преобладающими микроорганизмами становятся археи (Euarchaeota и Crenarchaeotd) (Johnson, 1998; Johnson, Hallberg, 2007). Исключением является мезофильный/умеренно термофильный род - Ferroplasma - с оптимумом температуры 35 45С (Golishina et al., 2000; Пивоварова и др., 2005).
За последние годы проделана большая работа по изучению биоразнообразия мезофильных и умеренно термофильных ацидофильных микроорганизмов. Показано, что чистые и смешанные культуры грамположительных бактерий — представители рода Sulfobacillus, в сообществе с лептоспириллами и ферроплазмами при повышенных температурах играют важную роль в процессах биовыщелачивании/биоокислении сульфидных минералов в биогидрометаллургии, в месторождениях цветных и благородных металлов и отвалах сульфидных руд (Karavaiko, 1997; Johnson et al., 2001; 2003a; Kondrat eva et al., 2004; Каравайко и др., 2006). В составе сообщества при биовыщелачивании/биоокислении полиметаллических (медь, железо, цинк) сульфидных руд при температуре 45С преобладают следующие микроорганизмы: Acidithiobacillus caldus {At.), Leptospirillum (L.) ferrooxidans, виды Sulfobacillus (Okibe et al., 2003). Сообщество ацидофильных микроорганизмов кислых стоков дренажной системы рудников (Швеция) (рН 3.0) включает представителей рода Sulfobacillus: S. acidophilus NAL, "S. montserratensis" LI5, S. thermosulfidooxidans ВСІ, Sulfobacillus sp. G2, и штамм TM6, отнесенный к группе Firmicutes, помимо групп сульфатвосстанавливающих микроорганизмов - Pseudoxanthomonas, Dechlorosoma, Desulfovibrio, Agrobacterium,
Methylocapsa, Rhodococciis (Morales et al, 2005). Из горячих источников Вест Индии выделено сообщество, в составе которого идентифицированы штаммы, близкие к штаммам вида S. acidophilus и S. thermosulfidooxidans, а также представитель, вероятно, нового вида сульфобацилл (Johnson et al., 2005). В процессе биовыщелачивания сульфидных руд медьсодержащих концентратов при температуре 78С исследованы 2 сообщества (развивающиеся при различной концентрации халькопирита (CuFeS2)). Оба сообщества представлены археями, относящимися к порядку Sulfolobales (виды Sulfolobus (Sib.) shibatae, Stygiolobus (St.) azoricus, Metallosphaera (M.) sp. Jl, Acidianns (Ac.) infernos и новый филотип Sulfur isphaer a ohwakuensis) (Mikkelsen et al., 2006). При биовыщелачивании металлов из сульфидных золотосодержащих руд при температуре 50 С сообщество микроорганизмов было представлено бактериями видов At. caldus, L. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans, S. acidophilus и бактериями рода Sphingomonas, археями видов Ferroplasma (Fr.) sp., Sulfolobus sp. и Ac. brierleyi (Liu et al., 2006; Chen et al., 2007). В сайтах биовыщелачивания сульфидных концентратов медных и свинцово-цинковых руд при температуре 20.1 С в сообществах преобладали организмы родов Leptospirillum, Acidithiobacillus и Sulfobacillus (Не et al., 2008). Из "хвостов выщелачивания" сульфидных минералов свинцово-цинковых руд выделены преобладающие культуры сообществ: бактерии At. ferrooxidans, L. ferriphilum, S. thermotolerans, Acidiphilium (Acd.) cryptum, Acd. acidiphilum и архей Fr. acidiphilum и представители рода Thermoplasma (Hirashi et al., 1997; 1998; Tan et al., 2008). В "хвостах биовыщелачивания" (сульфидные руды, содержащие Ni, Си, Zn и Со) микробные сообщества были представлены преимущественно бактериями. В составе ассоциаций при температуре 20.1 С преобладали: At. ferrooxidans, At. caldus, At. thiooxidans, L. ferrooxidans, L. ferriphilum, Sidfobacillus spp. и Acidiphilium spp. (Kock, Schippers, 2008). Из кислых вод медного месторождения Индии выделены 3 сообщества, в двух из которых при повышенных температурах преобладали бактерии Sulfobacillus spp. (Marhual et al., 2008).
Метаболизм сульфобацилл и некоторых других ацидофильных микроорганизмов
Фиксация 14СС 2. Как следует из описанного выше, метаболические способности хемотрофных ацидофилов очень разнообразны. Одно из важных мест в физиологии бактерий занимает ассимиляция диоксида углерода (Bassham, Calvin, 1957; Evans et al., 1966; McFadden, Shively, 1991; Ivanovsky et al., 1993; Strauss, Fuchs, 1993; Herter et al., 2001). Автотрофные ацидофилы, важные для биовыщелачивания, получают часть углерода путем фиксации СОг, что требует восстановительных эквивалентов (обычно НАДН). При этом требуются затраты АТФ и работа НАД-оксидоредуктазы, что было показано на примере At. ferrooxidans (Elbehti et al., 2000; Carlos et al., 2008; Castelle et al., 2008).
Ассимиляция бактерией At. ferrooxidans CO2, как и другими изученными ацидитиобациллами, происходит в результате функционирования цикла Кальвина-Бенсона-Бассама (Quayle et al., 1954; Bassham, Calvin, 1957; Романова, 1989; Уголькова, Ивановский, 2000). В отличие от этого, автотрофная ассимиляция диоксида углерода у представителей Sulfolobus и Acidianus, видимо, происходит по пути, похожему на восстановительный цикл трикарбоновых кислот, 3-гидроксипропионатному и 3-гидроксибутиратному пути (Hugler et al., 2003; Современная микробиология, 2005).
В том случае, когда факультативно автотрофные ацидофильные серобактерии растут на органических соединениях, фиксация СОг через цикл Кальвина может заметно снижаться или даже совсем прекращаться (Tabita, 1988). Ацидитиобациллы фиксируют углекислоту через цикл Кальвина и окисляют неорганический субстрат, но одновременно используют органические соединения как источники углерода и энергии. Однако у разных видов серобактерий изменения метаболизма, в зависимости от состава среды, типа и концентрации органических соединений, могут варьировать.
У хемолитотрофных бактерий различают два типа РБФК (Tabita, 1988; Watson, Tabita, 1997; Shively et al., 1998). Доминирующая форма I ("green"), обнаруженная у большинства хемоавтотрофов, идентична ферменту растений, водорослей и цианобактерий. Она состоит из большой (L) (50-55 кДа) и малой (S) (12-18 кДа) субъединиц и имеет общую формулу L8S8. Форма II фермента представлена только большими субъединицами (L2, L4 или L8). У Т. denitrificans, Т. intermedins, Т. neapolitanus есть оба типа фермента (Wood et al., 1978; Tabita, 1988; Shively et al., 1998).
Вторым уникальным ферментом цикла Кальвина является ФРК, состоящая из субъединиц 32—36 кДа. Ее активность регулируется внеклеточными метаболитами. За исключением фермента Т. neapolitanus, активность фосфорибулокиназы зависит от активации НАДН (Shively et al., 1998).
Все известные штаммы сульфобацилл осуществляют фиксацию углекислоты в автотрофных условиях с участием цикла Кальвина. Скорость фиксации 14СОг клетками S. thermosulfidooxidans 1269 максимальна при инкубации в автотрофных условиях в присутствии закисного железа и тиосульфата и снижается в отсутствии одного из добавляемых субстратов: Fe + или S2O32" (табл. 4). Внесение в инкубационную среду дрожжевого экстракта (0.02%) вызывает уменьшение ассимиляции клетками меченого диоксида углерода. Фиксация клетками 14СС 2 в миксотрофных условиях инкубации (в присутствии 0.02% дрожжевого экстракта) в зависимости от условий предшествующего роста культур (табл. 4) составляла около 20% от уровня ее фиксации в автотрофных условиях инкубации (Fe + тиосульфат) (Захарчук, 2006). В то же время скорость окисления клетками S. thermosulfidooxidans 1269 закисного железа остается на одном уровне и почти не зависит от наличия в инкубационной среде дрожжевого экстракта, а также условий предшествующего роста культур (Захарчук и др., 1994). Фиксация СОг клетками, выросшими в миксотрофных условиях, стимулировалась добавлением в среду инкубирования железа и глюкозы (в концентрации 0.15-0.30 мМ) и подавлялась при концентрации глюкозы 1-2 мМ (табл. 4). Включение клетками 14СОг в присутствии Fe2+ и 0.3 мМ глюкозы составляло около 40% от уровня фиксации в автотрофных условиях (в присутствии железа и тиосульфата). Данные о влиянии органических веществ на уровень фиксации ,4С02были аналогичны полученным для S. acidophilus ALV (Wood, Kelly, 1983; 1984) и S. thermosulfidooxidans 41 (Вартанян и др., 1990а; Цаплина и др., 2000).
На основании этих и некоторых других данных (Красильникова и др. 1998) предполагается, что в миксотрофных условиях клетки сульфобацилл включают углерод из обоих субстратов - из СО2 и органических веществ.
Рост и окисление субстратов бактерией S. thermotolerans Krl при различных типах питания
На рис. 5а приведены типичные кривые лито-, органо- и миксотрофного роста культуры при оптимальной температуре 40С. Урожай клеток и скорость роста в условиях миксотрофного типа питания были выше, чем в других вариантах эксперимента. Так, в условиях миксотрофии (кривая 3) клеточный урожай был в 1.5 и в 5 раз выше, чем при хемоорганогетеротрофном (кривая 2) и хемолитоавтотрофном (кривая 7) метаболизме соответственно. При этом величина удельной скорости роста при миксотрофном типе питания - 0.26-0.30 ч", была также в 1.5-1.8 раза выше, чем при культивировании в отсутствие минерального субстрата (0.16-0.17 ч"1) и в 2.2-2.5 раза выше, чем при выращивании культуры на среде с одним минеральным источником энергии и донором электронов (0.11-0.12 ч"1).
Анализ потребления окисляемых сульфобациллой субстратов (рис. 56) также демонстрирует наиболее высокие скорости утилизации глюкозы и окисления закисного железа (кривые 2 и 3 соответственно) в условиях миксотрофного метаболизма. Таким образом, наибольший прирост биомассы был связан с более полной утилизацией глюкозы в условиях миксотрофного типа питания в сравнении с уровнем потребления глюкозы в гетеротрофных условиях (кривая 7). Закиснос железо штамм окислял полностью независимо от условий выращивания (кривые 3 и 4), отличалась лишь скорость его окисления ( в 2 раза).
Фиксация СОг клетками S. thermotolerans Krl и активность карбоксилирующих ферментов. В варианте с внесением закисного железа в среду инкубации уровень ассимиляции СОг клетками штамма Krl был максимальным — 558.9 нмоль СОг/мг белка (рис. 6, кривая 7). Наименьшей степенью фиксации обладала суспензия в присутствии органических субстратов - глюкозы и дрожжевого экстракта -130 нмоль СОг/ мг белка (рис. 6, кривая 5).
В экстрактах клеток S. thermotolerans Krl была обнаружена активность РБФ-карбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О)-ключевого фермента цикла Кальвина (табл.10), максимальная активность которой - 7.2 нмоль СОг/(мин мг белка), была выявлена у бактерий при литоавтотрофном типе питания на среде с закисным железом. Активность РБФК/О в клетках штамма Krl снижалась в миксотрофных условиях роста при наличии в среде минерального и органических источников питания - Fe(II), глюкозы и дрожжевого экстракта, и составляла 4.9 нмоль СОг /(мин мг белка). При органотрофном росте культуры S. thermotolerans Krl в присутствии глюкозы и дрожжевого экстракта активность РБФК была равна 1.1 нмоль СОг /(мин мг белка).
В бесклеточных экстрактах у штамма Krl были выявлены активности некоторых карбоксилаз гетеротрофной фиксации СОг (табл. 10). Наиболее активна была ФЕП-карбоксилаза. Максимальный уровень данного фермента, 1.1 нмоль СОг/(мин м г белка), был зафиксирован в органотрофно выросших клетках, тогда как в условиях литоавто- и миксотрофного метаболизма он был несколько ниже - 0.9 и 0.7 нмоль СОг/(мин мг белка) соответственно. Также были обнаружены активности двух других карбоксилаз анаплеротической фиксации двуокиси углерода - ФЕП-карбокситрансфосфорилазы и пируваткарбоксилазы. Активность ФЕП-карбокситрансфосфорилазы была наибольшей в клетках, выросших в миксотрофных условиях. Уровень активности пируваткарбоксилазы был ниже, чем ФЕП-карбокситрансфосфорилазы и практически не зависел от условий культивирования сульфобациллы.
Активности ферментов катаболизма углеводов позволяют предполагать функционирование в клетках S. thermololerans Krl трех основных путей -фруктозобисфосфатного (Эмбдена-Мейергофа-Парнаса), Энтнера-Дудорова (2-кето-З-дезокси-6-фосфоглюконатного) и окислительного пентозофосфатного пути (табл. 11).
При росте штамма в оптимальных миксотрофных условиях в присутствии дрожжевого экстракта и глюкозы активность всех исследуемых ферментов, кроме альдолазы, ключевого фермента пути Энтнера-Дудорова, была выше, чем в клетках, выросших литотрофно или органотрофно. Суммарная активность 6-фосфоглюконатдегидратазы и 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы была выше при органогетеротрофном типе питания по сравнению с миксотрофным. При этом один из ключевых ферментов пентозофосфатного пути — 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, имела значительно меньшую активность. Эти данные свидетельствуют о возрастающей роли пути Энтнера-Дудорова при хемоорганогетеротрофном метаболизме глюкозы в клетках штамма Krl. При температурах роста, близких к предельным, время генерации, в сравнении с миксотрофными условиями роста, увеличивается в 2 раза при 55 С и в 10 раз при 12—14 С, снижается активность ферментов (особенно при высокой температуре — в 2.5-15 раз), утрачивается пентозофосфатный путь окисления глюкозы. Тем не менее, клетки сохраняют свои окислительные свойства и жизнеспособность при пересевах, благодаря функциониорванию фруктозобисфосфатного пути метаболизма Сахаров. S. thennotolerans Krl, как и другие известные виды рода сульфобацилл (Захарчук и др., 1994; 2003; Цаплина и др., 2000; Егорова и др., 2004), содержат все ферменты ЦТК, кроме 2-оксоглутаратдегидрогеназы (табл. 12). Наибольшая активность ферментов обнаружена в клетках, выросших в условиях миксотрофного типа питания на среде с Fe(II), глюкозой и дрожжевым экстрактом. Литотрофный и органотрофный рост штамма сопровождался значительным снижением активности ключевого фермента ЦТК — цитратсинтазы, по сравнению с ее активностью в клетках, растущих миксотрофно. Помимо этого у бактерий, выросших органотрофно, не удалось детектировать активность фумаратгидратазы. Активности ферментов глиоксилатного шунта - изоцитратлиаза и малатсинтаза, не были обнаружены в клетках штамма Krl.
Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста S. thermosulfidooxidans 1269
Рост, потребление субстратов. В условиях миксотрофного роста штамма 1269 выход биомассы по белку, по сравнению с другими условиями культивирования, был максимальным — 22.5 мкг/мл. Двухвалентное железо окислялось полностью, процент утилизированной глюкозы был равным 35% от внесенного количества (рис. 13, кривые 1, 2, 3). Клетки росли со скоростью 0.29 ч" и имели типичную для вегетативных форм культуры морфологию. Наличия спор отмечено не было.
Изменение внутриклеточного пула АТФ. Отмечали конкуренцию в потреблении субстратов и двухфазность роста. В течение лаг-фазы потребление железа ингибировала глюкоза, и оно практически не окислялось, при этом пул АТФ снижался до 0.5 нмоль/мг белка. Глюкоза начинала утилизироваться сразу и увеличение скорости ее потребления коррелировало с повышением пула АТФ в начале, а затем в первой фазе линейного роста культуры. Максимальная скорость роста обеспечивалась не только ускорением катаболизма глюкозы, но и высокой скоростью окисления закисного железа, равной 190-250 мг/ч. Перед началом второй фазы роста (экспоненциальной) величина пула АТФ, достигнув максимума 4.4 нмоль/мг белка (рис. 13, кривая 4, табл. 13), падала до 0.4 в стационарной фазе роста, несмотря на продолжающуюся утилизацию глюкозы (с низкой скоростью).
Взаимосвязь процессов роста S. sibiricus N1, потребления субстратов и пула АТФ при литоавтотрофном типе питания на среде с закисным железом. 1 - рост, белок, мкг/мл, 2 - окисление железа Fe2+, г/л, 3 - концентрация АТФ, нмоль/мг белка.
Рост, потребление субстратов. При органотрофном росте штамма 1269 максимальное значение биомассы было равным 12.6 мкг белка/мл (табл. 13). Утилизация глюкозы культурой начиналась через 6 ч культивирования. Максимальная удельная скорость роста составляла 0.10 ч . Потребление глюкозы составило 20-22% от вносимого количества. Популяция клеток была представлена типичными вегетативными клетками, отмечали единичные проспоры.
Изменение внутриклеточного пула АТФ. В течение роста штамма 1269 регистрировали осцилляторные изменения пула АТФ. Максимальное содержание АТФ в клетках культуры S. thermosulfidooxidans 1269 составляло 0.5 нмоль/мг белка (табл. 13).
Рост, потребление субстратов. В условиях литотрофного роста 5". thermosulfidooxidans 1269 максимальное значение биомассы было равным 6.3 мкг белка/мл. Окисление Fe(ll) наблюдали в течение всего эксперимента (рис. 14, кривая 2).
До 18 ч культивирования скорость окисления железа составляла 30 мг/ч, после 18 ч- 125-325 мг/ч. Длительность лаг-фазы составляла 5-6 ч. Максимальная удельная скорость роста была низкой и составляла 0.07 ч \ Клетки были представлены как типичными вегетативными формами, так и небольшим процентом проспор и спор (5-7%).
Изменение внутриклеточного пула АТФ. В первые 8 ч культивирования регистрировали снижение уровня АТФ (отток энергии), после чего пул АТФ начинал увеличиваться, а к 20 ч достигал своего максимального значения, после чего резко снижался, обеспечивая энергией ростовые процессы, цикл Кальвина и др. В автотрофных условиях содержание АТФ в клетках штамма 1269 не превышало 0.1 нмоль/мг белка (рис. 14, кривая 3, табл. 13). По окончении роста величина пула АТФ составляла 0.03 нмоль/мг белка.
Взаимосвязь внутриклеточного пула АТФ с типом питания в динамике роста миксотрофа Alicyclobacillus tolerans Kl
Рост, потребление субстратов. В миксотрофных условиях у штамма К1 также выявлялась зависимость роста от конкуренции в потреблении субстратов, в связи с чем наблюдали 2 фазы роста в течение 25 ч — линейную и экспоненциальную (рис. 15, кривая Г). Максимальная величина удельной скорости роста - 0.17 ч"1 (табл. 13). Алициклобацилла окисляла лишь 40% закисного железа, внесенного в среду, с низкой скоростью 30 мг/ч (рис. 15, кривая 2), его потребление ингибировала глюкоза, которая потреблялась с высокой скоростью 0.1 мМ/ч на протяжении 10 ч. В отличие от сульфобацилл штамм К1 в течение первых 37 ч утилизировал глюкозу полностью (рис. 15, кривые 2, 3). Штамм потреблял внесенную в среду глюкозу за 34 ч с максимальной скоростью 17.6 мг/ч. Быстрое потребление глюкозы практически в течение 10 ч обеспечило увеличение пула АТФ и начало второй фазы роста - экспоненциальной.
Изменение внутриклеточного пула АТФ. Таким образом, изменение содержания АТФ в клетках культуры Alb. tolerans Kl коррелировало со скоростью потребления субстратов, в основном глюкозы, и фазой роста (рис. 15, кривая 4). Пул внутриклеточного АТФ Alb. tolerans Kl через 10 ч после посева был минимальным (вероятно, тратился в течение линейного роста); перед ускорением роста культуры он возрастал до 0.65 нмоль/мг белка (табл. 13). В течение экспоненциального роста и при переходе к стационарной фазе содержание АТФ снижалось. Небольшой подъем уровня АТФ был зарегистрирован в поздней стационарной фазе роста штамма К1. Видимо, это было связано с потреблением компонентов дрожжевого экстракта или внутриклеточных пулов органических веществ. В течение всего культивирования морфология клеток основной части популяции не менялась, наблюдали единичные проспоры.
Рост, потребление субстратов. Скорость органотрофного роста Alb. tolerans Kl была равной 0.13 ч", максимальная величина биомассы - 14.0 мкг белка/мл (рис. 16, кривая /). Алициклобацилла потребляла глюкозу с максимальной скоростью 0.078 мМ/ч и практически полностью утилизировала этот органический субстрат за 25 ч культивирования (рис. 16, кривая 2). Отмечали спорулирование 5-10% популяции клеток штамма К1.
![Влияние типов питания на иммунный статус коренных народов Ямала [Электронный ресурс]](/i/i/4464/205192.png "Влияние типов питания на иммунный статус коренных народов Ямала [Электронный ресурс] Береснева Любовь Алексеевна")
