Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Препараты-пробиотики на основе бактерий рода Bacillus и их лечебно-профилактическое действие 8
1.2 Технологические основы культивирования бацилл 18
Глава 2. Материалы и методы исследований 34
Собственные исследования 44
Глава 3. Выделение нового штамма Bacillus subtilis 1 IB и характеристика его биологических свойств 44
Глава 4. Оптимизация процесса периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11В 67
4.1 Оптимизация состава питательной среды 71
4.2 Выбор фазы и дозы посевного материала 79
4.3 Влияние условий аэрации и перемешивания 84
4.4 Изучение криорезистентности культуры штамма 90
Глава 5. Создание препарата-пробиотика «Витаспорин» и изучение его эффективности 93
5.1 Влияние рН среды, желудочного сока и желчи на специфическую активность бацилл, входящих в состав препарата «Витаспорин» 94
5.2 Изучение иммуномодулирующего действия препарата «Витаспорин» 101
5.3 Изучение лечебной эффективности препарата «Витаспорин» 108
Заключение 114
Выводы 128
Практические рекомендации 129
Библиографический список литературы 130
- Препараты-пробиотики на основе бактерий рода Bacillus и их лечебно-профилактическое действие
- Оптимизация состава питательной среды
- Влияние рН среды, желудочного сока и желчи на специфическую активность бацилл, входящих в состав препарата «Витаспорин»
- Изучение лечебной эффективности препарата «Витаспорин»
Введение к работе
Актуальность темы. В условиях обострившейся экологической обстановки, широкого применения высокоактивньж химиотерапевтических препаратов наблюдается тенденция к увеличению патологий, связанньж с изменением нормальной микрофлоры человека. Наряду с этим расширяется спектр потенциальных возбудителей микотических поражений. Клинические проявления инфекций, обусловленных грибами, широко варьирует от поверхностных поражений слизистьж оболочек и кожи до угрожающей жизни инвазивньж микозов, при которьж могут поражаться любые органы (O.K. Хмельницкий и др., 2000)
Применение антимикотиков и антибиотиков во многом решало проблему инфекционных осложнений, вызванных условно-патогенными, патогенными бактериями и грибами Однако в последние годы эффективность антибиотиков и антимикотиков существенно снизилась за счет возникновения широкой резистентности патогенньж микроорганизмов и грибов ко многим группам антибиотиков. Кроме того, возросла прослойка людей среди населения, страдающими аллергическими реакциями на применение антибиотиков, вплоть до их полной непереносимости.
В этой связи большой интерес представляют препараты-пробиотики из спорообразующих бактерий рода Bacillus, обладающих широким спектром антагонистической активности в отношении патогенньж и условно-патогенньж, патогенньж бактерий и грибов и способньж оказать комплексное лечебно-оздоровительное действие на весь организм.
Применение препаратов-пробиотиков из бацилл обусловлено их преимуществами перед антибиотиками: широкий диапазон лечебно-профилактического действия, безвредность для организма, экологическая безопасность, относительная дешевизна (И.М.Нахабин, В.В.Перелыгин, 1996).
В настоящее время в отечественной практике выпускается и успешно применяется для профилактики и лечения дисбактериозов, кишечных инфекций, гнойно-воспалительных заболеваний единственный препарат-пробиотик на основе Bacillus subtilis 534 - «Споробактерин жидкий» (М В. Никигенко и др., 2004).
Вышеизложенное определило актуальность в расширении списка отечественных биопрепаратов на основе штаммов Bacillus subtilis, способньж оказать антагонистическое воздействие на возбудителей заболеваний бактериальной и
грибной патологии. - ?5^ЦШОИЫ1"« і
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования является выделение природного штамма Bacillus subfflis и разработка на его основе нового медицинского препарата-пробиотика.
Задачи исследования:
Выделить из природного материала наиболее активный штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов.
Изучить биологические свойства нового штамма Bacillus subfflis и возможность его использования как основа нового биопрепарата.
Разработать научные основы технологического процесса культивирования нового штамма Bacillus subfflis, позволяющий получить биомассу популяции с максимальным количеством жизнеспособных клеток в споровой форме.
Создать новый препарат-пробиотик на основе выделенного штамма Bacillus subfflis, изучить его специфическую активность и стабильность свойств при хранении.
5. Изучить эффективность препарата «Витаспорин» при лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.
Научная новизна.
Выделен и идентифицирован штамм Bacillus subfflis 11В, обладающий широким спектром антагонистической активности как в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания человека. Штамм депонирован под номером ВКМ 2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина и защищен патентом РФ №2182172 от 10.05.2002 «Штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности».
Разработаны научные основы периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subfflis 11В с целью получения максимального выхода биомассы жизнеспособных бактерий и спорообразования в зависимости от: состава питательной среды, оптимальной дозы посевного материала, физико-химических параметров
РАН. Создан новый препарат - пробиотик «Витаспорин», сухой, показана его эффективность в комплексном лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальньж животных и запатентован: патент РФ № 2181596 от 27.04.2002 «Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus».
Научно-практическая значимость.
Получен новый производственный штамм бактерий Bacillus subtilis 11В и показана возможность его использования в качестве основы нового препарата.
Разработаны научные основы промышленного технологического процесса культивирования штамма Bacillus subtilis 11В. патент РФ № 2182172 от 10.05.2002 «Штамм бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонистической активности».
Создан новый медицинский препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой. Получено 15 экспериментально-производственных серий препарата - пробио-тика «Витаспорин»
Составлена нормативно-техническая документация на препарат «Витаспорин», сухой (ФСП, ЭПР, Инструкция по применению) и передана на экспертизу в ГИСКим. ЛА.Тарасевича.
Показана эффективность препарата при лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.
Составлена и утверждена программа клинических испытаний для оценки лечебного действия препарата - пробиотика «Витаспорин», сухой в Государственном институте сертификации качества им. ЛА.Тарасевича; в комитете по медицинской этике при Национальном органе контроля медицинских иммунобиологических препаратов МЗ РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Выделен из природной среды штамм Bacillus subtilis 11В, обладающий широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов.
Разработан оптимизированный процесс периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis 11В на сбалансированной питательной среде, позволяющий получить максимальный выход биомассы жизнеспособных клеток в споровой форме.
Создан новый препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой, показана его эффективность в комплексном лечении зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов: Всероссийской научно конференции молодых ученых филиала ФГУП «НПО» Мик-
роген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» - «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).
Апробация диссертации проведена на совместном межкафедральном совещании Башкирского государственного медицинского университета. ФГУП «НПО Микроген МЗ РФ филиал «Иммунопрепарат»» и Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (протокол № ] от 5 ноября 2004 г.)
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных научных работ и получено 2 патента Российской Федерации на изобретение.
Объем и структура диссертационной работы.
Препараты-пробиотики на основе бактерий рода Bacillus и их лечебно-профилактическое действие
По совокупности факторов биологической активности наиболее перспективными для создания пробиотиков из неэндогенной микрофлоры можно рассматривать бациллы, главным образом относящиеся к виду Bacillus subtilis и имеющие статус CRAS (generally regarded as safe)- вполне безопасных организмов. Они широко применяются в медицинской практике, в животноводстве и растениеводстве (Б.А.Шендеров и др., 1997, Бойко Н.В. и др., 1990; Никитенко Л.И. и др., 1992; Кандыбин Н.В. и др., 1995; Козачко И.А. и др., 1995; Хмель И.А. и др., 1995; Ивановский А.А., 1996, 1997; Марков И.И. и др., 1998; Payne J. М, 1992; Kubo К., 1994; Tsuge К. et al, 1995; Rychen G., Simoes N. C, 1995; Donovan W.P. et al., 1995).
Применение препаратов-пробиотиков из бацилл обусловлено их преимуществами перед химиотерапевтическими препаратами: широкий диапазон лечебно-профилактического действия, безвредность для организма, экологическая безопасность, относительная дешевизна (И.М.Нахабин, В.В.Перелыгин, 1996; Leviveld H.L.M. etal., 1995; Humbert Florence, 1988).
В литературе широко представлены сведения по использованию препаратов из бактерий рода Bacillus в медицине (В.В. Смирнов и др, 2002; И.Г. Осипова и др., 2002). Югославские исследователи приводят данные по достоверному ускорению процессов заживления ран и царапин у пациентов, получавших перорально пищевые продукты или биопрепараты на основе живых бактерий рода Bacillus (Blaznik,1976). В.И Никитенко и др., (1996) получил убедительный статистически достоверный терапевтический эффект в наблюдениях на более чем 250 хирургических больных с гнойными ранами при пероральном использовании препарата из бактерий рода Bacillus. На основе штамма В. subtilis 534, выделенного из негнойной раны больного, был создан препарат Споробактерин (Никитенко В.И., 1989; Михайлова Н.А. и др., 1993). По данным В.И. Никитенко (1996) при лечении препаратом Споробактерин 134 больных с дисбактериозом 1-4 степени в течение 10-90 дней выраженные улучшения в составе микробиоценоза кишечника достигнуты у 90,3% больных. Для лечения гнойных ран, остеомиелита, сепсиса, пиелонефрита, пневмонии у 276 человек также использовали споробактерин. Полное излечение без применения антибиотиков отмечено у 197 (71,4 %) больных, улучшение состояния у 57 человек (20,7%) и только у 22 больных, из-за отсутствия положительного эффекта, применены другие способы лечения.
Препарат Бактиспорин, действующим началом которого является штамм В subtilis ЗН - эффективное средство для лечения дисбактериозов у детей и взрослых, а также для профилактики в предоперационной подготовке гнойно-септических осложнений (О.В. Галимов и др., 1999; Л.Н. Мазанкова « v и др., 1997; А.А. Фазылова и др., 1998, 1999, 2000, Т.В. Хасанова и др., 2001). Показан лечебно-оздоровительный эффект использования бактиспорина у рожениц групп риска (Гатауллина Р.Х. и др., 2001).
Отмечается подавляющее действие бактерий В. subtilis на внутриклеточные патогены. Предложен штамм В. subtilis МЖ-6, который в 96,2 % случаев in vitro подавлял рост микобактерий туберкулеза (И.И. Марков и др., 1998).В опытах in vitro показана активность штамма В. subtilis 3 против бактерий Helicobacter pylori и выделены антибиотиотические факторы, способные оказать такое влияние (I.V. Pinchuk et al., 2001). Широкое распространение получили препараты из живых микробных культур штамма Bacillus cereus IP 5832: бактисубтил ("Marion Merrell", Франция) и его аналог флонивин БС ("Galenica", Словения), предназначенные для лечения острых желудочно-кишечных заболеваний. Известен также биопрепарат цереобиоген («Xing Лап», Китай), действующим началом которого является штамм Bacillus cereus DM 423. Основой пробиотика- энтерогермина (фирма «Sanofi Winthrop», Милан) является культура Bacillus clausii (И.Б. Сорокулова., 1997; И.Г. Осипова и др. 2002).
Помимо биопрепаратов из бацилл на основе одного антагонистически активного штамма, предложен целый ряд комплексных препаратов, включающие два и более штамма из рода Bacillus, биологические свойства которых дополняют друг друга в лечебной эффективности.
В Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного Украины разработан и внедрен в практику новый пробиотик-биоспорин. В составе препарата-два штамма аэробных спорообразующих бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, которые отличаются физиологическими свойствами, способностью адаптироваться в различных отделах желудочно-кишечного тракта и дополняющие друг друга по спектру антагонистической активности. Биоспорин предназначен для лечения острых кишечных инфекций, гнойных ран, аллергических состояний, восстановления иммунного статуса больных и терапии бактериального вагиноза (В.В.Смирнов и др., 1988, 1992; Н.М.Грачева и др., 1996; О.Л.Молчанов, А.Л.Позняк, 1999). Создан препарат на основе биомассы 3 штаммов бацилл, дополняющих друг друга по спектру антагонистической активности - Bacillus subtilis ВКПМ В-7092, В. subtilis ВКПМ В-7048, Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038, предназначенный для лечения бактериальных и вирусных инфекций (С.Н. Щелкунов и др., 1999).
Разработаны комплексные препараты на основе бацилл и штаммов бактерий из нормофлоры кишечника человека. Предложен препарат субтикол, содержащий штаммы В. subtilis 3, В. licheniformis 31 и Escherechia coli М-17 (Смирнов В.В. и др., 1999). Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus Sphaericus используются в качестве лечебно-профилактических препаратов для лечения дисбактериозов, воспалительных процессов и аллергических заболеваний (Л.И.Никитенко, В.И.Никитенко, 1992; В.И.Никитенко, И.ЬСНикитенко, 1992; Т.С.Попова и др., 2001).
Штаммы бактерий рода Bacillus так же используются для получения молочных диетических продуктов, содержащих живые бактериальные клетки и предназначенных для нормализации желудочно-кишечного тракта (G. Testolin М. Gasiraghi, 2000).
Новым направлением в создании препаратов-пробиотиков из бацилл комплексного действия, является создание рекомбинантных штаммов трансформированных плазмидой, содержащей ген белка-медиатора иммунной системы. Такие препараты обладают высокой эффективностью, обусловленной лечебным действием (В.А.Белявская и др., 1994). Поиск препаратов с антивирусной активностью привел к созданию на основе штамма B.subtilis 2335, входящего в состав биоспорина, нового рекомбинантного штамма, способного продуцировать человеческий интерферон типа а-2 (В.А. Белявская и др., 1996). Рекомбинантный штамм продуцирует интерферон как гибридный белок с сигнальным а-амилазным пептидом, который обусловливает секрецию интерферона через клеточную стенку.
Одним из эффективных сочетаний является совмещение в одном препарате бактерий родов Bacillus и Lactobacillus. Обусловлено это тем, что эти микроорганизмы взаимотолерантны и в тоже время существенно различаются по механизму воздействия на разные звенья патологического процесса. Так, лечебно-профилактический эффект, оказываемый молочнокислыми бактериями, в значительной мере связан с их выраженной адгезивной активностью, которая обеспечивает формирование полноценной защитной биопленки слизистых кишечника, а также с высокой активностью кислотообразования, что создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности многих патогенных микроорганизмов (И.Б.Сорокулова, 1996). Новый комплексный пробиотик -на основе родов Bacillus и Lactobacillus получил название споролакт (С.Р.Резник и др., 1995).
Таким образом, литературные данные свидетельствуют, что спорообразующие бактерии рода Bacillus являются перспективной группой микроорганизмов как для создания новых высокоэффективных биопрепаратов с заданными свойствами, так и комплексных пробиотиков, включающих различных представителей нормальной микрофлоры.
Изучение механизма лечебного действия культур В. subtil is показало его многофакторность: продуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов, подавляющих рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; образование высокоактивных ферментов (протеаз, рибонуклеаз, трансаминаз и других); продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины (В.В.Смирнов и др., 1982; Т. Yoshimoto, 1990). Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения Bacillus subtilis элиминируется из крови (В.В.Смирнов и др. 1982,1985,1988,1992; А.Т.Слабоспицкая и др., 1990; В.И. Никитенко и др., 1996).
Изучение механизма лечебно-профилактического действия препаратов-пробиотиков на организм человека и животных показало, что бациллы способны проникать из желудочно-кишечного тракта в кровь, а оттуда в очаг поражения, сохранять жизнеспособность, продуцировать антибиотики, протеолитические ферменты и иммуномодуляторы.
Оптимизация состава питательной среды
Важным этапом процесса культивирования является подбор оптимального состава питательной среды, обеспечивающий максимальный выход целевого продукта с содержанием споровой популяции В. subtilis 1 IB до 100%.
Питательная среда должна также обеспечивать спорообразование популяции штамма Bacillus subtilis 1 IB в процессе культивирования, то есть не менее 50% популяции производственной биомассы должны находиться в виде споры, так как популяция в споровой форме сохраняет жизнеспособность бактериальных клеток при лиофильном высушивании и хранении. Данные автора (Филин В.А., 1998) подтверждают сохранение высокой специфической активности препаратов, содержащих споровую форму бактериальных клеток, которая особенно выражена в момент перехода споровых форм в вегетативные клетки.
Опубликовано множество работ, посвященных ферментации бацилл в лабораторных и промышленных условиях, в которых предлагаются различные составы питательных сред. Наиболее часто для выращивания используются полноценные питательные среды, где в качестве белково-углеводной основы используется ценное пищевое сырье: мясо, казеин, пекарские дрожжи, картофель, соя и ряд других. Применение таких сред обеспечивало высокую концентрацию бактериальных клеток в процессе культивирования. Однако использование пищевого сырья в составе питательных сред имеет целый ряд серьезных недостатков: нестандартность, высокий уровень накопления побочных продуктов в процессе культивирования, широкая возможность дифференциации производственного штамма, низкий процент спорообразования популяции, и как результат - нестандартность получаемой биомассы.
Для производственного культивирования предпочтительными являются полусинтетические и синтетические питательные среды, поскольку они способны обеспечить стандартность получаемой биомассы. Нами проведен анализ частоты использования минеральных компонентов в составе 40 питательных сред, предложенных для выращивания бактерий рода Bacillus (рис. 5).
Как видно из рисунка 5, наиболее часто используемые минеральные соли: сульфат магния 23 %, хлористый кальций 11%, сульфат железа 11%, сернокислый аммоний 8 %, фосфат калия 8 %.
Из всех испытанных сред, обеспечивающих переход популяции штамма Bacillus subtilis в споры, наибольшее количество биомассы было получено на среде Егорова Н.С. (1979). Поскольку спорообразование зависит от наличия в среде минеральных солей (В.В.Смирнов, 1982, М.Н. Глухов др., 1974), была изучена потребность штамма Bacillus subtilis 1 IB в источниках минерального питания. В наших исследованиях синтетическая питательная среда Егорова была использована для культивирования Bacillus subtilis 11В в качестве контрольной среды. В опытных вариантах были испытаны среды с исключением одного из компонентов минерального состава среды Егорова (таблица 14).
Как следует из данных таблицы 14, исключение одного из компонентов питательной среды приводило к статистически значимому изменению накоплению биомассы, содержания количества жизнеспособных клеток и спор в популяции.
Показано, что наибольшее количество биомассы (25,5±0,3)х109 кл/мл, с высокой численностью жизнеспособных клеток (7,5±0,2)х10 кл/мл, накапливалось на питательной среде без аммония сернокислого.
Различия по сравнению с контролем статистически значимы (Р 0,01). Одновременно было выявлено снижение содержание спор в среде без сульфат аммония по сравнению с контролем в 2 раза и составляло соответственно 31,4±2,6 % и 70,0±1,9 (Р 0,01).
На питательной среде с исключением цитрата натрия и сульфата меди, по сравнению с контрольной средой, наблюдалось повышение количества биомассы и составляло соответственно 18,4±0,4х109кл/мл, 15,7±0,3х109кл/мл и 12,1±0,5х109кл/мл, но количество жизнеспособных клеток было снижено и составляло соответственно (2,7±0,2)х10 кл/мл, (2,3±0,3)х10 кл/мл и (4,2±0,2)х108 (различия статистически значимы по сравнению с контролем Р 0,01).
Наиболее важным микроэлементом в составе питательной среды оказался марганец сернокислый, как показали наши исследования, исключение его приводило к отсутствию спорообразования, снижению количества жизнеспособных клеток и изменению их морфологии: клетки мелкие, искривленные, слипшиеся. При этом количество биомассы в опытной и контрольной среде была одинаковой и составляло соответственно 13,0 ±0,5 10 кл/мл; 12,1 ±0,5x109 (различия статистически не значимы, Р 0,05).
Отсутствие в питательной среде ионов кальция, железа и магния так же не оказывало существенного влияния на накопление биомассы, но значительно снизилось содержание спор в популяции и составляло соответственно 1,5±0,2 %, 3,4±0,5 %, 2,7±0,8 %, по сравнению с контролем 70,0±1,9 (различия статистически значимы РО,01).
Исключение из состава питательной среды фосфата калия, при интенсивном спорообразовании (95,0±5,8 %), не приводило к нарастанию количество биомассы бактериальной популяции (9,0±0,5х109 кл/мл). При этом содержание жизнеспособных клеток было минимальным по сравнению с контролем и составляло соответственно (1,5±0,1)х10 и (4,2±0,2)х10 кл/мл, различия статистически значимы Р 0,01.
Отсутствие ионов цинка приводило к снижению роста биомассы, количества жизнеспособных клеток и содержанию спор по сравнению с контролем и составляло соответственно 9,3±0,3 х109 кл/мл, 3,5±0,2 х106 кл/мл, 2,7±0,5 %; 12,1±0,5 хЮ9 кл/мл, 4,2±0,2 хЮ8 кл/мл, 70±1,9 % Различия статистически значимы при Р 0,01.
Изменение морфологии клеток происходило при исключении из питательной среды каждого из компонентов: ионов меди, цинка, кальция, железа и магния, бактериальные клетки становились утонченными и искривленными, уменьшались в размерах, образовывали мелкие споры по сравнению с клетками, выращенными на контрольной среде. Исключение из среды ионов калия, аммония, или цитрата натрия не изменяло морфологии клеток, которые представляли собой грамположительные палочки средней длины и толщины, ровные.
Так же важно отметить, что показатели антагонистической активности получаемой популяции в результате исключения одного из минеральных компонентов состава среды, по сравнению с контролем, оставались в пределах 13-19 мм зоны задержки роста.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о существенном влиянии отдельных минеральных компонентов на рост, развитие, морфологию и спорообразование популяции штамма Bacillus subtilis 11В, что позволяет управлять качеством получаемой биомассы, изменяя состав питательной среды.
По данным литературы, для улучшения ростовых качеств синтетической питательной среды вносят один из органических или полусинтетических источников азота. Наиболее часто используются в средах, предложенных для культивирования бактерий рода Bacillus: картофельно-глицериновый гидролизат 20%, пептон 1%, триптон 1%, мясной пептон 20%, казеиновый гидролизат 20% (Смирнов В.В. и др., 1982).
В своих исследованиях подбор источника азота проводили путем добавления в основную синтетическую питательную среду Егорова. Культивирование проводили в ферментере в условиях принудительной аэрации и перемешивания.
Результаты оценивали по выходу биомассы бактерий и физиологическому состоянию клеток. Качественные характеристики биомассы штамма В. subtilis 11В, полученной на средах с различными источниками азота, представлены в таблице 15.
Влияние рН среды, желудочного сока и желчи на специфическую активность бацилл, входящих в состав препарата «Витаспорин»
Нами изучено влияние перечисленных факторов на специфическую активность бацилл, входящих в состав препарата Витаспорин.
Исследовали. интенсивность роста бацилл и уровень их антагонистической активности при инкубировании на мясо-пептонном бульоне (МПБ) с различными значениями рН ( 1,5 - 7,4).
Жизнеспособность бактериальных клеток и активность, препарата изучали при воздействии на препарат желудочного сока в концентрациях 1%, 5 %, 10 %, 30 %, 100 %; желчи 1 %, 5 %, 10%, 20%, 30 %, 100 %.
Во всех вариантах опытов 18 ч культуру бацилл вносили в среду из расчета 107 клеток на 1 мл и инкубировали при 37 С в течение 72 ч.
Количество жизнеспособных бактериальных клеток изучали путем высева в соответствующих разведений культуральной жидкости на мясо-пептонный агар и подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ) В 1 мл среды.
.Известно, что реакция желудочного сока натощак нейтральная или слабощелочная и снижается после приема пищи до рН 1,5 (Н.И. Коган, 1984). Поскольку пробиотики из бацилл, введенные перорально, подвергаются в организме воздействию низких рН, представляло интерес изучить интенсивность их размножения в зависимости от.рН среды-(таблица 25).
Установлено, что в средах с низкими значениями рН (от 1,5 до-5,0) бациллы не размножаются и даже частично теряют жизнеспособность по истечению 24 часов культивирования. Однако, при рН 5,0 бациллы сохраняют способность к размножению и к 48-72 часов роста происходит нарастание биомассы бацилл.
В связи с тем, что важным показателем специфической активности пробиотиков является уровень их антагонистической активности, проведено изучение влияния рН среды на антагонистическую активность бацилл (таблица 25).
Полученные результаты свидетельствуют, что биомасса, выращенная на средах с рН - от 1,5 до 4,0, имеет более низкий уровень антагонистической активности в сравнении с биомассой, выращенной на средах с рН от 5,0 и выше.
Учитывая то обстоятельство, что количество продуцируемого желудочного сока и желчи зависит от характера и количества принимаемой пищи (А.Д. Ноздрачев, 1991) представлялось целесообразным исследовать влияние различных концентратов этих секретов на специфическую активность препарата «Витаспорин».
Данные по влиянию различных концентраций желудочного сока на жизнеспособность бактериальных клеток и уровень их антагонистической активности представлены в таблице 26, 27.
Из полученных результатов можно заключить, что 1 % концентрация желудочного сока способна стимулировать размножение бацилл в первые 24 часов роста, в последующие часы скорость размножения бацилл снижается по сравнению с контролем.
Концентрации желудочного сока с 5 % до 30 % приводят к снижению скорости роста бацилл, однако не ингибируют способность бацилл к размножению и только 100 % желудочный сок практически полностью лизирует бациллы.
Как видно из таблицы 27, уровень антагонистической активности бацилл в отношении условно-патогенных бактерий не зависит от концентрации желудочного сока.
Как следует из представленных данных таблицы 28, желчь способна стимулировать размножение бацилл в концентрациях от 1 % до 30 % впервые 24 часов роста, в последующие 48 часов она не оказывает значительного влияния на размножение бацилл.. Данные таблицы 29 свидетельствуют, что присутствие желчи в концентрации от 1 % до 100% в среде не подавляет антагонистическую активность бацилл, составляющих основу препарата «Витаспорин»
Таким образом, анализируя полученные результаты о влиянии различных рН, концентраций желчи и желудочного сока в питательной среде на жизнеспособность бактериальных клеток и биологическую активность препарата Витаспорин, представляется целесообразным назначать препарат «Витаспорин» между приемами пищи, когда отмечается наименьшая активность секреторных желез и рН среды не опускается ниже 5,0.
На основе технологии периодического гомогенного глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis ИВ и лиофильного высушивания были получены 15 экспериментально-производственных серий препарата-пробиотика «Витаспорин», сухой.
Специфическая активность препарата и все его физико-химические свойства стабильно сохранились в процессе хранения при температуре (6±2) С в течение 2-х лет и прошли контроль в ГИСК им. Л.А.Тарасевича (таблица 30).
Изучение лечебной эффективности препарата «Витаспорин»
Ранее проведенными исследованиями показано наличие антифунгальной активности в опытах in vitro и иммуномодулирующей активности в опытах in vivo у препарата-пробиотика «Витаспорин».
Изучение эффективности препарата-пробиотика «Витаспорин», сухой при лечении экспериментальной трихофитии в опытах на животных проводили в лаборатории микологии БГМУ под руководством профессора Ю.А.Медведева.
Экспериментальную трихофитию проводили на 60 мышах линии BALB/C, генетически высокочувствительных к данной дерматофитии.
Для моделирования инфекции мышам линии BALB/C на предварительно выбритую поверхность кожи спины площадью 4x2 см. наносили суспензию микроконидий гриба (1-3x10x9 микроконидий в 0,05% растворе Твин - 80 на физиологическом растворе) при объеме 0,05 мл/мышь). Эффективность заражения контролировались на 5 день после заражения по результатам высева шерсти и кожных чешуек на плотную среду Сабуро с последующей идентификацией культур по культуральным и морфологическим свойствам (П.Н. Кашкин, Н.Д. Шеклаков, 1978; П.Н. Пестеров, 1998 ).
У всех мышей уже на 3 день после заражения на инфицированных участках кожи появились резкий отек, выраженная гиперемия, мелкоочаговое шелушение, по периферии покрытые пузырями. Отмеченные воспалительные явления наблюдались по интенсивности во всех группах животных.
У всех мышей на 5 день после заражения очаги поражения переходили в гнойные корочки. Из очагов поражения кожи в результате высева на среду Сабуро были выделены ретрокультуры Trichophyton mentagrophytes variant granulosum.
Учет результатов инфицирования проводили в течение 28 дней. Клиническую картину заболевания животных оценивали в баллах по формуле: диаметр поражениях гиперемия х отек х суппурация (последние три признака по интенсивности от 1 до 3).
Лечение начинали на 3 день после заражения на протяжении 21 дня. Для этого животных были рандомизированы на 4 группы:
1 гр. - контроль (введение по 0,2 мл 0,9% физиологического раствора, ежедневно).
2 гр. - опыт (введение гризеофульвина по 0,2 мл 1 раз в день через сутки с подсолнечным маслом из расчета 40 мг на 4 мл
3 гр. - опыт (введение гризеофульвина по 0,2 мл 1 раз в день через сутки_ с подсолнечным маслом из расчета 40 мг на 4 мл с препаратом «Витаспорин» в суточной дозе 1х 10 8 кл/мл в 0,5 мл 0,9% физиологического раствора ежедневно.
4 гр. - опыт (введение препарата «Витаспорин» в суточной дозе 1х 10 кл/мл в 0,5 мл 0,9% физиологического раствора ежедневно.
На 7 день после заражения (4 день лечения) степень выраженности воспалительных явлений во всех группах также не отличалась, хотя уровень балльных показателей выраженности воспаления имел тенденцию к возрастанию - при введении препарата «Витаспорин», и к снижению - при лечении гризеофульвином.
Данные таблицы 33 отражают характер действия препарата «Витаспорин» как средства сопроводительной терапии трихофитии и его влияние на выраженность ведущих составляющих компонентов проявления воспалительного процесса — гиперемии и отека.
Как следует из результатов исследования, назначение препарата «Витаспорин» в большей степени оказывает нивелирующее влияние на проявления отечного компонента воспалительной реакции (в отношении трихофитии - степень кожной инфильтрации). Так, даже индивидуальное введение препарата, не обеспечивающее самостоятельного лечебного эффекта, начиная уже с 14 дня после заражения (11 день применения препарата «Витаспорин») приводит к достоверному снижению выраженности отечных явлений в очагах трихофитии. При использовании препарата «Витаспорин» как средства сопроводительной терапии при лечении трихофитии гризеофульвином, также к 14 дню заболевания отмечается достоверно более выраженное, чем при лечении только гризеофульвином, снижение отечных явлений в очагах.
В дальнейшем у мышей контрольной группы и в опытной группе, при назначении препарата «Витаспорин» воспалительные изменения в очагах трихофитии поддерживались в течение всего срока наблюдения, хотя при использовании исследуемого препарата, воспаление на 21 день наблюдения было достоверно менее выражено, чем без его применения. Начиная с 14 дня заболевания у животных в группе с комплексным лечением (11 день лечения значительно уменьшилась инфильтрация и гнойное отделяемое в очаге. На 21 день лечения гризеофульвином и препаратом «Витаспорин» отмечено значительное улучшение - инфильтрация разрешилась до уровня здоровой кожи и обеспечивало полное излечение. В группе животных, принимавших гризеофульвин в очагах наблюдались остаточные явления воспалительного процесса с полным излечением на 30 день заболевания.
Как следует из таблицы 34, индивидуальное введение препарата «Витаспорин», начиная уже с 14 дня после заражения (11 день лечения) (2,34+0,62) приводит к снижению выраженности воспалительного процесса в очагах трихофитии к концу срока наблюдения (1,48+0,52), по сравнению с контрольной группой животных (3,67+0,82). Различия статистически значимы, Р 0,05. При использовании препарата «Витаспорин» при лечении трихофитии в комплексе с гризеофульвином к 21 дню заболевания отмечается полное исчезновение очага заражения. Различия статистически значимы по сравнению с группой, принимавших гризеофульвин (1,20+0,32), Р 0,05.
Проведенное нами экспериментальное исследование по изучению эффективности препарата «Витаспорин», сухой при лечении зоонозной трихофитии на животных показало, что антимикотический эффект при комплексном применении антибиотика гризеофульвина с пробиотиком «Витаспорин» был усиленно проявлен по сравнению с традиционной терапией гризеофульвином, что приводило к быстрому выздоровлению и сокращению сроков лечения.
Таким образом, в результате наших исследований создан препарат-пробиотик «Витаспорин», сухой на основе нового штамма Bacillus subtilis 1 IB с использованием разработанной технологии культивирования и лиофильного высушивания со стабилизатором в концентрации сахарозы -7,5 %, желатина -1,5 % с сохранением жизнеспособности бактериальных клеток не менее 1x10 в 1 мл при хранении в течение 2-х лет.
Показана эффективность препарата «Витаспорин» в отношении широкого спектра условно-патогенных, патогенных бактерий, грибов in vitro и антимикотическая активность препарата потверждена in vitro в комплексном применении с антибиотиком - гризеофульвин при зоонозной трихофитии в опытах на экспериментальных животных.
Похожие диссертации на Разработка нового препарата-пробиотика "Витаспорин" и изучение его биологических свойств
