Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Современное состояние проблемы пробиотиков 9
2.1.1. Общая характеристика пробиотиков 9
2.1.2. Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков 13
2.1.3. Критерии оценки свойств бактериальных культур, используемых для производства лечебно-профилактических препаратов 17
2.1.4. Композиционный состав пробиотиков 19
2.2. Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus 25
2.3. Краткая характеристика технологии получения пробиотиков 29
3. Материалы и методы исследований 34
3.1 Микроорганизмы 34
3.2 Методы исследований 35
4. Результаты собственных исследований
4.1. Биологическая характеристика штаммов, входящих в состав экспериментального образца нового пробиотика 44
4.1.1. Изучение биологических свойств культур штаммов микроорганизмов из музейной коллекции. Оценка возможности их использования для производства нового пробиотика 44
4.1.2. Изучение биологических свойств культуры штаммаLactobacillus plantarum 8Р-АЗ
4.1.3. Изучение биологических свойств культуры штамма Bacillus subtilis 3 64
4.1.4. Оценка влияния бактерий видов В. subtilis 3 и L. Plantarum 8Р-АЗ на неспецифическую резистентность организма 65
4.2. Сохранение культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и В. subtilis 3 в жизнеспособном и активном состоянии 70
4.3. Конструирование экспериментального образца нового препарата .
4.4. Испытания экспериментального образца бактерийного препарата субтилакт на основе культур штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и В. subtilis 3
4.4.1. Определение специфической активности экспериментального образца препарата 90
4.4.2. Изучение безопасности экспериментального образца бактерийного препарата на основе культур штаммов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ ...108
4.4.3. Влияние субтилакта на микробиоценоз кишечника птиц и телят
5.Обсуждение результатов исследования 115
6. Выводы 121
7. Практические рекомендации 123
8. Список использованных источников 124
Приложения 136
- Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков
- Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus
- Изучение биологических свойств культур штаммов микроорганизмов из музейной коллекции. Оценка возможности их использования для производства нового пробиотика
- Изучение безопасности экспериментального образца бактерийного препарата на основе культур штаммов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ
Введение к работе
В последние годы в Российской Федерации наблюдается нарастание неблагоприятных социальных, экологических и других факторов, что существенно влияет на ухудшение эпидемической ситуации. Одним из закономерных следствий такого положения является увеличение числа инфекционных заболеваний, в том числе кишечных инфекций и дисбактериозов /1,2,3,4/.
Острые кишечные инфекции в настоящее время остаются одной из актуальных и важных проблем инфекционной патологии. По данным Центра Госсанэпиднадзора Министерства здравоохранения РФ за период с 1998 года по декабрь 1999 года заболеваемость, в частности, сальмонеллезами увеличилась на 3 %, острыми кишечными инфекциями, вызванными неустановленными возбудителями -на 39,37%, шигеллезом - на 89,36% 151. В 2000г. и 2001г. отмечена тенденция к снижению заболеваемости кишечными инфекциями, в 2002г. их увеличение. В целом по стране за 2002г. было зарегистрировано 16 вспышек острых кишечных инфекций. Особое внимание на себя обращают так называемые инфекции с неустановленной этиологией, на долю которых приходится более 50% заболевших /6/.
По данным Центрального научно-исследовательского института Эпидемиологии Минздрава Российской Федерации, увеличивается также и количество инфекционных заболеваний, отличающихся затяжным и хроническим течением, которые вызываются условно-патогенными возбудителями /6/.
Необходимо обратить внимание на то, что, по данным Российской Академии медицинских наук, почти 90 % населения России страдает кишечными дис-бактериозами. Широкое распространение дисбактериозов, в свою очередь, способствует развитию ряда других рецидивирующих инфекционных заболеваний, а также иммунодефицитов и аллергопатий. Нелеченные дисбактериозы сопровождаются морфологическими и функциональными нарушениями не только в пищеварительной, но и в иммунной, урогенитальной и дыхательной системах организма. Анализ данных литературы показал, что проблема кишечных инфекций и дисбактериозов не менее актуальна и в ветеринарии /7-12/. Патологии ЖКТ, клинически проявляющиеся диарейным синдромом, в общей структуре заболеваний
молодняка животных составляют 75%, падеж поросят от желудочно-кишечных болезней достигает 40-50% от числа родившихся. В промышленном птицеводстве России желудочно-кишечные болезни занимают второе место в общей структуре заболеваемости птиц/10/.
Положительные результаты в борьбе с кишечными инфекциями и дисбак-териозами могут быть достигнуты лишь при условии решения целого комплекса лечебно-профилактических, противоэпидемических и санитарно -гигиенических мероприятий. Особое внимание должно быть уделено совершенствованию имеющихся, разработке и внедрению новых эффективных медицинских препаратов /13/.
В настоящее время в практике лечения и профилактики острых кишечных инфекций и дисбактериозов все более широкое применение находят медицинские бактериальные препараты (пробиотики), созданные на основе культур различных микроорганизмов: кишечных палочек, бифидобактерий, лактобактерий и аэробных спорообразующих бактерий. В терапии острых кишечных инфекций наиболее распространены такие препараты как севакол, колифлорал, колибактерин, би-фидумбактерин, бификол, ацилакт, лактобактерин, бактисубтил, биоспорин, фло-нивин и др. Из медицинской практики известно, что некоторые из таких преп а-ратов обладают недостаточной эффективностью при определенных формах дисбактериозов, а также при тяжелых формах острых кишечных инфекций, вызва н-ных стафилококками, кандидами и сальмонеллами /13,14/. При применении про-биотиков на основе бацилл всегда следует помнить, что культуры некоторых штаммов в больших дозах способны вызывать у людей инфекционные процессы различной тяжести (до эндокардитов) и, что вопросы кинетики и длительной пер-систенции бацилл в организме человека до настоящего времени не в теоретическом, не в практическом плане не изучены (Kiss Т., Gratwohl A., Frei R., Oggioni M.R., Pozzi G., Valensin P.E., Thomas M., Mhitter H., Velasco E., Wallet F., Crunelle V. et all). Необходимо отметить, что существующие пробиотики не реализуют в своем составе всего комплекса механизма пробиотического действия, что снижает их эффективность.
Целью настоящей работы является разработка нового пробиотика на основе бактерий видов Lactobacillus plantarum и Bacillus subtilis.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:
- провести теоретические исследования по выбору перспективных микроорганизмов для включения в состав нового пробиотика;
- определить критерии оценки свойств бактериальных культур, использу е-мых для производства лечебно-профилактических препаратов;
всесторонне изучить культурально-морфологические, тинкториальные, фи-зиолого-биохимические и другие биологические свойства выбранных культур штаммов;
определить терапевтическую эффективность экспериментального образца препарата при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах у лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также его влияние на показатели неспециф и-ческой резистентности макроорганизма.
Научная новизна работы. Теоретически и экспериментально обоснованы и выбраны культуры штаммов для включения в состав нового пробиотика; определены оптимальные концентрации бактериальных культур компонентов в экспериментальном образце.
Отработана технология получения нового препарата, изучена его терапе в-тическая эффективность на лабораторных и сельскохозяйственных животных и представлены рекомендации по его дальнейшему использованию.
Основные научные положения и результаты исследований, выносимые на защиту:
Композиционный состав биопрепарата, включающий бактерии видов L. plantarum и В. subtilis в соотношении 1:2, пригоден для создания нового высокоэффективного пробиотика.
Комплексный биопрепарат может быть использован для регуляции микробиоценоза и неспецифической иммуностимуляции при лечении кишечных инфекций и дисбактериозов кишечника, в том числе отличающихся затяжным и хроническим течением.
Практическая ценность работы. Разработана технология получения нового препарата из глубинных культур L. plantarum и В. subtilis. По результатам исследований разработаны:
инструкция по приготовлению и контролю качества препарата субтилакт, утвержденная директором ВНИВИ Минсельхоза РФ и начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ;
сборник лабораторных методик по выделению, изучению биологических свойств и поддержанию культур лактобактерий, утвержденный директором ВНИВИ Минсельхоза РФ и начальником ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ ;
заявка на патент «Способ получения сухого препарата на основе бацилл и лактобацилл для лечения и профилактики диспепсии у крупного рогатого скота».
Исследования проведены в рамках плановой тематики научно-исследовательских работ Центра ВТП БЗ НИИМ (темы №№ О -99-94У-С, 0-99-42У-С, 0-01-35У-С, 0-01-39У-С) в период с 1999 по 2002 г.г.
Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста (с полуторным интервалом), иллюстрирована 8 рисунками, 21 таблицами, состоит из списка сокращений единиц и терминов, введения, обзора литературы, выбора направления исследований, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и заключения. Литературный указатель содержит 117 источников, включая работы отечественных и зарубежных авторов.
Автор глубоко признательна руководству ВНИВИ и Центра ВТП БЗ НИИМ МО РФ за предоставленную возможность обобщить результаты проведенных теоретических и экспериментальных исследований в виде кандидатской диссертации, научному руководителю доктору ветеринарных наук Садыкову Нариману Султановичу, научному консультанту кандидату медицинских наук Забокрицк о-му Александру Николаевичу, а также доктору биологических наук Васильеву Петру Геннадьевичу, оказавшим консультативную и практическую помощь при оформлении настоящей работы. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ВНИВИ и Центра ВТП БЗ за ценные советы и замечания, высказанные в процессе подготовки диссертации.
Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков
Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков Одним из основных механизмов лечебно-профилактического действия пробиотиков считают их способность к адгезии на поверхности эпителия кише ч-ника. В клинических испытаниях было установлено, что наиболее выраженный клинический эффект при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах оказ ы-вали штаммы с высокой адгезивной активностью /40-41/. Наибольшей адгезивностью обладают представители видов L. salivarum, L. plantarum L.casei. Следует иметь в виду, что адгезивность микроорганизмов зависит от многих условий. Она связана с происхождением штаммов и специфическими характеристиками микробиотопов организма. Значение адгезии в процессе колонизации отдельных микробиотопов неодинаково: в толстой кишке по сравнению с тонкой оно не столь в е-лико. По мнению некоторых авторов, колонизирующая способность микроорг а-низмов зависит не только от цитадгезии, то есть от их слипания с клетками слиз и-стых оболочек макроорганизма, но и от межбактериальной адгезии, то есть от их слипания между собой /42/. Адгезивность бактерий, на наш взгляд, является важным фактором в колонизации слизистых оболочек макроорганизма. При выборе штаммов для приготовления пробиотиков следует иметь в виду, что степень адг е-зии изменяется между штаммами одного вида, а также - при разных условиях культивирования /37/.
Другим важным аспектом эффективности пробиотиков является антагонистическая активность в отношении патогенных микроорганизмов. Антагонизм может быть обусловлен продукцией антибиотических веществ, бактериоцинов, органических кислот, перекиси водорода, лизоцима. У аэробных спорообразу ю-щих бактерий антимикробный эффект определяется продукцией антибиотиков. У бифидобактерий и лактобацилл, например, ингибирующий эффект связан, в основном, с продуцируемыми кислотами. В результате гомоферментативного м о-лочнокислого брожения образуется лактат, гетероферментативного - лактат, этанол и углекислый газ, а в процессе бифидоброжения в зависимости от состава питательного субстрата и штамма бифидобактерий идет восстановление пиров и-ноградной кислоты до молочной кислоты или происходит ее расщепление до уксусной и муравьиной кислот с образование этилововго спирта; чаще среди коне ч-ных продуктов присутствуют все перечисленные вещества в различных соотн о-шениях /21,43-47/.
В последние годы особое внимание уделяется веществам белковой природы, обладающим бактерицидными свойствами, которые образуются молочнокислыми бактериями в процессе их жизнедеятельности. Они названы бактериоцин а-ми /48/. Изучение условий образования бактериоцинов представителями бактерий рода Lactobacillus показало, что условия, способствующие накоплению клеточной массы, обеспечивают наибольшую продукцию этих соединений. На биосинтез бактериоцинов оказывают влияние условия культивирования продуцента: состав питательной среды, величина рН, температура, а также время инкубации продуцента. Штамм L. plantarum продуцирует плантарицин, обладающий широким спектром действия. Механизм биологического действия плантарицина связан с нарушением проницаемости цитоплазматических мембран. Сравнительно недавно установлено, что культура L. reuteri превращает глицерин в сильную антимикробную субстанцию - рейтерин. Изучение спектра его антагонистической активности показало, что он подавляет рост бактерий р о-дов Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Clostridium, Staphylococcus, грибов родов Candida, Torulopsis, Saccharomycoides, Aspergillus, Fuzarium . Несколько бактериоцинов обнаружено у L. acidophilus и L. fermentum. Продукция бактериоцинов обнаружена также у L. helveticus. Они названы лактоцин 27 и гельветицин I. Бактериоцины, продуцируемые L. brevis В37 и L. casei В80, получили названия соответственно бревицин 37 и казеицин 80. Они проявляют антагонистическую активность в отношении бактерий L. plantarum, Nocardia corallina, Streptococcus faecalis /43,48,49/. Культуры штаммов, входящие в состав пробиотиков, не оказывают антагонистического влияния на аутофлору. Тем самым препарат обеспечивает санацию желудочно-кишечного тракта и создает условия для бесконкурентного восстано в-ления нормального микробного пейзажа. Большенство авторов считают, что наиболее важной стороной положительного воздействия пробиотиков на организм хозяина является их способность м о-дифицировать метаболические процессы, которые происходят в кишечнике, поэтому пробиотики оказывают дезаллергизирующее и антитоксическое действие /13,37/.
Важной ролью пробиотиков является их способность повышать специфич е-скую и неспецифическую иммунную резистентность организма. Большинство авторов отмечает повышение фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов, их перекисных систем с увеличением фагоцитоза под воздействием различных видов лактобацилл и бифидобактерий (L. acidophilus, L. cassei, В. longum, В. bifi-dum и др.) Наиболее эффективными стимуляторами макрофагов были L. casei и L.acidophilus. Эти бактерии регулируют число В-лимфоцитов и гуморальный ответ, стимулируют секрецию иммуноглобулина А в кишечнике, необходимого для колониальной защиты слизистых оболочек. При воздействии на макрофаги и Т-лимфоциты 14 штаммами убитых бифидобактерий выявлено, что большинство бифидобактерий увеличило выработку цитокинов макрофагами и избирательно Т-клетками. Увеличение содержания в крови ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-10 отмечено под воздействием лакто- и бифидобактерий /42,44,50,51/.
Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus
Лактобациллы относятся к большой группе молочнокислых бактерий, широко распространенных в природе и способных расти в различных условиях о к-ружающей среды. Они встречаются в почве, сосредоточиваясь вокруг корневой системы, культурных и дикорастущих растений; в желудочно-кишечном тракте человека, теплокровных животных, птиц и насекомых /38,39,81 -84/.
В состав лактофлоры здорового человека входят различные виды лактобацилл: L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, L. salivarum, L. casei, L. brevis. Основную фенотипическую группу лактобацилл животных составляют термо - и стрептобактерии (до 90%), количество бета бактерий - незначительно (в среднем 10%)/10,39/.
Лактобациллы составляют группу факультативных анаэробных бактерий, которую в общих чертах можно охарактеризовать следующим образом: микроаэ-рофилы, неподвижные, грам положительные палочки, пигмент продуцируют редко, спор не образуют, не продуцируют каталазу, не восстанавливают нитраты в нитриты, цитохромная система отсутствует, обладают хорошо выраженной сах а-ролитической активностью /85/.
В каталоге Bergeys Manual of Systematic Bacteriology род Lactobacillus разделяется на 3 группы: 1-я группа - облигатные гомоферментативные лактобациллы, утилизирующие гексозы до молочной кислоты по гликолитическому пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, но неспособные сбраживать пентозы или глюконат; 2-я группа - факультативные гетероферментативные лактобациллы, способные сбраживать гексозы с образованием молочной кислоты по этому же гликолитическому пути, а некоторые виды при дефиците глюкозы - с образованием молочной, уксусной, муравьиной кислот, этанола, а также способны ферментировать пентозы с образованием молочной и уксусной кислот; 3-я группа - облигатные гетероферментативные лактобациллы, сбраживающие пентозы с образованием молочной и уксусной кислот и гексозы с образованием молочной, уксусной кислот и углек и-слого газа. Производственно ценными штаммами лактобактерий являются бактерии видов L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum и L. bulgaricus /39/. Выделение лактобактерий, учет и культивирование осуществляют на среде MRS или капустной среде с добавлением 4% измельченного мела в атмосфере, содержащей 90% водорода и 10% углекислого газа. При идентификации лактобацилл в настоящее время изучаются различные фенотипические, хемотаксономические и генетические характеристики, в части о-сти исследование содержания нуклеотидов Г+Ц в ДНК, гибридизация ДНК-ДНК, химический состав клеточных стенок, свободных внутриклеточных аминокислот и пептидов. Содержание нуклеотидов Г+Ц в ДНК бактерий рода Lactobacillus приведены в таблице 1. Кроме того, при характеристике и идентификации лактобактерий важное значение имеет изучение морфо-кул ьтуральных и физиолого-биохимических свойств /39,45,85,86/. Характерными биологическими особенностями представителей рода Bacillus являются палочковидная форма клеток, наличие эндоспор, образуемых в присутствии кислорода, высокая биологическая активность. Описание культуральных свойств бацилл нередко затруди єно в связи с их широкой биологической изменчивостью. Bonde (1975), выращивая бациллы на агаре с мясным экстрактом, на соевом и глюкозном агаре, наблюдал образование колоний следующих типов: плоские, тусклые, слегка морщинистые; округлые; поднимающиеся над агаром, маслянистые; морщинистые с приподнятой складчатостью; ри-зоидальные. Форма и консистенция колоний чаще всего определяется при выращивании бацилл на мясо-пептонном агаре с добавлением сусло-агара 1 : 1 (по Мишустину) /46/. На жидких питательных средах бактерии рода Bacillus образуют хлопьевидный, комковатый осадок, иногда растут в виде пленки. Появление пленки совпадает со спорообразованием. Отсутствие этого признака может быть использовано для выявления аспорогенных вариантов. Большинство бацилл подвижно, имеет перетрихиально расположенные жгутики. Для идентификации бацилл используют следующие основные тесты: образование аммиака, индола, сероводорода, ацетилметилкарбинола; гидролиз крахмала, мочевины, казеина, тирозина; редукция нитратов. Аэробные спорообразующие бактерии являются хемоорганогетеротрофами. Ruhland, Grohomann и некоторые другие авторы описали штаммы Bacillus руспоicus как факультативно хемолитоавтотрофные организмы, использующие при о т-сутствии органических веществ водород как источник энергии /87,88/.
Особенностью этих микроорганизмов является также продуцирование кат а-лазы, что наряду с аэробным образованием спор отличает бациллы от представ и-телей рода Clostridium. Клетки бацилл удлиненные, узкие (0,3-2,2)х(1,2-0,7) мкм; в основном подвижны. Жгутики обычно расположены латерально. Окраска по Граму положительна на ранних стадиях роста либо отрицательна. Представители этого рода - строгие аэробы или факультативные анаэробы. Виды рода Bacillus распределены в три морфологические группы в соответствии с формой споры и характером раздувания клеток при спорообразовании /45/.
Изучение биологических свойств культур штаммов микроорганизмов из музейной коллекции. Оценка возможности их использования для производства нового пробиотика
Определение антагонистической активности лактобактерий и бацилл осуществляли методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде [Егоров Н.С., 1986]. На агаровую пластину с питательной средой микробиологической петлей наносят культуру по всему диаметру чашки Петри. Культуру инк у-бировали при температуре (37+1)С в течение четырех суток. К выросшей культуре методом штриха высевали суточные тест-культуры, делая петлей полоски шириной 1мм в направлении от штриха роста культуры штамма, не касаясь ее, перпендикулярно. Посевы выдерживали в термостате при температуре (37+1)С в течение суток. Результат учитывали по величине зоны отсутствия роста тест-культур.
Бактериоциногенную активность лактобактерий определяли по методу перекрестной чувствительности [Филиппов В.П., Коваленко Н.К., 1989]. Выращивание штаммов проводили на питательной среде MRS. Через сутки на поверхность питательной среды наслаивали полужидкий агар с клетками испытуемых штаммов. Проявление бактерицидных зон учитывали через 48 часов выращивания при температуре 37С.
Адгезивные свойства изучаемых культур оценивали на модели формалин и-зированных эритроцитов человека 0/1 группы Rh (+) [Брилис В.И., 1986]. Эритроциты отмывали от консервирующего раствора в физиологическом растворе и го-товили взвесь в концентрации 1 10 кл. см" . Культуру штамма выращивали на среде MRS в течение двух суток, затем готовили культуру микроорганизмов в концентрации 2 109кл. см"3. Для постановки опыта на предметное стекло наносили по одной капле взвеси эритроцитов и изучаемых бактерий. Полученную смесь инкубировали во влажной камере при температуре 37С в течение 30 минут, затем препарат высушивали, фиксировали, окрашивали по Граму и микроскопировали. Адгезивные свойства оценивали с помощью среднего показателя адгезии. Под СПА понимают среднее количество микробов, прикрепившихся к одному эритр о-циту, при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения. Лизоцимсинтезирующую активность определяли методом агаровых пластинок [Бухарин О.В., 1999]. В качестве индикаторной культуры использовали М. lueus 109. Учет зон лизиса М. luteus проводили на вторые сутки роста исследуемых культур бактерий. К слабым продуцентам лизоцима относили штаммы с зоной лизиса до 2 мм, к средним - от 3 до 4 мм и сильным - более 5 мм.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам провод и-ли методом серийных разведений в жидкой среде. Бульон Хоттингера (или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма) разливали по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовили раствор антибиотика, содержащий 100 ЕД в 1 мл, и добавляли 2 мл этого раствора в первую пробирку. После тщательного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой переносили 2 мл из этой пробирки в следующую и т. д. до девятой пробирки, из которой 2 мл выливали. Десятая пробирка, не содержащая антибиотика, служила контролем роста культуры.
Для оценки состояния противомикробной защиты организма важно исследование факторов неспецифической защиты [Г. Фримель, Земсков В.М.]: - фагоцитарной активности фагоцитов; - уровня комплемента и лизоцима в сыворотке крови; - бактерицидной активности сыворотки крови; - концентрации циркулирующих иммунных комплексов. Кроме того, определяли общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови. При проведении таких исследований необходимо учитывать взаимное потенцирующее влияние разных факторов. Фагоцитарную активность нейтрофилов крови изучали путем определения интенсивности поглощения инертных частиц латекса фагоцитами [Кост Е.А., 1989]. В стерильную центрифужную пробирку наливали 0,2 см 2% раствора цитрата натрия, прибавляют 0,1 см"3 исследуемой крови и 0,05 см взвеси частиц латекса, содержащей по оптическому стандарту мутности 25 млн. частиц /500 млн. частиц в 1 см3/. Пробирку с приготовленной смесью осторожно встряхивали и помещали на 30 мин. в термостат. По истечении указанного срока смесь цен 40 трифугировали и пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром отсас ы-вали вначале верхний слой, затем очень осторожно снимали средний слой, делали мазки и окрашивали их методом Романовского-Гимза. При микроскопии мазка подсчитывали число фагоцитировавших фагоцитов из общего числа (фагоцитарный индекс). Для получения достоверных результатов количество должно быть не менее 100. Полученный результат выражали в процентах. Функциональную активность фагоцитов определяли в НСТ -тесте [Новикова Н.П., 1992]. В лунку плоского планшета вносили по 0,10 см3 клеточной суспензии и 0,05 см паранитросинего тетразолия в концентрации 2 мг см . После внесения всех реагентов смесь инкубировали при температуре 37 С в течение 20 минут, промывали забуференным физиологическим раствором, дважды абсолютным эта-нолом, затем клетки разрушали внесением в каждую лунку 0,14 см раствора ди-метилсульфоксида. Полученные растворы фотометрировали на многоканальном спектрофотометре при длине волны 620 нм. Данные представляли в единицах оптической плотности. Содержание комплемента в сыворотке крови определяли по его гемолитической активности в отношении эритроцитов барана, обработанных гемолизин а-ми [КониковА.П., 1987]: Титр комплемента выражали в минимальном количестве сыворотки, которое в нормальных условиях лизирует 50% оптимально сенсиб и-лизированных гемолизинами эритроцитов. Сыворотку крови, в которой определяли титр комплемента, разводили фосфатным буфером в 10 раз, разливали в 10 пробирок от 0,05 до 0,5 см3 с разницей в объеме между отдельными дозами 0,05 см3. В каждую пробирку приливали фосфатный буфер с таким расчетом, чтобы общий объем жидкости во всех пробирках ряда был одинаковым (1,5 см ). К разведениям сыворотки добавляли 1,5 см гемолитической системы.
Изучение безопасности экспериментального образца бактерийного препарата на основе культур штаммов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ
Изучали острую и хроническую токсичность трех серий экспериментального образца препарата на основе культур штаммов В. subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ. Опыты проводили на белых мышах массой 12-14 г и морских свинках массой 230-250 г в соответствии с Санитарными правилами СП 3.3.2.561-96 /116, 117/.
Для определения острой токсичности животным вводили три серии экспериментального образца препарата внутрибрюшинно и перорально белым мышам в концентрации 4 104 и 4«105 клеток, морским свинкам - 8 105 и 8 106клеток. Контрольным животным вводили физиологический раствор. За подопытными животными наблюдали в течение 10 суток. После внутрибрюшинного и перорально-го введения изучаемого образца выживаемость лабораторных животных состав и-ла 100%, белые мыши прибавляли в весе от 3,0 до 3,5 г, морские свинки - от 9 до Иг. Материалы для проведения гистологического исследования изучали на 1 и 7 сути наблюдения (по 7 животных на каждый срок).
При гистологическом изучении воздействия препарата все подопытные животные клинически были здоровыми, при макроскопическом изучении внутренних органов признаков патологии не обнаружено. При гистологическом исследовании обращали внимание на наличие изменений в системе микроциркуляции; дистрофических и воспалительных изменений во внутренних ор ганах. Через 1 сутки после внутри брюшинного введения экспериментального образца препарата у одной морской свинки отмечено небольшое истощение коры тимуса и усиление в ней макрофагальной реакции. Других нарушений во внутренних органах у по д-опытных животных не обнаружено. Через 7 суток морфологические изменения зарегистрированы только у одного животного (белой мыши) в печени, где внутри долек и в междольковой ткани наблюдали образование мелких лимфоидных и н-фильтратов. Других структурных изменений не отмечено.
Через 1 сутки после перорального введения препарата при микроскопическом изучении гистологических препаратов у одного животного (белой мыши) отмечена усиленная макрофагальная реакция в мозговом слое тимуса. Других нарушений во внутренних органах не установлено. Отсутствовали также и местные изменения в области глотки. Через 7 суток у животных при гистологическом и с-следовани нарушений не выявлено.
Хроническую токсичность определяли при пероральном введении. Образцы вводили в концентрациях, указанных выше, в течение 10 суток. Наблюдение за животными проводили в течение периода введения экспериментальных образцов и последующих 7 суток. При этом ежедневно регистрировали массу лаборато р-ных животных. В период всего срока наблюдения не отмечали каких-либо клинических симптомов интоксикации, масса подопытных животных увеличивалась до 3,7 граммов у мышей и до 12 г у морских свинок. На следующие сутки после п о-следнего введения экспериментального образца препарата и по окончании срока наблюдения по 7 животных использовали для проведения гистологического исследования.
Через 1 сутки после 10-кратного перорального введения экспериментального образца лишь у одного животного(белой мыши) в печени выявлена спонтанная патология паразитарного характера, которая отмечалась и в группе контрольных животных. Никаких других признаков структурных нарушений и реактивных процессов не установлено. Не найдены изменения и в месте введения культуры (корень языка, глотка). Через 7 суток наблюдения после курса применения препарата каких-либо признаков патологии во внутренних органах не обнаружено.
Таким образом, на основании выше изложенного материала можно сделать вывод о том, что бактериальные культуры B.subtilis 3 и L. plantarum 8Р-АЗ в составе экспериментального образца препарата не оказывали какого-либо токсического действия на внутренние органы подопытных лабораторных животных.
Следует подчеркнуть, что испытанные культуры не вызывали никаких пр и-знаков патологического воздействия на организм лабораторных животных при различных способах введения и в максимальных дозах.
Влияние субтилакта на микробиоценоз кишечника птиц и телят Формирование микробиоценоза кишечника птицы изучали на цыплятах-бройлерах на птицефабрике «Среднеуральская» Свердловской области. Для исследования кишечного биоценоза делали отбор фекалий из содержимого толстого отдела кишечника после забоя пяти голов птицы через день, начиная с суточного до 30-суточного возраста. Установлено, что кинетика формирования биоценоза кишечника промышленной птицы характеризуется замедлением сроков и интенсивности заселения кишечника лактобациллами и бифидобактериями. Не выявлено достоверных различий в кинетике формирования популяции энтеробактерий. Кишечник цыплят с первых дней жизни активно колонизируют стафилококки, бактерии рода Proteus, Candida.
При изучении влияния субтилакта на микробиоценоз кишечника птиц проводили бактериологическое обследование фекальной микрофлоры у цыплят 5, 10, 20, 30- сутчного возраста, получавших субтилакт в дозе 6,7 104клеток 2 раза в день в течение 7 суток. Параллельная группа цыплят в контрольных батареях пробиотик не получала. Цыплята опытной и контрольной групп были вакцинированы против в и-русных инфекций. Результаты исследований представлены в таблице 29.
При применении субтилакта происходило быстрое нарастание численности популяций лакто- и бифидобактерий. У контрольных цыплят количество данных бактерий увеличивалось, но при этом оставалось достоверно ниже, чем у цыплят опытных групп. Высокий популяционный уровень лакто- и бифидобактерий сохранялся у цыплят после отмены препарата. Применение пробиотика не вызывало существенной разницы в кинетике формирования энтеробактерий, способствов а-ло понижению концентрации бактерий родов Proteus и Candida, увеличению п о-пуляции энтерококков. Обследование микрофлоры содержимого толстого отдела кишечника опытных цыплят на наличие стафилококковой микрофлоры выявило достоверное замедление скорости ее роста. Низкий уровень данной микрофлоры сохранялся после отмены препарата. При изучении влияния субтилакта на формирование микробиоценоза кишечника цыплят оределили, что среднесуточный привес в опытной группе составлял - 34,0 г., в - контрольной - 30,1г., выживаемость цыплят составляла 91,2%, в контрольной группе - 78,6%.
